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문제 정의
- 4B). Wound healing assay를 통하여 AGNE이 유방암 세포주에서 세포 증식 억제에 미치는 영향을 확인하고자 실험을 진행하였다. Vector control 세포주와 YAP constitutive active form인 stable 세포주를 24시간 배양한 6 well plate에 scratcher를 이용하여 scratch를 낸 후 AGNE를 10 ㎍/㎖ 처리 후 8시간, 18시간, 24시간 후 wound area를 측정하였다.
- 있다18-24). 본 연구에서는 이러한 효능이 보고된 AGN Extract (AGNE)가 Hippo-YAP pathway에 어떠한 영향을 미치는지 연구하였고, AGNE가 Lats1/2를 활성화시킴으로써 YAP 활성을 감소시키는 것을 확인하여 보고하는 바이다.
제안 방법
- 실험을 진행하였다. 12시간 incubation 후, Gal4-TEAD4, 5 x upstream activation sequence (UAS)-luciferase reporter, Renilla, Flag-YAP2를 과발현하였다. 6시간 incubation 후, 배지를 바꾸고 AGNE를 농도별 (50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖)로 배지에 처리하여 12시간 incubation하고 well당 150 ㎕의 chemiluminescent lysis buffer (1.
- 12시간 incubation 후, Gal4-TEAD4, 5 x upstream activation sequence (UAS)-luciferase reporter, Renilla, Flag-YAP2를 과발현하였다. 6시간 incubation 후, 배지를 바꾸고 AGNE를 농도별 (50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖)로 배지에 처리하여 12시간 incubation하고 well당 150 ㎕의 chemiluminescent lysis buffer (1.7%의 1 M KH2PO4, 18.3%의 1 M K2HPO4, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF))를 혼합하여 세포를 lysis하였다. Luciferase activity는 Dual-Glo luciferase assay system (E2940)을 Promega (Madison, WI, USA)로부터 구입하여 제조사의 프로토콜을 따라 측정하였다.
- LATS1/2에 의해 YAP이 인산화가 될 경우 YAPe 불활성화 상태가 되어 TEAD 전사인자와 상호작용하지 못하고 세포질에 남아 14-3-3 단백질과 결합되거나 유비퀴틴화되어 프로테아좀분해가 된다. AGNE가 Hippo signaling pathway의 중요한 전사 보조인자인 YAP의 인산화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 AGNE 50 ㎍/㎖과 100 ㎍/㎖을 시간 별로 처리한 후 phos-tag gel assay와 phospho-YAP(S127)에 대한 western blot을 시행하였다. 조사 결과 시간 별로 AGNE를 처리하였을 경우 YAP의 인산화가 눈에 띄게 시간 의존적으로 증가하였다(Fig 2B).
- AGNE가 세포 생존율에 어떤 영향을 미치는지 살펴보고자 EZ-Cytox를 이용하여 세포 생존율을 조사하였다. 그 결과, 세포 생존율이 100 ㎍/㎖에서 미약하게 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
- 본연구에서는 AGNE가 YAP의 인산화를 잘 유도함으로써 유방암세포의 성장과 이동을 억제하는 능력이 있음을 확인하였다. AGNE는 YAP의 상위 신호전달 경로인 Hippo와 LATS1/2를 인산화시킴으로써 활성화시켰고 이어서 YAP/TAZ를 인산화시켰다. 이러한 결과에서 AGNE는 전형적인 Hippo signaling을 활성화시키는 효능이 있으며, 이를 통한 유방암세포의 성장과 이동을 억제함으로써, 유방암의 발달과 성장을 억제시킬 수 있는 잠재력이 있음을 확인하였다.
- 2B). AGNE에 의한 YAP의 인산화가 전사인자인 TEAD의 결합에 미치는 영향을 알아보기 위해 상호결합을 확인한 결과 AGNE를 처리함에 따라 YAP 과 TEAD의 복합체 형성이 저해되었으며(Fig. 2C) 이러한 복합체 형성의 감소가 전사활성 및 표적유전자의 발현에 어떠한 영항을 미치는지 알아보기 위해 lucifease reporter assay (Fig. 2D)와 RT-qPCR (Fig. 2E) 수행하였다. 그 결과 AGNE에 의해 감소된 YAP에 의존적인 TEAD 전사활성은 YAP과 TEAD의 표적유전자인 CTGF와 Cyr61의 mRNA을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
- HEK293A 세포를 90 ㎜ culture dish에 8 X 105 cells/plate의 개수로 분주하여 실험을 진행하였다. 다음날, 배지에 50 ㎍/㎖의 AGNE를 6시간 처리하고 mild lysis buffer (10 mM Tris pH 7.
- HEK293T 세포를 사용하여 retrovirus를 만든 후에 5 ㎍/㎖ 의 polybrene (Millipore Co., Beillelica, MA, USA)를 이용하여 MDA-MB-231 세포 stable cell line을 제작하였다25). 후에, 2 ㎎/ ㎖의 G418을 이용하여 저항성 있는 세포만을 선별하였다.
- HPLC-UV 분석을 통해 AGNE 추출물의 신규 구성 성분을 알아보기 위해 HPLC를 사용하였다. AGNE을 ethanol과 distilled water에 각각 환류한 추출물의 분석 결과, ethanol에 환류한 AGNE 추출물에서 Decursin이 retention time 38.
- Hippo signaling pathway가 억제되면 YAP이 활성화되어 TEAD 전사인자와 결합함으로써 세포 성장 및 증식, 종양의 성장조절에 관여하게 되는데 AGNE가 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주에서 증식을 억제시키는지 조사하였다. 그 결과, AGNE의 농도가 높아질수록 MDA-MB-231 세포주에서 세포 증식이 억제되는 것을 관찰하였다(Fig.
- RNA의 농도는 NanoDrop 분광광도계를 이용하여 측정한 후, cDNA는 reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA), random hexamers (Takara Bio Inc, Shiga, Japan)과 합성에 필요한 시약을 포함하여 total RNA의 1 ㎍의 양을 계산하여 cDNA를 합성하였고, specific primer를 이용하여 real time PCR 방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다. Real time PCRe SYBR Green PCR master mix (KAPA Biosystem, Woburn, MA, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜을 따라 실험을 진행하였다.
- RNA의 농도는 NanoDrop 분광광도계를 이용하여 측정한 후, cDNA는 reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA), random hexamers (Takara Bio Inc, Shiga, Japan)과 합성에 필요한 시약을 포함하여 total RNA의 1 ㎍의 양을 계산하여 cDNA를 합성하였고, specific primer를 이용하여 real time PCR 방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다. Real time PCRe SYBR Green PCR master mix (KAPA Biosystem, Woburn, MA, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜을 따라 실험을 진행하였다. PCR에 사용된 primer는 다음과 같다.
- Total RNA는 RNeasy Mini Kit (Quiagen, Germantown, MD, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였다. RNA의 농도는 NanoDrop 분광광도계를 이용하여 측정한 후, cDNA는 reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA), random hexamers (Takara Bio Inc, Shiga, Japan)과 합성에 필요한 시약을 포함하여 total RNA의 1 ㎍의 양을 계산하여 cDNA를 합성하였고, specific primer를 이용하여 real time PCR 방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다.
- Wound healing assay를 통하여 AGNE이 유방암 세포주에서 세포 증식 억제에 미치는 영향을 확인하고자 실험을 진행하였다. Vector control 세포주와 YAP constitutive active form인 stable 세포주를 24시간 배양한 6 well plate에 scratcher를 이용하여 scratch를 낸 후 AGNE를 10 ㎍/㎖ 처리 후 8시간, 18시간, 24시간 후 wound area를 측정하였다. 그 결과 control vector 세포에 AGNE를 처리한 결과 wound area의 회복이 느린 반면, constitutive active 세포에서는 AGNE의 처리가 wound area의 회복을 억제시키지 못하였음을 확인하였다(Fig.
- 이전의 연구들에 따르면 AGNE는 항염증, 항산화 효능 뿐만 아니라 항암효과가 보고된 AGNE를 포함한 다양한 천연물이 최근 암발생 억제 경로로 주목받고 있는 Hippo pathway에 미치는 영향을 알아보기 위해 본 연구진은 YAP의 인산화를 측정하는 phos-tag gel mobility shift assay 수행하였다. 그 결과 AGNE가 YAP의 인산화를 가장 우수하게 유도하였기에 다음의 실험들을 진행하였다.
- 후에 primary antibody와 함께 4℃ rocker에서 overnight하여 반응시켰다. 다음날 TBS-T로 3회 세척 한 후 HRP가 결합된 secondary antibodies와 상온에서 1시간 반응을 시키고, TBS-T로 3회 세척한 후 ECL solution을 이용하여 band를 확인하였다.
- 다음날, 농도별로 AGNE를 처리하고 반응시켜 day1과 day5를 SRB assay를 통해 흡광도를 측정함으로써 세포증식을 관찰하였다. 실험 방법을 간략히 기술하면 다음과 같다.
- 그 결과 AGNE에 의해 감소된 YAP에 의존적인 TEAD 전사활성은 YAP과 TEAD의 표적유전자인 CTGF와 Cyr61의 mRNA을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로 AGNE이 Hippo pathway의 핵심조절자인 MST1/2 와 LATS1/2에 미치는 영향을 확인하고자 LATS1/2와 MST1/2이 knockout된 세포주에서 CTGF와 Cyr61 mRNA양을 확인하였다 (Fig. 3A and B). YAP 인산화를 직접 조절하는 LATS1/2를 발현하는 WT 세포에서는 AGNE에 의존적으로 YAP-TEAD 표적 유전자의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- Lysis된 세포들을 4℃에서 13, 000 rpm으로 원심분리한 후에 상층액만 normal IgG (sc-2027) 항체와 anti-YAP/TAZ (8418S) (Beverly, MA, USA) 항체를 넣어 2시간 동안 4℃에서 incubation시킨 후 magnetic bead를 넣어 1시간 동안 4℃에서 incubation하고 샘플들을 mild lysis buffer로 3회 세척 하였다. 다음으로 sample buffer를 넣고 100℃ heat block에서 5분간 변성시키고 western blot을 통해 band를 분석하였다.
- 따라서 AGNE가 YAP을 인산화시키고 YAP-TEAD 상호작용을 방해하며 YAP 활성을 억제시켜 YAP target gene인 CTGF와 CYR61의 mRNA level 감소를 유도하였다.
- , Santa Clara, CA, USA) 칼럼을 사용하였다. 분석에 사용된 이동상으로 용매A (0.1% phosphoric acid)와 용매B (acetonitrile) 을 사용하여 0.8 ㎖/min의 유속으로 시료 10 ㎕를 주입하여 분석하였으며, 분리하는 동안 칼럼 온도는 35℃로 유지되었고 용출액의 광학 밀도를 330 ㎚에서 관찰하였다.
- 모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건의 습윤 incubator에서 배양하였다. 세포 생존율 측정은 EZ-Cytox를 이용하여 제조사의 프로토콜을 따라 450 ㎚에서 측정하였다. 실험 과정을 간단히 기술하자면 blank는 DMEM 200 ㎕와 EZ-Cytox 10 ㎕를 섞어 사용하였다.
- 실험 과정을 간단히 기술하자면 blank는 DMEM 200 ㎕와 EZ-Cytox 10 ㎕를 섞어 사용하였다. 세포는 96 well plate에 1 X 106 cells/plate 세포의 수로 분주하고 다양한 농도의 AGNE를 처리하여 12시간 동안 CO2 incubator에서 반응시킨 후 microplate leader기로 450 ㎚ 흡광도에서 측정함으로써 세포 생존율을 관찰하였다.
- 이 외에도 휘발성 방향 성분인 nonane, α -pinene, camphene, 2-methyloctane, lomatin, 2-furanmethanol, seselin, guaiacol, butyrolactone 등이 함유되어 있다16, 17). 이전의 연구들에 따르면 AGNE는 항염증, 항산화 효능 뿐만 아니라 항암효과가 보고된 AGNE를 포함한 다양한 천연물이 최근 암발생 억제 경로로 주목받고 있는 Hippo pathway에 미치는 영향을 알아보기 위해 본 연구진은 YAP의 인산화를 측정하는 phos-tag gel mobility shift assay 수행하였다. 그 결과 AGNE가 YAP의 인산화를 가장 우수하게 유도하였기에 다음의 실험들을 진행하였다.
- 위해 PBS로 plate를 세척 해주었다. 이후 배지에 10 ㎍/㎖ 의 AGNE를 처리하여 8시간마다 세포의 이동능력을 phase contrast microscope (OLYMPUS 1X71 DP controller, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였으며, 사진 이미지 프로세서 소프트웨어인 ImageJ로 분석하여 이동거리를 측정하였다.
대상 데이터
- (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-TEF-1 (No. 610922)와 anti-MST1 (No. 611052)는 BD Transduction Laboratories (Lexington, KY, USA)에서 구입하였다. Anti-Vinculin (V9131)은 Sigma-Aldrich (St.
- 611052)는 BD Transduction Laboratories (Lexington, KY, USA)에서 구입하였다. Anti-Vinculin (V9131)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Immunoprecipitation의 control에 사용한 normal rabbit IgG는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Immunoprecipitation의 control에 사용한 normal rabbit IgG는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 이차 항체인 rabbit IgG HRP (NA934)와 mouse IgG HRP(NA931)는 GE Healthcare에서 구입하였다.
- 반응이 끝나면 microplate leader기로 450 ㎚에서 흡광도를 측정한다. 모든 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)으로부터 구매하였다.
- 본 실험에 사용한 인간배아신장 (HEK) 세포인 HEK293A, HEK293T, MST1/2 DKO HEK293A, LATS1/2 DKO HEK293A 세포주들은 DMEM에 10% FBS, 50 units의 penicillin과 50 ㎍/ ㎖의 streptomycin를 첨가하여 배양하였고, 인간유방암 MDA-MB-231 세포는 RPMI에 10% FBS, 50 units의 penicillin과 50 ㎍/㎖의 streptomycin를 첨가하여 배양하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건의 습윤 incubator에서 배양하였다.
- (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 이차 항체인 rabbit IgG HRP (NA934)와 mouse IgG HRP(NA931)는 GE Healthcare에서 구입하였다.
- 05 ㎎/g 을 차지하는 것을 확인하였다. 이후 실험은 DW에 비해 값이 높은 AGNE ethanol 추출물을 사용하였다(Fig. 1A). 다음은 Decursin의 화학 구조를 나타내고 있다(Fig.
- 일차 항체인 Anti-YAP (14074), YAP/TAZ (8414), phospho-YAP (4911), LATS1 (3477), LATS2 (5888), MST2 (3952)은 Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-TEF-1 (No.
- 참당귀 (Angelica gigas Nakai)는 국립원예특작과학원(NIHHS)으로부터 제공받았다. 동결건조된Angelica gigas 10 ㎎을 1 ㎖의 에탄올에 현탁 한 후 0.
- , Beillelica, MA, USA)를 이용하여 MDA-MB-231 세포 stable cell line을 제작하였다25). 후에, 2 ㎎/ ㎖의 G418을 이용하여 저항성 있는 세포만을 선별하였다.
데이터처리
- HEK293A cells were treated with AGNE as indicated concentrations (50 and 100 ㎍/ ㎖). one-way analysis of variance (ANOVA) were performed to calculate a p-value using GraphPad software (La Jolla, CA, USA) and considered at *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001. (E) AGNE decreases mRNA level of YAP target genes (CTGF, CYR61).
이론/모형
- High performance liquid chromatography (HPLC) 기기는 Agilent1260 Infinity II with a A ZORBAX Eclipase Plus C18 (4.6 x 250 ㎜, 5 ㎛, 95 Å, Agilent, USA) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) 칼럼을 사용하였다. 분석에 사용된 이동상으로 용매A (0.
- 3%의 1 M K2HPO4, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF))를 혼합하여 세포를 lysis하였다. Luciferase activity는 Dual-Glo luciferase assay system (E2940)을 Promega (Madison, WI, USA)로부터 구입하여 제조사의 프로토콜을 따라 측정하였다.
성능/효과
- 위해 HPLC를 사용하였다. AGNE을 ethanol과 distilled water에 각각 환류한 추출물의 분석 결과, ethanol에 환류한 AGNE 추출물에서 Decursin이 retention time 38.623분에 검출이 되었고, 또한 AGNE ethanol 추출물에서 Decursin이 28.05 ㎎/g 을 차지하는 것을 확인하였다. 이후 실험은 DW에 비해 값이 높은 AGNE ethanol 추출물을 사용하였다(Fig.
- 3A and B). YAP 인산화를 직접 조절하는 LATS1/2를 발현하는 WT 세포에서는 AGNE에 의존적으로 YAP-TEAD 표적 유전자의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 LATS1/2 KO 세포에서는 AGNE가 YAP-TEAD 표적유전자의 발현을 저해하지 못하였다 (Fig.
- 조사 결과 시간 별로 AGNE를 처리하였을 경우 YAP의 인산화가 눈에 띄게 시간 의존적으로 증가하였다(Fig 2B). YAPe 전사인자로 알려진 TEAD와 복합체를 형성함으로써 표적유전자의 발현을 유도하게 되는데 AGNE가 YAP과 TEAD의 상호작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 immunoprecipitation (IP)실험을 수행한 결과, AGNE가 YAP과 TEAD의 복합체 형성을 저해하는 것을 확인하였다(Fig. 2C). 또한 YAP과 결합하여 이들의 oncogenic 효능을 유도하는 것으로 잘 알려진 TEAD의 전사 활성을 측정하고자 luciferase assay를 진행하였고 AGNE 50 ㎍/㎖가 100 ㎍/㎖을 12시간 처리한 결과, TEAD의 전사 활성이 두드러지게 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
- 1). YAP의 인산화를 측정하는 phos-tag gel mobility shift assay을 활용하여 ANGE가 Hippo-YAP signaling을 조절하는 능력의 정도를 조사하기 위해 HEK293A에 AGNE를 처리한 후 YAP 의 인산화를 확인한 결과 50 μg/ml과 100 μg/ml의 농도에서 YAP의 인산화가 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 2B). AGNE에 의한 YAP의 인산화가 전사인자인 TEAD의 결합에 미치는 영향을 알아보기 위해 상호결합을 확인한 결과 AGNE를 처리함에 따라 YAP 과 TEAD의 복합체 형성이 저해되었으며(Fig.
- 이로써 stable 세포주가 구축됨을 의미한다. 구축한 stable 세포주에 AGNE 50 ㎍/㎖을 처리함에 따라 vector control 세포주에서 YAP dependent gene (CTGF, Cyr61)의 mRNA level이 현저하게 감소하였고 반면에 YAP constitutive active form의 세포주에서는 mRNA level이 덜 감소되었다(Fig. 4B). Wound healing assay를 통하여 AGNE이 유방암 세포주에서 세포 증식 억제에 미치는 영향을 확인하고자 실험을 진행하였다.
- 2E) 수행하였다. 그 결과 AGNE에 의해 감소된 YAP에 의존적인 TEAD 전사활성은 YAP과 TEAD의 표적유전자인 CTGF와 Cyr61의 mRNA을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로 AGNE이 Hippo pathway의 핵심조절자인 MST1/2 와 LATS1/2에 미치는 영향을 확인하고자 LATS1/2와 MST1/2이 knockout된 세포주에서 CTGF와 Cyr61 mRNA양을 확인하였다 (Fig.
- Vector control 세포주와 YAP constitutive active form인 stable 세포주를 24시간 배양한 6 well plate에 scratcher를 이용하여 scratch를 낸 후 AGNE를 10 ㎍/㎖ 처리 후 8시간, 18시간, 24시간 후 wound area를 측정하였다. 그 결과 control vector 세포에 AGNE를 처리한 결과 wound area의 회복이 느린 반면, constitutive active 세포에서는 AGNE의 처리가 wound area의 회복을 억제시키지 못하였음을 확인하였다(Fig. 4D). 따라서 본 실험에서 수행한 연구결과를 통하여 AGNE가 MDA-MB-231 유방암 세포주의 세포 이동을 억제하고 있음을 확인하였다.
- 증식을 억제시키는지 조사하였다. 그 결과, AGNE의 농도가 높아질수록 MDA-MB-231 세포주에서 세포 증식이 억제되는 것을 관찰하였다(Fig. 4A). 다음으로 virus infection을 통해 YAP-TEAD fusion 단백질을 안정적으로 발현시키는 MDA-MB-231 세포주를 만들어 western blot으로 발현을 확인하였고 qRT-PCR 분석으로 활성화 YAP-TEAD를 발현하는 세포주에서 YAP-TEAD의 표적유전자의 mRNA가 증가함을 확인하였다 (Fig.
- 이용하여 세포 생존율을 조사하였다. 그 결과, 세포 생존율이 100 ㎍/㎖에서 미약하게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 2A). Hippo signaling pathway가 활성화되면 상위 조절인자들인 MST1/2와 LATS1/2 kinases 또한 활성화가 되면서 YAP을 인산화시킨다.
- 이는 AGNE이 YAP의 인산화 및 활성을 조절하는 능력이 LATS1/2 활성에 의존적인 경로를 따르고 있음을 시사한다. 다음으로 LATS1/2 상위 조절자인 MST1/2 WT 세포주와 KO 세포주를 사용하여 AGNE에 의한 YAP-TEAD 표적유전자 발현을 확인한 결과, MST1/2 WT과 KO 세포주에서 YAP-TEAD 표적 유전자의 발현이 비슷하게 감소하였다 (Fig. 3B). 이러한 결과는 AGNE가 MST1/2 비의존적으로 YAP-TEAD 전사활성을 저해하고 표적 유전자의 발현을 감소시키는 것을 보여주었다.
- 4A). 다음으로 virus infection을 통해 YAP-TEAD fusion 단백질을 안정적으로 발현시키는 MDA-MB-231 세포주를 만들어 western blot으로 발현을 확인하였고 qRT-PCR 분석으로 활성화 YAP-TEAD를 발현하는 세포주에서 YAP-TEAD의 표적유전자의 mRNA가 증가함을 확인하였다 (Fig. 4B). 이로써 stable 세포주가 구축됨을 의미한다.
- 4D). 따라서 본 실험에서 수행한 연구결과를 통하여 AGNE가 MDA-MB-231 유방암 세포주의 세포 이동을 억제하고 있음을 확인하였다.
- 2C). 또한 YAP과 결합하여 이들의 oncogenic 효능을 유도하는 것으로 잘 알려진 TEAD의 전사 활성을 측정하고자 luciferase assay를 진행하였고 AGNE 50 ㎍/㎖가 100 ㎍/㎖을 12시간 처리한 결과, TEAD의 전사 활성이 두드러지게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 2D).
- 4C). 또한 같은 유방암세포주에서 AGNE의 처리는 wound area의 회복을 저해시킨 반며, constitutive active한 YAP-TEAD fusion 단백질을 발현시킨 유방암 세포주에서는 AGNE에 의한 wound area의 회복 저해 능력이 감소하였다 (Fig 4D). 이렇게 ANGE가 MDA-MB-231 세포의 이동을 억제하는 능력이 constitutively active한 YAP을 발현시켰을 경우 감소한 것은 ANGE가 YAP의 인산화와 불활성화를 유도하여 MDA-MB-231 세포의 증식과 이동을 억제하였음을 나타낸다.
- 마지막으로 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 AGNE는 YAP/TAZ dependent gene인 CTGF와 CYR61의 발현을 현저히 감소시킨 반면, LATS1/2에 영향을 받지 않는 YAP-TEAD fusion 단백질을 발현시킨 유방암 세포주에서는 CTGF와 CYR61의 발현억제능력이 훨씬 미약했다 (Fig. 4C). 또한 같은 유방암세포주에서 AGNE의 처리는 wound area의 회복을 저해시킨 반며, constitutive active한 YAP-TEAD fusion 단백질을 발현시킨 유방암 세포주에서는 AGNE에 의한 wound area의 회복 저해 능력이 감소하였다 (Fig 4D).
- 먼저 AGNE이 세포생존율에 미치는 영향을 조사한 결과 100 μg/ml 이상의 농도에서 세포생존율이 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 1). YAP의 인산화를 측정하는 phos-tag gel mobility shift assay을 활용하여 ANGE가 Hippo-YAP signaling을 조절하는 능력의 정도를 조사하기 위해 HEK293A에 AGNE를 처리한 후 YAP 의 인산화를 확인한 결과 50 μg/ml과 100 μg/ml의 농도에서 YAP의 인산화가 증가되는 것을 확인하였다(Fig.
- 본 연구에서는 AGNE가 core kinase인 MST1/2와 LATS1/2에 어떤 영향을 미치는지 살펴보고자 wild type (WT)과 MST1/2 double-knockout (DKO)세포에 AGNE를 12시간 처리하여 YAP dependent gene의 mRNA level을 조사하였고 그 결과 MST1/2 WT과 DKO 세포에서 모두 CTGF와 CYR61의 mRNA level이 감소함을 관찰하였다(Fig. 3A). 반면 LATS1/2 DKO 세포에서는 WT 세포에 비해 이들 유전자의 mRNA level을 감소시키지 않았으며, 두 세포를 비교하였을 경우 발현양의 차이가 유의성 있게 두드러졌다(Fig.
- 세포의 증식과 암의 진행에 있어서 최근 주목받고 있는 세포 내 신호전달과정 중 하나가 Hippo-YAP signaling 경로이다. 본연구에서는 AGNE가 YAP의 인산화를 잘 유도함으로써 유방암세포의 성장과 이동을 억제하는 능력이 있음을 확인하였다. AGNE는 YAP의 상위 신호전달 경로인 Hippo와 LATS1/2를 인산화시킴으로써 활성화시켰고 이어서 YAP/TAZ를 인산화시켰다.
- 3B). 이 결과를 통해 AGNE가 Hippo signaling pathway에 중요한 kinase인 LATS1/2에 의존적으로 작용한다는 것을 시사한다.
- 3B). 이러한 결과는 AGNE가 MST1/2 비의존적으로 YAP-TEAD 전사활성을 저해하고 표적 유전자의 발현을 감소시키는 것을 보여주었다.
- AGNE는 YAP의 상위 신호전달 경로인 Hippo와 LATS1/2를 인산화시킴으로써 활성화시켰고 이어서 YAP/TAZ를 인산화시켰다. 이러한 결과에서 AGNE는 전형적인 Hippo signaling을 활성화시키는 효능이 있으며, 이를 통한 유방암세포의 성장과 이동을 억제함으로써, 유방암의 발달과 성장을 억제시킬 수 있는 잠재력이 있음을 확인하였다. Hippo-YAP 신호 전달 경로에 대한 AGNE의 효과가 명확해짐에 따라, AGNE를 사용하여 관련 동물 모델에서 유사한 억제 효과를 확인함과 아울러, 항암제 내성 세포에서 병용투여함으로써 전임상 연구를 수행해 나간다면 암의 진행을 억제하고, 약재내성을 극복할 수 있는 후보물질로 개발할 수 있을 것을 기대한다.
- AGNE가 Hippo signaling pathway의 중요한 전사 보조인자인 YAP의 인산화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 AGNE 50 ㎍/㎖과 100 ㎍/㎖을 시간 별로 처리한 후 phos-tag gel assay와 phospho-YAP(S127)에 대한 western blot을 시행하였다. 조사 결과 시간 별로 AGNE를 처리하였을 경우 YAP의 인산화가 눈에 띄게 시간 의존적으로 증가하였다(Fig 2B). YAPe 전사인자로 알려진 TEAD와 복합체를 형성함으로써 표적유전자의 발현을 유도하게 되는데 AGNE가 YAP과 TEAD의 상호작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 immunoprecipitation (IP)실험을 수행한 결과, AGNE가 YAP과 TEAD의 복합체 형성을 저해하는 것을 확인하였다(Fig.
후속연구
- Hippo pathway를 조절하는 약물 또는 조절인자를 발굴하고자 많은 연구들이 진행되고 있으며, 이들의 상관관계를 이해함으로써 Hippo pathway 활성 조절을 통한 항암치료의 새로운 치료전략으로서 가능성을 제시할 수 있을 것이다.
- 이러한 결과에서 AGNE는 전형적인 Hippo signaling을 활성화시키는 효능이 있으며, 이를 통한 유방암세포의 성장과 이동을 억제함으로써, 유방암의 발달과 성장을 억제시킬 수 있는 잠재력이 있음을 확인하였다. Hippo-YAP 신호 전달 경로에 대한 AGNE의 효과가 명확해짐에 따라, AGNE를 사용하여 관련 동물 모델에서 유사한 억제 효과를 확인함과 아울러, 항암제 내성 세포에서 병용투여함으로써 전임상 연구를 수행해 나간다면 암의 진행을 억제하고, 약재내성을 극복할 수 있는 후보물질로 개발할 수 있을 것을 기대한다.
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