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문제 정의
- Caveolin-1이 직접적으로 경화에 관여하는지 알아보기 위해 세포 내 caveolin-1의 유전자의 발현을 억제시킨 뒤 경화 인자의 발현을 확인해 보았다. 억제를 위해 HRMC에 lipofectamine 3000 mixture (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 caveolin-1 siRNA transfection assay를 실시하였다.
- 따라서 본 연구에서는 고혈당으로 유발된 당뇨병성 신장병증의 하나인 사구체 경화증에서 세포외 기질 생성 및 축적과 고혈당에 의해 증가되는 섬유증 유발 인자인 TGF-β1과 caveolin-1 과의 연관성에 대해 알아보고 생리활성 물질인 nobiletin의 세포외 기질 단백질 축적 억제 효능에 따른 당뇨병성 신장병증의 억제기전에 대해 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서 nobiletin을 이용한 cavolin-1의 발현 억제와 고혈당으로 인한 TGF-β1-Src-caveolin-1 그리고 세포 내 신호 전달 경로인 Rho GTPase [6,8]로 이어지는 세포 신호 전달 체계의 억제는 당뇨병성 신장병증에 대한 표적으로서 다양한 세포 내 경화 관련 신호 전달 경로를 억제할 수 있는 가능성을 제시하였다.
- 본 연구에서는 nobiletin이 고혈당으로 유도된 신장 HRMC에서 세포외 기질 축 적과 TGF-β1-Src-caveolin-1으로 이어지는 세포신호 전달 체계에 의한 사구체 경화증 억제 효 능을 알아보고자 하였다 [11].
제안 방법
- 33 mM 고혈당 자극 시 HRMC에서 증가하는 caveolin-1 단백질과 사구체 경화증과의 직접적 인 관련성을 알아보기 위해 siRNA transfection으로 HRMC에서의 caveolin-1의 발현을 억제시 켰다. 그 후 33 mM 고혈당 자극을 통해 caveolin-1과 RhoA-ROCK의 발현을 확인한 결과 고혈 당에 의해 증가되는 caveolin-1의 발현이 siRNA에 의해 억제됨을 확인하였고, 이에 따른 세포 내 신호전달 단백질인 RhoA-ROCK의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며 여기에 20 uM/mL의 nobiletin을 처리한 경우에도 caveolin-1과 RhoA-ROCK 단백질의 발현이 control 수준으로 감소하는 효과를 보였다.
- 감귤류의 껍질에서 분리된 폴리메톡시플라본 성분인 nobiletin (Fig. 1A)의 세포 독성을 알아보기 위해 HRMC에 1–20 uM 농도의 nobiletin을 처리하여 3일간 배양한 결과 세포 독성을 나타 내지않는것을확인하였다(Fig. 1B).
- 고혈당 자극과 더불어 nobiletin은 1–20 uM의 농도로 3일간 처리하였으며, nobiletin 은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해시킨 후 배지로 희석하여 실험을 실시하였다.
- 고혈당 자극과 더불어 nobiletin을 처리한 HRMC를 1 M β-glycerophosphate, 1% β-mercaptoethanol, 0.5 M NaF, 0.1 M Na3VO4 그리고 protease inhibitor cocktail이 첨가되어 있는 lysis buffer를 사용하여 용해하였으며, cell lysates는 lowry assay를 통해 단백질 정량을 실시한 후 동량의 단백질을 6%–15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE)로 분리하였다.
- 일차 배양된 HRMC 의 doubling 시간은 26–40 시간으로 [14], HRMC는 passage 6–10 사이를 사용하였으며 plate에 80% 밀도 이상일 때 실험에 사용하였다. 고혈당으로 인한 당뇨병성 신장병증 환경을 유발 하기 위해 세포를 33 mM 고농도 포도당을 첨가한 DMEM 배지에 0.1% bovine serum albumin (BSA)가 함유된 배지로 3일간 배양하였으며 삼투압으로 인한 영향을 배제하기 위해 osmotic control로 조절하기 위해 DMEM 배지에 27.5 mM mannitol과 0.1% BSA를 첨가한 배지를 사용하였다. 고혈당 자극과 더불어 nobiletin은 1–20 uM의 농도로 3일간 처리하였으며, nobiletin 은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해시킨 후 배지로 희석하여 실험을 실시하였다.
- 또한 세포외 기질의 축적과 비후를 유발하고 다양한 세포 내 신호 전달 체계를 활성화시키는 원인이 되는 것으로 알려져 있는 대표적 경화 유발 단백질인 TGF-β1의 발현 또한 감소시켰으며, TGF-β1과 관련된 세포 내 신호전달 경로를 확인하기 위해 [6,8,17] 경화증과 결체조 직의 리모델링에 관여한다고 알려진 caveolin-1과의 연관성을 살펴보았다.
- 세포에 5 µg caveolin-1 siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)와 lipofectamine 3000 mixture (Life Technologies)를 처리하여 5시간 동안 37°C에서 배양 한 후 transfection된 HRMC에 33 mM 고혈당 자극과 nobiletin을 처리한 후 3일간 배양하였다.
- 1% Tween 20)로 세척한 후 membrane을 collagen IV, fibronectin, connective tissue growth factor (CTGF), Src, caveolin-1, Ras homolog family member A (RhoA), Rho-associated protein kinase (ROCK), TGF-β1, TGF-β receptorI, II 항체를 1:1,000으로 희석하여 4°C에서 하룻밤 동안 방치하였다. 이후 TBS-T buffer로 10분간 3회 세척한 후에 horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 2차 항체를 이용하여 1시간 동안 반응시킨 뒤 15분간 4회 세척 후 immobilon western chemiluminescent HRP substrate (Millipore Corp., Billerica, MA, USA)와 Agfa X-ray film (Agfa-Gevaert, Mortsel, Belgium)을 이용하여 가시화시켰다.
- 세포에 5 µg caveolin-1 siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)와 lipofectamine 3000 mixture (Life Technologies)를 처리하여 5시간 동안 37°C에서 배양 한 후 transfection된 HRMC에 33 mM 고혈당 자극과 nobiletin을 처리한 후 3일간 배양하였다. 이후 세포를 용해하여 western blot을 통해 caveolin-1 발현 억제를 확인하였다.
- 1% sodium citrate 용액으로 5분간 세포막을 permeabilization 시킨 뒤 고정된 세포 에 collagen IV 항체와 fibronectin 항체를 첨가하여 4°C에서 하룻밤 동안 방치하였다. 이후 세포에 cy3 형광 염료가 결합된 anti-rabbit immunoglobulin G (IgG)와 fluorescein isothiocyanate (FITC)가 결합된 anti-mouse IgG 2차 항체를 이용하여 단백질의 발현을 가시화 시켰다. 형광 이미지는 Axiomager optical fluorescence microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하 여 촬영하였다.
대상 데이터
- Human renal mesangial cells (HRMCs)은 Sciencell Research Laboratories (Carlsbad, CA, USA) 에서 구입하여 사용하였으며 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)과 F12를 7:1의 비율로 혼합하고 15% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin을 첨가한 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 이후 세포에 cy3 형광 염료가 결합된 anti-rabbit immunoglobulin G (IgG)와 fluorescein isothiocyanate (FITC)가 결합된 anti-mouse IgG 2차 항체를 이용하여 단백질의 발현을 가시화 시켰다. 형광 이미지는 Axiomager optical fluorescence microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하 여 촬영하였다.
데이터처리
- 데이터 통계처리는 SPSS프로그램 (windows 16.0; SPSS Inc. IBM, Chicago, IL, USA)을 이용하여 실시하였으며, 결과는 mean ± SE로 나타내었으며 각 항목은 일원배치분산분석(one-way analysis of variance)를 통한 Duncan's multiple range test를 이용하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다.
이론/모형
- Caveolin-1이 직접적으로 경화에 관여하는지 알아보기 위해 세포 내 caveolin-1의 유전자의 발현을 억제시킨 뒤 경화 인자의 발현을 확인해 보았다. 억제를 위해 HRMC에 lipofectamine 3000 mixture (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 caveolin-1 siRNA transfection assay를 실시하였다. 세포에 5 µg caveolin-1 siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)와 lipofectamine 3000 mixture (Life Technologies)를 처리하여 5시간 동안 37°C에서 배양 한 후 transfection된 HRMC에 33 mM 고혈당 자극과 nobiletin을 처리한 후 3일간 배양하였다.
성능/효과
- 33 mM 고혈당으로 자극한 HRMC를 6일간 배양하여 caveolin-1의 발현과 Src의 발현을 확인한 결과, caveolin-1은 48과 72시간에 발현이 급격히 증가하였으며 Src 또한 72시간부터 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다 (Fig. 3A). HRMC를 고혈당에 노출시켜 nobiletin을 처 리하여 3일간 배양한 후 caveolin-1의 발현과 Src의 발현을 확인한 결과 33 mM 고혈당 자극에 증가한 caveolin-1과 Src 단백질이 nobiletin에 의해 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다 (Fig.
- 1D). Collagen IV와 더불어 fibronectin 그리고 CTGF 단백질을 확인한 결과고 혈당에 의해 각각의 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, nobiletin의 처리에 의해 감소하였다 (Fig. 2B and C).
- 3A). HRMC를 고혈당에 노출시켜 nobiletin을 처 리하여 3일간 배양한 후 caveolin-1의 발현과 Src의 발현을 확인한 결과 33 mM 고혈당 자극에 증가한 caveolin-1과 Src 단백질이 nobiletin에 의해 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다 (Fig. 3B). 또한 caveolin-1에 의해 영향을 받는 세포 내 신호 전달 경로인 Rho GTPase 경로 [11] 에 관여하는 단백질인 RhoA-ROCK의 발현을 확인한 결과 고혈당에 의해 발현이 증가되었으며 nobiletin에 의해 단백질의 발현이 감소됨을 확인하였다.
- HRMC에 33 mM 고혈당을 처리하여 72시간 동안 자극을 가한 후 western blot을 실시한 결과 33 mM 고혈당으로 자극한 HRMC에서는 collagen IV의 분비가 증 가하는 것을 확인하였고, 여기에 1–20 uM의 nobiletin을 처리하였을 때 농도 의존적으로 감소 하는 것을 확인하였다 (Fig. 1E).
- 고혈당 자극으로 인한 TGF-β1의 발현과 수용체의 발현을 확인한 결과 고혈당 자극에 의해 HRMC에서의 TGF-β1의 발현과 그 수용체의 발현이 증가하였으며 여기에 1–20 uM의 nobiletin을 처리한 결과 발현이 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 4A).
- 33 mM 고혈당 자극 시 HRMC에서 증가하는 caveolin-1 단백질과 사구체 경화증과의 직접적 인 관련성을 알아보기 위해 siRNA transfection으로 HRMC에서의 caveolin-1의 발현을 억제시 켰다. 그 후 33 mM 고혈당 자극을 통해 caveolin-1과 RhoA-ROCK의 발현을 확인한 결과 고혈 당에 의해 증가되는 caveolin-1의 발현이 siRNA에 의해 억제됨을 확인하였고, 이에 따른 세포 내 신호전달 단백질인 RhoA-ROCK의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며 여기에 20 uM/mL의 nobiletin을 처리한 경우에도 caveolin-1과 RhoA-ROCK 단백질의 발현이 control 수준으로 감소하는 효과를 보였다. 또한 caveolin-1의 발현을 억제시킨 HRMC에서 세포외 기질 축적에 관여하는 단백질인 collagen IV 분비, fibronectin 그리고 CTGF의 발현을 확인한 결과 caveolin-1 의 발현을 억제시킨 경우 각각의 단백질 발현이 control 수준으로 감소하는 것을 확인하였으 며, 20 uM/mL의 nobiletin을 처리한 경우 또한 같은 결과를 나타내는 것을 확인하였다 (Fig.
- 또한 TGF-β1이 경화를 유도하는지 알아보기 위해 HRMC에 10 ng/mL의 TGF-β1 단백질을 처리한 후 관련 단백질인 fibronectin의 발현을 확인한 결과 10 ng/mL의 TGF-β1 단백질을 처리한 경우와 고혈당 자극을 처리한 경우 비슷한 수준으로 fibronectin의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, nobiletin에 의해 control 수준으로 감소하였다 (Fig. 4B).
- 3B). 또한 caveolin-1에 의해 영향을 받는 세포 내 신호 전달 경로인 Rho GTPase 경로 [11] 에 관여하는 단백질인 RhoA-ROCK의 발현을 확인한 결과 고혈당에 의해 발현이 증가되었으며 nobiletin에 의해 단백질의 발현이 감소됨을 확인하였다.
- 그 후 33 mM 고혈당 자극을 통해 caveolin-1과 RhoA-ROCK의 발현을 확인한 결과 고혈 당에 의해 증가되는 caveolin-1의 발현이 siRNA에 의해 억제됨을 확인하였고, 이에 따른 세포 내 신호전달 단백질인 RhoA-ROCK의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며 여기에 20 uM/mL의 nobiletin을 처리한 경우에도 caveolin-1과 RhoA-ROCK 단백질의 발현이 control 수준으로 감소하는 효과를 보였다. 또한 caveolin-1의 발현을 억제시킨 HRMC에서 세포외 기질 축적에 관여하는 단백질인 collagen IV 분비, fibronectin 그리고 CTGF의 발현을 확인한 결과 caveolin-1 의 발현을 억제시킨 경우 각각의 단백질 발현이 control 수준으로 감소하는 것을 확인하였으 며, 20 uM/mL의 nobiletin을 처리한 경우 또한 같은 결과를 나타내는 것을 확인하였다 (Fig. 5).
- 본 연구에 서 HRMC에 10 ng/mL의 TGF-β1 단백질을 처리하여 33 mM 고혈당 자극을 처리한 그룹과 비교한 결과 TGF-β1을 처리한 경우 고혈당에 노출시킨 경우와 마찬가지로 fibronectin의 발현 이 증가함과 동시에 세포 내 caveolin-1 발현이 증가하는 것을 확인하였으며 이와 관련된 신호 전달인자인 Src과 RhoA의 발현 또한 증가하는 것으로 미루어 보아 고혈당에 노출시킨 경우와 마찬가지로 TGF-β1 처리에 의해 Src-caveolin-1-RhoA로 이어지는 신호 전달 체계가 활성화되며 nobiletin의 처리에 의해 유의적인 감소를 보이는 것을 확인하였다. 또한 고혈당에 의해 증가하는 caveolin-1에 의한 당뇨병성 신장병증의 증상을 확인하기 위해 caveolin-1 유전자를 knockout 시킨 후 경화 인자들의 발현과 caveolin-1과 관련된 Rho GTPase의 발현을 확인한 결과 각각의 인자들의 유의적인 상관관계를 확인할 수 있었으며 고혈당 자극에 의해 증가된 단백질들이 nobiletin에 의해 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 미루어 보 았을 때 고혈당으로 유도되는 당뇨병성 신장병증에 있어서 caveolin-1 단백질 발현의 조절은 경화증을 예방할 수 있는 중요한 요인임을 확인하였으며, nobiletin은 이를 효율적으로 조절 할 수 있는 기능성을 가지는 기능성 물질임을 확인할 수 있었다.
- 또한, HRMC를 33mM 고혈당자극조건에서 1–20 uM 농도 의 nobiletin을 처리한 후 3일간 배양한 결과 세포 독성을 나타내지 않았으며(Fig. 1C), 고혈당 자극에 의해 10%–20%가량 증식된 HRMC의 증식이 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
- 또한, caveolin-1, Src 그리고 RhoA 단백질의 발현 역시 10 ng/mL의 TGF-β1 단백질 처리와 고혈당 자극에 의해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며, nobiletin 처리 시 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 4B).
- 먼저 33 mM 고혈당으로 자극한 HRMC를 6일간 배양하여 대표적 경화인자인 fibronectin과 CTGF의 발현을 확인한 결과 fibronectin은 48시간부터 발현이 증가하여 72시간에 최대 발 을 나타냈으며 CTGF는 24시간부터 발현이 점차 증가하여 48시간에 최대 발현을 나타내는 것으로 나타났다 (Fig. 2A). HRMC에 33 mM 고혈당을 처리하여 72시간 동안 자극을 가한 후 western blot을 실시한 결과 33 mM 고혈당으로 자극한 HRMC에서는 collagen IV의 분비가 증 가하는 것을 확인하였고, 여기에 1–20 uM의 nobiletin을 처리하였을 때 농도 의존적으로 감소 하는 것을 확인하였다 (Fig.
- 본 연구에 서 HRMC에 10 ng/mL의 TGF-β1 단백질을 처리하여 33 mM 고혈당 자극을 처리한 그룹과 비교한 결과 TGF-β1을 처리한 경우 고혈당에 노출시킨 경우와 마찬가지로 fibronectin의 발현 이 증가함과 동시에 세포 내 caveolin-1 발현이 증가하는 것을 확인하였으며 이와 관련된 신호 전달인자인 Src과 RhoA의 발현 또한 증가하는 것으로 미루어 보아 고혈당에 노출시킨 경우와 마찬가지로 TGF-β1 처리에 의해 Src-caveolin-1-RhoA로 이어지는 신호 전달 체계가 활성화되며 nobiletin의 처리에 의해 유의적인 감소를 보이는 것을 확인하였다.
- HRMC를 33 mM의 고혈당 자극에 3일간 노출시키게 되면 세포의 과증식이 일어나게 되고 [7,15], 이러한 자극은 세포 내에서 경화와 관련된 collagen IV의 생성 및 분비 증가, fibronectin 과 CTGF 단백질 발현의 증가를 가져오게 된다 [3,7,15]. 여기에 nobiletin을 처리하였을때 세포의 과증식과 세포외 기질 축적 단백질의 발현을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 또한 세포외 기질의 축적과 비후를 유발하고 다양한 세포 내 신호 전달 체계를 활성화시키는 원인이 되는 것으로 알려져 있는 대표적 경화 유발 단백질인 TGF-β1의 발현 또한 감소시켰으며, TGF-β1과 관련된 세포 내 신호전달 경로를 확인하기 위해 [6,8,17] 경화증과 결체조 직의 리모델링에 관여한다고 알려진 caveolin-1과의 연관성을 살펴보았다.
- 또한 고혈당에 의해 증가하는 caveolin-1에 의한 당뇨병성 신장병증의 증상을 확인하기 위해 caveolin-1 유전자를 knockout 시킨 후 경화 인자들의 발현과 caveolin-1과 관련된 Rho GTPase의 발현을 확인한 결과 각각의 인자들의 유의적인 상관관계를 확인할 수 있었으며 고혈당 자극에 의해 증가된 단백질들이 nobiletin에 의해 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 미루어 보 았을 때 고혈당으로 유도되는 당뇨병성 신장병증에 있어서 caveolin-1 단백질 발현의 조절은 경화증을 예방할 수 있는 중요한 요인임을 확인하였으며, nobiletin은 이를 효율적으로 조절 할 수 있는 기능성을 가지는 기능성 물질임을 확인할 수 있었다.
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