[논문]산약에서 분리한 β-sitosterol과 daucosterol의 RAW 264.7 세포와 TK-1 세포에서의 면역 활성 조절 효능

박민경; 조세희; 안태규; 김도현; 김소연; 이진욱; 김지인; 서을원; 손건호; 임재환

doi:10.5352/jls.2020.30.4.359

산약에서 분리한 β-sitosterol과 daucosterol의 RAW 264.7 세포와 TK-1 세포에서의 면역 활성 조절 효능
Immunomodulatory Effects of β-sitosterol and Daucosterol Isolated from Dioscorea batatas on LPS-stimulated RAW 264.7 and TK-1 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.4, 2020년, pp.359 - 369

박민경 (안동대학교 생명공학부) , 조세희 (안동대학교 생명공학부) , 안태규 (안동대학교 생명공학부) , 김도현 (안동대학교 생명공학부) , 김소연 (안동대학교 식품영양학과) , 이진욱 (안동대학교 생명공학부) , 김지인 (안동대학교 백신산업연구소) , 서을원 (안동대학교 생명공학부) , 손건호 (안동대학교 식품영양학과) , 임재환 (안동대학교 생명공학부)

초록
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많은 면역 소재 연구에서 RAW 264.7 세포를 이용한 결과는 많이 보고되어 있으나 T 세포 유래 TK-1 세포를 활용한 연구결과는 거의 보고되어 있지 않다. 또한 식물 유래 성분인 β-sitosterol의 효능 연구에 비하여 그 유사체인 daucosterol의 면역 활성 조절 기능에 관한 연구도 매우 부족하다. 본 연구에서는 산약, D. batatas, 에서 β-sitosterol과 daucosterol을 추출하여 분리하고 NMR 방법으로 동정하였다. 이후 분리된 phytosterols의 면역 증강 또는 억제 효능을 규명하기 위해 lipopolysaccharide로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포와 TK-1 세포에 β-sitosterol과 daucosterol을 각각 농도별로 12시간 동안 처리한 후에 염증관련 유전자인 COX-2, TNF-α, IL-6, iNOS의 상대적인 발현양을 RT-PCR 방법으로 분석하였다. 대식세포주인 RAW 264.7에 β-sitosterol을 처리하였을 때, LPS만을 처리한 대조군의 발현 증가량과 비교하여 TNF-α와 iNOS의 상대적인 발현양이 3 fold 이상 증가하였다. TK-1 세포의 경우에서는 β-sitosterol의 처리 농도의존적으로 TNF-α의 발현양은 감소하고 iNOS의 발현양은 증가하였다. Daucosterol을 RAW 264.7 세포에 처리한 경우 COX-2, TNF-α, IL-6의 발현양이 0.7~1.2 fold 정도로 변화하였으며 iNOS의 경우는 특이하게 0.8~0.18 fold로 발현양이 농도의존적으로 감소하였다. TK-1 세포에 daucosterol을 처리한 경우에는, 놀랍게도 LPS만 처리된 경우와 비교하여 상대적으로 TNF-α, IL-6, iNOS의 발현량이 급격하게 감소하는 것을 확인하였다. 결과적으로, β-sitosterol의 처리는 RAW 264.7 세포에서 TNF-α, iNOS의 발현증가를 유도하여 면역 상승 효과에 관여하였다. TK-1 세포에서는, iNOS 발현 수준이 증가하였고, 반면에 TNF-α 발현수준은 감소하여, β-sitosterol의 면역 억제 활성을 보여주었다. Daucosterol은 RAW 264.7 세포의 iNOS 발현양을 억제하고 TK-1 세포에서 TNF-α, IL-6, iNOS의 발현을 크게 억제함으로써, 대식세포와 T 세포주에서 모두 면역 억제 효능을 보이는 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Although many studies on immune modulatory materials have used RAW 264.7 cells, few have used T cell-derived TK-1 cell lines. Moreover, although some studies have investigated the efficacy of plant-derived β-sitosterol, few have examined the immunomodulatory activity of its analogue, daucosterol. In this study, β-sitosterol and daucosterol were isolated from D. batatas and identified by nuclear magnetic resonance spectroscopy. To evaluate the immune-enhancing or inhibitory effects of the isolated phytosterols, the expression levels of the inflammatory response genes COX-2, TNF-α, IL-6, and iNOS were analyzed by RT-PCR. The relative expression levels of TNF-α and iNOS in RAW 264.7 cells were increased more than threefold with β-sitosterol treatment comparing to those of untreated control. In the case of TK-1 cells, the expression level of TNF-α was decreased and the expression level of iNOS was increased in a β-sitosterol concentration-dependent manner. The expression levels of COX-2, TNF-α, and IL-6 increased by approximately 0.7-1.2 times in RAW 264.7 cells treated with daucosterol compared to those of untreated control, but iNOS expression decreased by 0.8-0.18 times. In the case of daucosterol-treated TK-1 cells, the expression levels of TNF-α, IL-6, and iNOS were markedly reduced from those of TK-1 cells treated only with lipopolysaccaride. As a conclusion, β-sitosterol treatment increased TNF-α and iNOS expression levels in RAW 264.7 cells, thus exerting an immune- boosting effect. However, in TK-1 cells, iNOS expression increased while TNF-α expression decreased, indicating an immunosuppressive activity of β-sitosterol. Daucosterol appears to exert an immunosuppressive effect in both macrophages and T cell lines by inhibiting iNOS expression in RAW 264.7 cells and greatly inhibiting the expression of TNF-α, IL-6, and iNOS in TK-1 cells.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Isolation and determination of extracted compounds from D. batatas.
표 Table 1. Primer sequences of selected genes related inflammation used in RT-PCR
표 Table 2. ¹H- and ¹³C-NMR spectral data for β-sitosterol and daucosterol extracted from D. batatas
그림 Fig. 2. (A) Cell viabilities of RAW 264.7 cells and TK-1 cells. Both cells were treated with lipopolysaccharide for 24 hr, respectively. Then, cell viability was measured by MTT assay. (B) Immune-related gene expressions in LPS-stimulated RAW 264.7 and TK-1 cell lines.
그림 Fig. 3. (A) Effect of β-sitosterol on COX-2, TNF-α, IL-6 and iNOS mRNA expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells were treated with β-sitosterol (10, 20, 50 μM) and LPS (1 μg/ml) for 12 hr. (B) Effect of daucosterol on COX-2, TNF-α, IL-6 and iNOS mRNA expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.
그림 Fig. 4. COX-2, TNF-α, IL-6 and iNOS mRNA expression in TK-1 cells.

AI 본문요약
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문제 정의

7과 T-림프구 세포주인 TK-1에 각각 처리 한 후, 염증 조절 관련 인자인 TNF-α. IL-6, COX-2 및 iNOS의 발현 유도 및 억제 조절 기능을 분석하여 천연 분리 소재인, 두 phytosterol 성분에 의한 염증 조절 기작의 기초 자료를 제공하고 염증조절 인자로서의 기능성 및 활용 가능성을 판단 하고자 하였다.
따라서 β-sitosterol과 daucosterol의 염증 반응에 미치는 영향을 분석하기 전에, LPS 처리가 TK-1 세포에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
본 실험에서는 TK1세포에 β-sitosterol과 daucosterol 처리 시의 염증 관련 유전자의 발현양의 변화를 확인하고자 하였다.
본 연구는 면역 연구에서 일반적으로 사용하는 대식세포주 인 RAW 264.7과 연구가 부족한 T 세포주인 TK-1을 이용하여 각 세포주 내 면역관련 유전자의 발현 차이를 분석하고, 그 결과를 바탕으로 산약 추출물의 면역보조제로서의 활용 가능성을 확인하고자 하였다. 산약의 주요 기능성 성분인 dioscin, diosgenin을 배제하고 추가적인 성분 추출 과정을 통해 β-sitosterol과 daucosterol을 분리하였으며, HPLC와 NMR 분석 을 통해 동정하였다.
본 연구는 산약에 포함된 많은 phytosterol 중 어떤 인자가 면역 억제 조절 등에 효과적으로 작용하는지 알아보기 위하여 분리 동정한 phytosterol 중 β-sitosterol, daucosterol을 선택적으로 이용하여 연구를 수행하였다.

제안 방법

β-Sitosterol과 daucosterol을 세포주에 각각 처리한 후, 시간과 농도 차이에 따른 세포 생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 진행하였다.
β-Sitosterol의 처리를 통하여 LPS에 의한 염증 반응의 강화 및 억제 효능을 확인하기 위하여 LPS로 염증반응을 유도한 RAW 264.7 세포에 β-sitosterol을 10, 20, 50 μM의 농도로 각각 처리한 후 12시간, 24시간 뒤 COX-2, TNF-α, IL-6, iNOS 발현양의 변화를 각 유전자 특이적 primer를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 LPS만 처리한 양성대조군과 비교하여 상대적으로 분석하였다.
따라서 β-sitosterol과 daucosterol의 염증 반응에 미치는 영향을 분석하기 전에, LPS 처리가 TK-1 세포에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. LPS를 처리하지 않은 RAW 264.7에서 각 유전자 발현양을 0으로, LPS 처리 12시간 후의 발현양을 1로 환산하고, 24시간 처리 한 후의 발현양을 상대적으로 비교하였다. LPS 처리 후 24시간 배양 시에 COX-2는 2.
면역 관련 유전자에 해당하는 모든 primer는 NCBI Primer BLAST 프로그램으로 디자인한 뒤, 바이오닉스 (Seoul, Korea)에 합성을 의뢰하였다. PCR 반응은 Ex-Taq (Takara, Japan)을 이용하였으며, 각 PCR product는 전기영동 후 Quantity One (Bio-Rad, USA) 프로그램을 이용하여 mGAPDH 유전자의 발현양과 비교한 유전자의 발현 정도를 각각 정량 분석하였다.
7 세포주는 KCLB (Korean Cell Line Bank, Korea)에서 구입하였으며, TK-1 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 사용하였다. RAW 264.7은 10% FBS (Gibco, USA)와 1% antibiotics-antimycotic (Gibco, USA)를 첨가한 DMEM (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였으며 TK-1은 10% FBS (Gibco, USA) 와 1% antibiotics-antimycotic (Gibco, USA)를 첨가한 RPMI 1640 (Welgene, Korea)에서 배양하였다. 배양 환경은 37℃, 5% CO₂ 조건에서 계대 배양하였다.
0×10⁵ cell/well)를 24시간 동안 배양 한 후 lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/ml)를 처리하고, 분리한 β-sitosterol과 daucosterol을 각각 10, 20, 50 μM의 농도로 처리하고 12시간 동안 추가 배양하였다. TRIzol (Gibco, USA)을 이용하여 RNA를 추출하고 microplate reader (Infinite 200, Tecan Trading AG, Switzerland)를 사용하여 정량한 후 iScript^TM cDNA synthesis kit (Bio-Rad, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
C-NMR을 이용한 성분 분석 결과 β-sitosterol과 daucosterol로 확인되었으며, 각 분석 결과는 Table 2에 제시하였다. 각 성분을 이후 실험의 시료로 사용하기 위하여, 동정된 시료의 성분 및 순도를 RP-HPLC를 이용하여 재확인하였다(Fig. 1B). β-Sitosterol과 daucosterol은 95% 이상의 순도로 분리되었음을 확인하였다.
각 세포주를 96-well plate에 4.0×104 cell/well이 되도록 분주하여 배양한 후, β-sitosterol과 daucosterol의 농도가 10, 20, 50 μM이 되도록 시료를 각각 처리하였다.
동정된 compound 3, 10은 Hypersil Gold Column (5 μm, 250 mm × 4.6 mm)을 사용하여 methanol:acetonitrile 용매조건(30:70 → 0:100)에서 flow rate 1 ml/min으로 HPLC 분석을 수행한 후 Image J (NIH, USA) 프로그램을 이용하여 순도를 확인하였다.
RT-PCR 진행을 위한 oligo primer 염기서열은 Table 1에 나타내었다. 면역 관련 유전자에 해당하는 모든 primer는 NCBI Primer BLAST 프로그램으로 디자인한 뒤, 바이오닉스 (Seoul, Korea)에 합성을 의뢰하였다. PCR 반응은 Ex-Taq (Takara, Japan)을 이용하였으며, 각 PCR product는 전기영동 후 Quantity One (Bio-Rad, USA) 프로그램을 이용하여 mGAPDH 유전자의 발현양과 비교한 유전자의 발현 정도를 각각 정량 분석하였다.
본 실험에서는 LPS로 처리한 대식 세포주 RAW 264.7과 T 세포 유래 TK-1 세포에 산약에서 분리한 β-sitosterol과 daucosterol을 농도별로 12시간 동안 처리한 후 면역반응에 관련 된 유전자의 mRNA 발현양을 분석하였다.
본 연구는 산약(D. batatas)에서 분리하여 동정한 phytosterol인 β-sitosterol과 daucosterol을 LPS로 처리한 마우스 대식 세포주인 RAW 264.7과 T-림프구 세포주인 TK-1에 각각 처리 한 후, 염증 조절 관련 인자인 TNF-α.
산약에서 분리 동정한 β-sitosterol과 daucosterol의 처리에 따른 세포의 성장 및 생존에 미치는 영향을 분석하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.
산약의 주요 기능성 성분인 dioscin, diosgenin을 배제하고 추가적인 성분 추출 과정을 통해 β-sitosterol과 daucosterol을 분리하였으며, HPLC와 NMR 분석 을 통해 동정하였다.
염증반응 유도 후 두 분리성분(β-sitosterol, daucosterol)이 면역 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 배양된 각각의 세포주(1.0×105 cell/well)를 24시간 동안 배양 한 후 lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/ml)를 처리하고, 분리한 β-sitosterol과 daucosterol을 각각 10, 20, 50 μM의 농도로 처리하고 12시간 동안 추가 배양하였다.

대상 데이터

7과 T림프구 세포주인 TK1을 사용하였다. RAW 264.7 세포주는 KCLB (Korean Cell Line Bank, Korea)에서 구입하였으며, TK-1 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 사용하였다. RAW 264.
건조된 산약(D. batatas)은 동우당제약에서 구입하여 10 kg 을 분쇄기로 분쇄한 후 60℃에서 MeOH 20 l로 3회 환류냉각 추출하고, 그 추출액을 rotary vacuum evaporator (Buchi, Switzerland)를 사용하여 감압농축하여 MeOH 추출물 840 g (yield: 8.4%)을 얻었다. MeOH 추출물 840 g을 증류수 15 l에 현탁시키고 동량의 Hexane을 첨가하여 상층부인 Hexane층과 수층을 분획하고 감압농축하여 Hexane 분획물 66.
본 실험은 대식세포주 RAW 264.7과 T림프구 세포주인 TK1을 사용하였다. RAW 264.
위에서 분리, 동정한 β-sitosterol 및 daucosterol을 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, USA)를 용매로 하여 농도별로 희석한 후 본 실험에 사용하였다.

데이터처리

본 실험에서 측정한 분석값은 평균±표준편차(S.D)로 표기하였다.
처리 간의 차이 유무를 확인하기 위한 통계학적 분석 은 SPSS version 12.0 (Chicago, USA) 프로그램을 이용하여 one-way ANOVA (analysis of variance) 분석을 하였고, Duncan’s test로 p<0.05 수준에서 통계학적 유의성을 검정하였다.

성능/효과

β-Sitosterol을 10, 20, 50 μM 농도로 처리한 RAW 264.7 세포는 90.4%, 93.6%, 87.82%의 세포 생존율을, TK-1 세포는 87.1%, 83.6%, 79.3%의 세포 생존율을 확인 하였다(Fig. 2A).
Daucosterol을 10, 20, 50 μM을 24시간 처리 시에 RAW 264.7은 98.0%, 91.3%, 84.8%의 세포 생존율을, TK1의 경우 99.5%, 100.3%, 98.6%의 세포 생존율을 나타냈다.
Daucosterol을 50 μM로 처리한 RAW 264.7 세포에서 85% 이상의 세포 생존율을 보였으며, TK-1 세포에서는 98.6% 이상의 생존율을 확인할 수 있었다.
Daucosterol을 RAW 264.7 세포에 10~50 μM로 각각 처리한 경우 COX-2, TNF-α, IL-6의 발현량은 0.7~1.2 fold 내에서 변화하는 것을 나타냈으며, 특이하게 iNOS의 경우는 0.8~0.18 fold로 발현양이 크게 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 3B).
LPS 처리 후 24시간 배양 시에 COX-2는 2.63 fold, TNFα는 3.74 fold, IL-6는 1.02 fold, iNOS는 14.95 fold 로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2B).
TK-1 세포에 daucosterol을 처리한 경우에는, 놀랍게도 TNFα, IL-6, iNOS의 발현량이 RT-PCR을 활용한 분석에서도 검출되지 않을 정도로 급격하게 감소한 것을 확인하였다(Fig. 4B).
결과적으로 β-sitosterol과 daucosterol의 각각 처리시에 50 μM 농도까지 80% 이상의 생존률을 나타내는 것을 확인하였다.
결과적으로 RAW 264.7 세포에 β-sitosterol 처리 시에는 LPS 처리에 따른 발현양보다 6-fold 이상으로 TNF-α의 발현이 더 증가하였으며 iNOS의 경우는 처리 농도 의존적으로 그 발 현유도양이 더 증가하고 있음을 확인하였다.
결과적으로 TK-1 세포에 고농도 β-sitosterol 처리 시 TNFα의 발현 증가를 0.2 fold 수준으로 현저하게 억제하고, iNOS 의 경우 저농도 처리시에는 감소하고 고농도 처리시에는 농도 의존적으로 발현양이 증가하는 것을 확인하였다.
결과적으로 본 연구에서 β-sitosterol은 RAW 264.7 세포에서 TNFα와 iNOS의 발현을 유도하여 면역 상승 효과에 관여하고 TK-1 세포에서는 농도의존적으로 iNOS 발현양의 상승과 TNFα 발현양의 감소를 유도하여 면역 억제 활성이 나타나는 것임을 제시하고 있다.
결과적으로, β-sitosterol 처리시에 RAW 264.7 세포에서의 염증반응은 염증 유도 인자의 발현 증가를 통하여 더욱 크게 유도되는 것으로 여겨진다.
결과적으로, TK-1에서도 LPS 처리에 의해 cytokine IL-6를 포함하여 염증 관련 인자인 TNF-α, iNOS의 발현이 크게 유도되고 있음을 확인하였다.
또한, iNOS의 경우는 10, 20, 50 μM β-sitosterol 의 처리 농도에 따라 각각 2.8, 4.8, 8.5 fold로 그 발현양이 각각 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 3A).
분리된 각 성분의 면역관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석하기에 앞서, LPS 처리로 염증반응을 유도한 결과, RAW 264.7 세포와 TK-1 세포 모두에서 TNF-α와 IL-6, 그리고 iNOS의 발현양이 24시간까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B).
은 RAW 264.7 세포에 저농도(8 μM, 16 μM) 의 β-sitosterol 처리시에는 IL-6의 분비량은 약간 증가하고, 160 μM 처리시에는 오히려 감소하고 있음을 보였으며, TNF-α 는 저농도 처리시에 거의 변화가 없으며 고농도(160 μM) 처리시에 약 2 fold로 증가하고 있음을 보고되어 본 연구결과에서 LPS 처리시의 발현양과 비교하여 β-sitosterol 처리시의 IL-6 의 발현증가양과 유사하였으며 TNF-α의 발현증가양은 일치 하는 것을 확인하였다[14].
이와 비교하여 본 연구에서는 T 세포 유래 TK-1에 β-sitosterol을 저농도로 처리했을 때 TNF-α와 IL-6는 2 fold 정도로 발현양이 증가하고 고농도 처리시에는 LPS만 처리한 대조군에 비교하여 오히려 감소하였다. 이에 반하여 iNOS의 발현양은 저농도 처리시에 감소하였으나 고농도 처리시에 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 3A). 참고로 β-sitosterol을 human aortic endothelial 세포에 처리했을 때 TNF-α의 발현과 상관없이 염증억제 효능이 있다는 결과도 보고된 바 있다[17].
이와 더불어서 daucosterol은 RAW 264.7 세포의 iNOS 발현양을 억제하고, TK-1 세포에서는 TNF-α, IL-6, iNOS 의 발현을 크게 억제함으로써 대식세포주와 T 림프구 세포주에서 모두 면역 억제 효능을 가지고 있음을 제시하였다.
이와 반대로 daucosterol의 처리시에는 TNF-α의 발현 유도를 LPS 처리시 발현양과 유사한 수준으로 억제하고, iNOS 유전자 발현 유도를 농도 의존적으로 LPS 처리시 발현양 수준 이하로 억제하고 있음을 확인하였다.
이와 비교하여 본 연구에서는 T 세포 유래 TK-1에 β-sitosterol을 저농도로 처리했을 때 TNF-α와 IL-6는 2 fold 정도로 발현양이 증가하고 고농도 처리시에는 LPS만 처리한 대조군에 비교하여 오히려 감소하였다.
종합하면 50 μM의 β-sitosterol 처리 시에는 모든 세포에서 80% 이상의 생존율을 보였다.
특이하게 iNOS의 경우 10 μM 처리 시에 0.3 fold 수준으로 그 발현양이 감소하였으나 RAW 264.7 세포에서와 동일하게 고농도인 50 μM 처리 시에 1.45 fold 이상으로 발현양이 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 4A).
하지만, 같은 방법으로 염증 관련 유전자의 유도발현양을 비교하였을 때, TK-1에 LPS를 24시간 동안 처리 후 COX-2는 1.03 fold, TNF-α 는 3.91 fold, IL-6는 2.62 fold, iNOS는 1.81 fold 수준으로 유전자 발현양이 증가하였다.

후속연구

최종적으로 면역증강, 면역 억제 및 염증 감소에 β-sitosterol, daucosterol이 미치는 영향에 대한 본 연구의 결과가 면역의 약품 소재 및 기능성 식품 소재로 활용될 수 있는 기초적인 정보를 제공할 것으로 사료된다[5, 11].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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