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문제 정의
- 과피의 색소가 흑자색이므로 높은 플라보노이드 화합물 함량으로 인해 생리활성 효능이 더욱 긍정적일 것이라 기대된다. 따라서 본 연구자들은 고기능성 쌀 품종으로 육종한 큰눈자미벼를 분획별로 나누어 건강 증진용 식품으로의 활용 방안을 모색하는 것이 쌀의 고부가가치화를 이끌 수 있을 것이라 생각하며, 영양가치가 높은 배아 분획의 phytosterols 함량, 항산화 활성을 측정하고, 성숙기 흰쥐에게 보충 급여하였을 때의 당질 대사, 항산화능 및 일부의 cytokines 개선 여부를 각각 검증하여 중년 이후 성인의 항산화 관련 대사 개선을 위한 건강 기능성 식품 소재화 가능성을 검토하고자 한다.
- 본 연구에서는 고기능성 쌀인 큰눈자미 배아의 phytosterols 함량 및 in vitro 항산화 활성을 평가하고, 성숙기 흰쥐에게 보충 급여한 당질 대사, 항산화 활성 및 일부 cytokines 개선 효과 여부를 검증하였다. Phytosterols 분석에서 NG보다 KG의 campesterol과 stigmasterol의 함량이 유의하게 높았다.
제안 방법
- 동물 실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회의 승인 (승인번호: 2018-0036)을 받아 진행하였다. 1주일 후 체중을 유사하도록 randomized block design을 이용하여 10마리씩 3군으로 배분하였다. 실험식이 디자인은 Kawabata 등 [29]의 diet 구성을 참고하여 수행하였다.
- ABTS radical 소거능 측정은 Re 등 [28]의 방법에 따라 수정하여 진행하였다. 7.
- DPPH radical 소거 활성을 이용하는 전자공여능 측정은 Blois [26]의 방법에 따라 수정하여 진행하였다. 동결건조된 배아 샘플을 농도별로 DMSO에 녹인 후 0.
- Phytosterols 함량은 Kwon 등 [23], Park과 Lee [25]의 방법에 따라 수정하여 분석하였다. 2 N KOH (dissolved in ethanol)용액 2 mL에 배아 oil 샘플 0.
- 분리된 n-hexane 층을 모아 sodium sulfate anhydrous로 탈수시켜 5-cholestane (1 mg/1 mL in n-hexane) 100 μL를 넣은 후 GC-MS (Gas Chromatograph Mass Spectrometer, 7890B-5977B GC/MSD; Agilent, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다.
- 상층액 100 μL를 분리하고 증류수 100 μL와 0.1% FeCl3 20 μL를 가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 일반식이 (AIM-93M)를 급여한 정상대조군 (normal control, NC), 일반식이에 일반현미배아 3%를 첨가한 군 (AIM-93M + normal rice germ 3%, NG3), 일반식이에 큰눈자미배아 3%를 첨가한 군 (AIM-93M + Keunnunjami germ 3%, KG3)으로 나누어 고형식이와 식수를 제한없이 8주간 사육하였다. 식이 섭취량은 매일 일정한 시간에 기록하였으며, 체중 및 혈당 변화는 2주마다 측정하였다.
- NG에 비해 KG가 DPPH radical 소거 활성, 환원력 및 ABTS radical 소거능 측정에서 유의적으로 높은 값을 나타내었다. 실험동물은 각 10마리씩 3군으로 나누어 일반 식이를 급여하는 NC군, 일반현미배아 3%를 첨가하는 NG3군, 큰눈자미배아 3%를 첨가하는 KG3군으로 나누어 사육하였다. 그 결과 KG3군에서 체중증가량, 신장주위 및 총 지방량이 유의하게 감소하였다.
- 식이 조성은 Table 1과 같다. 일반식이 (AIM-93M)를 급여한 정상대조군 (normal control, NC), 일반식이에 일반현미배아 3%를 첨가한 군 (AIM-93M + normal rice germ 3%, NG3), 일반식이에 큰눈자미배아 3%를 첨가한 군 (AIM-93M + Keunnunjami germ 3%, KG3)으로 나누어 고형식이와 식수를 제한없이 8주간 사육하였다. 식이 섭취량은 매일 일정한 시간에 기록하였으며, 체중 및 혈당 변화는 2주마다 측정하였다.
- 추출은 총 2회 실시하였고 추출액을 모아 Whatman GF/A glass fiber filter paper (Whatman, Maidstone, UK)로 필터링한 후에 rotary evaporator (N-1110; EYELA, Tokyo, Japan)에 넣어 30°C에서 농축시켰다.
- 항산화 효과 측정용 배아 추출은 Butsat과 Siriamornpun [24]의 방법에 따라 수정하여 진행하였다. Eighty percent MeOH 20 mL에 배아 파우더 2 g을 가하고, incubator (WSB-45; DAIHAN Scientific, Wonju, Korea)에 넣어 상온에서 150 rpm로 16시간 동안 교반 시키면서 총 2번 추출하였다.
- 혈중 C-peptide, leptin, interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 수준은 ELISA kit (Fine Biotech Co., Wuhan, China)로 측정하였다.
- 혈중 glucose 수준은 kit (Asan Pharmaceutical Co., Seoul, Korea)로 측정하였고, 혈중 인슐린, 당화혈색소, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), superoxide dismutase (SOD)는 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (MyBioSource, San Diego, CA, USA)로 측정하였다. 혈중 C-peptide, leptin, interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 수준은 ELISA kit (Fine Biotech Co.
- 환원력 (reducing power) 측정은 Oyaizu [27]의 방법에 따라 수정하여 진행하였다. 배아 샘플과 0.
대상 데이터
- Chloroform (CHCl3), n-hexane, dimethyl sulfoxide (DMSO), 5-cholestane, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), potassium hydroxide (KOH), sodium phosphate, potassium hexacyanoferrate (III) (K3Fe(CN)6), trichloroacetic acid (TCA), iron (III) chloride (FeCl3), 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), potassium persulfate, L-ascorbic acid, β-sitosterol, campesterol, cycloartenol, stigmasterol는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, methanol (MeOH), ethanol는 Merck KGaA (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 큰눈자미는 한국방송통신대학교 농학과에서 현미상태로 제공을 받았다. 도정 과정을 걸쳐 미강 부분을 제외한 배아와 배유가 섞인 상태에서 수작업으로 배유를 걸러낸 후에 배아를 거두어 실험에 사용하였다.
- 본 연구의 소재로 사용한 큰눈자미는 기능성 유색미로서 cyanidin 3-glucoside 함량이 높을 뿐 아니라 배아의 크기가 일반 벼에 비해 약 3배정도 큰 것이 특징이다 [22]. 과피의 색소가 흑자색이므로 높은 플라보노이드 화합물 함량으로 인해 생리활성 효능이 더욱 긍정적일 것이라 기대된다.
- 생후 30주령 수컷 Spraque-Dawley rats 30마리를 ㈜중앙실험동물 (Seoul, Korea)에서 공급받아 1주일간 고형식이를 급여하여 주변환경에 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다. 동물 사육실 환경은 온도 25 ± 2°C, 습도 50 ± 5%, 명암주기 12시간 간격으로 유지하였다.
- 도정 과정을 걸쳐 미강 부분을 제외한 배아와 배유가 섞인 상태에서 수작업으로 배유를 걸러낸 후에 배아를 거두어 실험에 사용하였다. 일반현미 배아는 국내 일반마트 (Emart, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- , Wuhan, China)로 측정하였다. 혈장 advanced oxidation protein products (AOPP)는 ELISA kit (Sunlong Biotech Co., Hangzhou, China)를 구입하여 측정하였다.
데이터처리
- In vitro 실험에서 배아군들 간의 유의성 검정은 Independent samples t-test로 하였고, In vivo 실험에서 대조군 및 배아 섭취군들 간 유의성 차이는 p < 0.05 수준에서 Tukey's range test를 이용하여 실시하였다.
- 통계분석은 SPSS (ver.25; IBM Corp., Armonk, NY, USA) 프로그램을 사용하여 실험결과를 mean ± SE로 구하였다.
이론/모형
- Phytosterols 정량 분석용 배아는 일부 수정한 Kwon 등 [23]의 방법에 따라 추출하였다. CHCl3-MeOH (2:1, v/v) 혼합용매 100 mL에 배아 파우더 10 g을 첨가한 후 sonicator (Sinhan-Sonic, Incheon, Korea)에 넣어 상온에서 2시간 동안 추출하였다.
- 1주일 후 체중을 유사하도록 randomized block design을 이용하여 10마리씩 3군으로 배분하였다. 실험식이 디자인은 Kawabata 등 [29]의 diet 구성을 참고하여 수행하였다. 식이 조성은 Table 1과 같다.
성능/효과
- ABTS radical 소거능도 10, 2, 1 mg/mL 농도에서 NG가 각각 130.34 μg AAE, 36.95 μg AAE, 19.66 μg AAE로 측정되었으며, KG는 각각 167.57 μg AAE, 103.00 μg AAE, 65.49 μg AAE로 유의적 높은 값으로 나타났다 (p < 0.001).
- Campesterol의 함량은 NG가 0.15 mg/g에 비해 KG가 0.33 mg/g로 2배 높게 나타났다 (p < 0.01).
- KG3군에서 혈중 TNF-α 수준이 NG3에 비해 유의적으로 감소하고, SOD 활성이 유의하게 증가하였으며, leptin, AOPP 및 IL-6 수준이 감소하는 경향을 나타내었다.
- Leptin 수준은 NC군이 8.69 ng/mL, NG3군이 7.68 ng/mL, KG3군이 7.23 ng/mL로 나타나 NC군에 비하여 NG3군이 유의적인 차이를 보이지 않았으나, KG3군이 유의하게 낮은 값으로 나타났다 (p < 0.05).
- NC군에 비해 NG3군이 유의적 차이가 없었으나, KG3군이 유의하게 증가한 것으로 나타났다 (p < 0.05).
- Phytosterols 분석에서 NG보다 KG의 campesterol과 stigmasterol의 함량이 유의하게 높았다. NG에 비해 KG가 DPPH radical 소거 활성, 환원력 및 ABTS radical 소거능 측정에서 유의적으로 높은 값을 나타내었다. 실험동물은 각 10마리씩 3군으로 나누어 일반 식이를 급여하는 NC군, 일반현미배아 3%를 첨가하는 NG3군, 큰눈자미배아 3%를 첨가하는 KG3군으로 나누어 사육하였다.
- 본 연구에서는 고기능성 쌀인 큰눈자미 배아의 phytosterols 함량 및 in vitro 항산화 활성을 평가하고, 성숙기 흰쥐에게 보충 급여한 당질 대사, 항산화 활성 및 일부 cytokines 개선 효과 여부를 검증하였다. Phytosterols 분석에서 NG보다 KG의 campesterol과 stigmasterol의 함량이 유의하게 높았다. NG에 비해 KG가 DPPH radical 소거 활성, 환원력 및 ABTS radical 소거능 측정에서 유의적으로 높은 값을 나타내었다.
- Stigmasterol의 함량은 NG가 0.10 mg/g, KG가 0.14 mg/g로 나타났으며 KG가 유의하게 높았다 (p < 0.05).
- TNF-α 수준은 NC군이 273.77 pg/mL, NG3군이 259.42 pg/mL에 비해 KG3군이 219.01 pg/mL로 나타나 유의적으로 감소하였다 (p < 0.05).
- 실험동물은 각 10마리씩 3군으로 나누어 일반 식이를 급여하는 NC군, 일반현미배아 3%를 첨가하는 NG3군, 큰눈자미배아 3%를 첨가하는 KG3군으로 나누어 사육하였다. 그 결과 KG3군에서 체중증가량, 신장주위 및 총 지방량이 유의하게 감소하였다. 당질 대사에서 실험군들 간에 glucose, 인슐린, C-peptide 및 HOMA-IR의 수준이 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
- 또한, TNF-α의 유의적 감소 및 SOD 활성이 유의하게 차이가 있음을 확인하였으며, leptin, AOPP 및 IL-6 수준이 감소되는 경향을 보였다.
- 본 실험결과 쿤눈자미 배아 보충급여에 의해 체중 증가가 감소되었고, TNF-α 수준은 유의적으로 낮았으며, leptin과 IL-6 수준은 일반 현미 배아보다 유의적 차이를 보이지 않았지만 감소하는 경향을 보인 것으로 관찰되었다.
- 산화매개성 단백질 손상지표인 AOPP는 아미노산 잔기 즉, tyrosine이 dityrosine으로 산화되면서 단백질이 aggregation, cross-linking 또는 fragmentation을 형성하면서 정상적인 단백질 분해가 일어나지 않아 생성되는데, 비만과 당뇨병 환자에게서 증가하기 때문에 산화스트레스와 염증으로 유발되는 조직 손상의 신뢰성 있는 마커로 알려져있다 [46]. 본 연구에서 일반 현미와 큰눈자미 배아 보충급여를 했을 때 AOPP 수준은 유의적 차이가 없었지만 감소하는 경향을 보였다. TBARS는 활성산소가 세포막의 구성성분인 불포화지방산을 공격하여 생성되는 반응물인 malondialdehyde (MDA)를 측정함으로써 세포의 산화적 스트레스 및 과산화 정도를 확인할 수 있는데, MDA가 축적되면 세포막의 형태가 변형되어 이온수송, 효소활성 및 세포표면 부착상태를 변성시키고, 또한 DNA의 염기와 반응하여 돌연변이성 병변을 일으킨다고 알려져 있다.
- 식이섭취량은 차이가 없었으며, 식이효율 (food efficiency ratio)은 KG3군이 2.48%로 NC군이 4.30%, NG3군이 4.91%에 비해 유의하게 낮았다 (p < 0.05).
- 실험을 시작할 때와 종료 시의 체중은 세 군 사이에 유의적인 차이가 없었으나, 체중 증가량은 NC군이 0.92 g/day, NG3군이 1.03 g/day에 비해 KG3군이 0.55 g/day로 유의적으로 감소한 것으로 나타났다 (p < 0.05).
- 쌀에 함유되어 있는 phytosterols은 β-sitosterol, campesterol, stigmasterol 순으로 비율이 높은데 [17], 본 실험결과 이와 유사한 경향을 보였으며 특히, 일반현미에 비해 큰눈자미에서 유의하게 높은 것으로 확인되었다.
- 연구 결과를 종합하면 in vitro 실험에서 큰눈자미 배아의 campesterol, stigmasterol 함량이 높고, DPPH radical 소거 활성, 환원력, ABTS radical 소거능이 우수한 것으로 나타났다. 그리고 성숙기 흰쥐 모델에서 큰눈자미 배아 보충급여는 체중 증가량과 체지방량이 감소된 것을 관찰하였으나, 혈당 변화, insulin 및 C-peptide 수준으로 평가한 당질 대사에 미치는 영향은 제한적이다.
- 또한 쌀 배아를 첨가한 스낵은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성이 높은 결과를 보였다는 결과를 나타내었다 [41]. 이어 본 연구에서 DPPH radical 소거 활성, 환원력, ABTS radical 소거능을 측정한 결과, 일반 현미 배아보다 큰눈자미 배아의 항산화 활성이 더 우수함을 확인하였다.
- 전자공여능은 10, 2, 1 mg/mL 농도에서 NG는 33.60%, 12.81%, 10.52%, KG는 90.42%, 38.40%, 23.66%으로 나타나 큰눈자미 배아군에서 유의하게 높은 활성을 보였다 (p < 0.001).
- 혈당 변화는 실험 시작한 시점이 종료한 시점과 비교했을 때 세 군 사이에 유의적 차이가 없었으나, NG3군에서 약간 증가하는 경향을 보였다. 인슐린, C-peptide 및 인슐린저항성 (homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)는 모든 군에서 유의한 차이를 보이지 않았다 (Table 4).
- 환원력을 측정한 결과 10, 2, 1 mg/mL 농도에서 NG의 흡광도 값은 0.24, 0.08, 0.07로 나타났으며, KG는 1.11, 0.38, 0.24로 나타나 NG에 비해 유의적으로 높았다 (p < 0.001).
후속연구
- 본 연구의 소재로 사용한 큰눈자미는 기능성 유색미로서 cyanidin 3-glucoside 함량이 높을 뿐 아니라 배아의 크기가 일반 벼에 비해 약 3배정도 큰 것이 특징이다 [22]. 과피의 색소가 흑자색이므로 높은 플라보노이드 화합물 함량으로 인해 생리활성 효능이 더욱 긍정적일 것이라 기대된다. 따라서 본 연구자들은 고기능성 쌀 품종으로 육종한 큰눈자미벼를 분획별로 나누어 건강 증진용 식품으로의 활용 방안을 모색하는 것이 쌀의 고부가가치화를 이끌 수 있을 것이라 생각하며, 영양가치가 높은 배아 분획의 phytosterols 함량, 항산화 활성을 측정하고, 성숙기 흰쥐에게 보충 급여하였을 때의 당질 대사, 항산화능 및 일부의 cytokines 개선 여부를 각각 검증하여 중년 이후 성인의 항산화 관련 대사 개선을 위한 건강 기능성 식품 소재화 가능성을 검토하고자 한다.
- SOD는 세포내에서 생성되는 superoxide anion radical을 과산화수소로 전환시킴으로써 catalase, glutathione peroxidase와 함께 세포의 손상을 스스로 보호한다 [47]. 노화가 진행되고 있는 성숙쥐 모델에서 항산화 대사 활성 및 biomarker 분석을 통해 큰눈자미 배아 섭취군에서 항산화 활성이 높은 것으로 확인하였고 이는 항산화 관련 기능성 식품소재로서의 가능성이 있을 것으로 판단된다.
- KG3군에서 혈중 TNF-α 수준이 NG3에 비해 유의적으로 감소하고, SOD 활성이 유의하게 증가하였으며, leptin, AOPP 및 IL-6 수준이 감소하는 경향을 나타내었다. 이상의 결과로부터 큰눈자미 배아는 높은 함량의 phytosterols과, 우수한 in vitro 항산화활성, 그리고 in vivo 실험에서 일부의 cytokine 개선 및 항산화에 긍정적인 효과가 있음을 제시하였고 향후 더 많은 생리활성물질 분석, 대사 지표 개선, 작용 기전 규명 등 세부적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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