Objectives SJ004 is a natural herbal medicine that contains Acyranthes japonica Nakai and Eucommia ulmoides Oliver traditionally used for joint and spinal diseases. This study aimed to establish an efficient method of extracting SJ004 to standardize using the yield, high-performance liquid chromatog...
Objectives SJ004 is a natural herbal medicine that contains Acyranthes japonica Nakai and Eucommia ulmoides Oliver traditionally used for joint and spinal diseases. This study aimed to establish an efficient method of extracting SJ004 to standardize using the yield, high-performance liquid chromatography (HPLC), and antioxidant assay. Methods SJ004 was extracted with distilled water, 70% and 100% of ethyl alcohol (EtOH). The method validation of 20-hydroxyecdysone and pinoresinol diglucoside was determined by HPLC-photo diode array and the content of SJ004 was calculated. The antioxidant activity of each extract was compared and measured using total flavonoids, total phenolic compounds, 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), and ferric reducing antioxidant power according to the standard protocol. Results The yield was highest in pure water extract and lowest in 100% EtOH. But, the content of marker compounds indicating 20-hydroxyecdysone and pinoresinol diglucoside was highest in 100% EtOH extract. In the physiological activity measurement using antioxidant activity, 100% ethanol extract was highest. The limit of detection indicating 20-hydroxyecdysone and pinoresinol diglucoside were analyzed 0.33 ㎍/mL, 0.1616 ㎍/mL, and the limit of quantification were analyzed 1.01 ㎍/mL and 0.49 ㎍/mL respectively. Conclusions The experimental results showed that the extraction conditions have a significant effect on content of marker compounds and antioxidant activity. As a result of method validation, SJ004 was standardized by 20-hydroxyecdysone and pinoresinol diglucoside.
Objectives SJ004 is a natural herbal medicine that contains Acyranthes japonica Nakai and Eucommia ulmoides Oliver traditionally used for joint and spinal diseases. This study aimed to establish an efficient method of extracting SJ004 to standardize using the yield, high-performance liquid chromatography (HPLC), and antioxidant assay. Methods SJ004 was extracted with distilled water, 70% and 100% of ethyl alcohol (EtOH). The method validation of 20-hydroxyecdysone and pinoresinol diglucoside was determined by HPLC-photo diode array and the content of SJ004 was calculated. The antioxidant activity of each extract was compared and measured using total flavonoids, total phenolic compounds, 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), and ferric reducing antioxidant power according to the standard protocol. Results The yield was highest in pure water extract and lowest in 100% EtOH. But, the content of marker compounds indicating 20-hydroxyecdysone and pinoresinol diglucoside was highest in 100% EtOH extract. In the physiological activity measurement using antioxidant activity, 100% ethanol extract was highest. The limit of detection indicating 20-hydroxyecdysone and pinoresinol diglucoside were analyzed 0.33 ㎍/mL, 0.1616 ㎍/mL, and the limit of quantification were analyzed 1.01 ㎍/mL and 0.49 ㎍/mL respectively. Conclusions The experimental results showed that the extraction conditions have a significant effect on content of marker compounds and antioxidant activity. As a result of method validation, SJ004 was standardized by 20-hydroxyecdysone and pinoresinol diglucoside.
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문제 정의
본 연구는 SJ004 (두충, 우슬 복합 추출물)를 추출할 때 효능이 높고 표준화가 가능한 효율적인 추출 용매를 설정하는 것을 목표로 하였다.
. 본 연구에서는 환자들에게 처방하여 효능을 보였던 조합을 사용하였으며, 어떤 용매로 추출하였을 때 가장 효율적인 지를 확인하고자 하였다. 추출 수율은 추출 온도, 시간, 압력 등 여러 조건에 따라 달라질 수 있는데 본 실험에서 진행한 SJ004의 추출방식에서는 증류수 추출이 가장 높은 수율을 보였고 100% 주정 추출이 가장 낮은 수율을 보였지만, 지표성분의 함량은 100% 주정 추출물이 2.
이에 본 연구에서는 관절 및 척추질환에 우수한 조합인 우슬과 두충 혼합 처방(SJ004)의 추출 용매별 효능과 최적의 추출법을 확인하여 표준화의 기틀을 정립하고자 하였다. 다양한 활성 성분을 함유하고 있는 한약재의 경우 추출할 때의 물리적 또는 화학적인 차이에 의하여 생리 활성, 효능의 범위, 활성 성분의 함량, 수율 등의 차이가 있을 수 있다.
제안 방법
20-hydroxyecdysone 표준품을 1.25, 5, 20 ppm 농도별로 희석하여 준비하고 pinoresinol diglucoside 표준품을 3.3125, 13.25, 53 ppm 농도별로 희석하여 준비한 일내분석과 일간분석에서 정밀성과 정확성을 측정하였다. 일내분석은 하루 동안 표준품을 3회 반복하여 분석하였으며, 일간분석은 일내분석의 과정을 3일동안 반복하여 분석하였다.
5, 125, 250 ㎍/mL의 농도로 희석하여 사용하였고, 각각의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 그렸다. Ferric reducing ability of plasma (FRAP) 활성은 총 페놀 함량 측정과 동일한 방법으로 계산하였다.
일내분석은 하루 동안 표준품을 3회 반복하여 분석하였으며, 일간분석은 일내분석의 과정을 3일동안 반복하여 분석하였다. HPLC를 분석하여 상대표준편차(%; rel-ative standard deviation, RSD)를 구해 정밀성을 측정하였고, 회수율(%)을 구하여 정확성을 평가하였다.
5, 53, 106 ppm 농도별로 희석하여 준비하였다. HPLC를 분석하여 표준곡선을 그려 검량선을 구해 직선성의 상관계수(R2값)를 확인하였다. Limit of detection (LOD)와 limit of quantitation (LOQ)는 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법으로 구하였으며 식은 아래와 같다.
의 방법을 응용하여 측정하였다. SJ004의 100% 주정, 70% 주정, 증류수 추출물 동결건조 분말을 모두 0.5, 1.0, 2.0 ㎎/mL의 농도의 메탄올로 희석하여 준비하였다. 검액 50 μL와 증류수를 이용하여 제조한 2% Na2CO3 1 mL를 혼합한 후 2분간 반응시켰다.
5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 희석하여 사용하였고, 각각의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 그렸다. 검액의 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 총 페놀 화합물을 계산하였다. 표준곡선의 R2값은 0.
다파장 검출기를 이용하여 분석한 후 245 nm으로 추출하여 확인하였다. 두충의 지표성분인 pinoresinol digluco-side는 C18 ODS 컬럼을 이용하였으며, 이동상은 0.1% formic acid의 물(A)과 ACN (B)를 기울기 조건으로 하여 5% (B)로 시작하여 20분까지 20% (B), 25분까지 20% (B), 30분까지 5% (B)로 하여 1 mL/min으로 유지하였다. 검출기의 파장은 230 nm으로 분석하였다.
SJ004의 구성 약재인 두충, 우슬을 분쇄기를 이용하여 각각 분말화한 후 1 : 1 비율로 총 30 g을 칭량하여 준비하였다. 용매는 100%, 70% 주정, 증류수를 약재 총량의 5배수로 준비하였고 각각 1시간동안 환류추출하였다. 추출 후 각 추출물들은 1 ㎛ 필터페이퍼를 사용하여 여과하였다.
68 ㎎/mL의 농도로 희석하여 준비하였다. 우슬의 지표성분인 20-hydroxyecdysone은 C18 ODS (25 ㎝ * I.D 5.0 ㎛; Agilent Technologies, Inc., Charlotte, NC, USA) 컬럼을 이용하였으며, 이동상은 0.08% formic acid의 물과 ACN을 17 : 3 비율로 혼합한 용액을 기울기 조건 없이 1 mL/min으로 유지하였다. 다파장 검출기를 이용하여 분석한 후 245 nm으로 추출하여 확인하였다.
인체에 무해한 용매를 사용하기 위하여 주로 물을 사용하며, 정제를 하는 경우에도 휘발성이 강하고 독성이 거의 없는 주정을 주로 사용한다. 이에 추출 용매를 물과 주정의 비율을 조절하며 비교하였다.
25, 53 ppm 농도별로 희석하여 준비한 일내분석과 일간분석에서 정밀성과 정확성을 측정하였다. 일내분석은 하루 동안 표준품을 3회 반복하여 분석하였으며, 일간분석은 일내분석의 과정을 3일동안 반복하여 분석하였다. HPLC를 분석하여 상대표준편차(%; rel-ative standard deviation, RSD)를 구해 정밀성을 측정하였고, 회수율(%)을 구하여 정확성을 평가하였다.
의 방법을 이용하여 측정하였다. 증류수를 이용하여 제조한 7.4 mM ABTS와 에탄올을 이용하여 제조한 potassium persul-fate를 동량 혼합한 후 암상태의 실온에서 12시간 반응시켜 ABTS+를 형성시켰다. Micro plate reader로 750 ㎚에서 흡광도를 측정하여 값이 0.
직선성에서 얻은 검량선의 방정식에 샘플의 HPLC 크로마토그램에서 얻은 피크면적 값을 대입하여 함량 값을 구하였다.
표준물질로 gal-lic acid를 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 희석하여 사용하였고, 각각의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 그렸다.
Micro plate reader를 이용하여 593 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 trolox를 3.9, 7.81, 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250 ㎍/mL의 농도로 희석하여 사용하였고, 각각의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 그렸다. Ferric reducing ability of plasma (FRAP) 활성은 총 페놀 함량 측정과 동일한 방법으로 계산하였다.
Micro plate reader를 이용하여 750 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 trolox를 7.81, 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 ㎍/mL의 농도로 희석하여 사용하였고, 각각의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 그렸다. ABTS 라디칼 소거 활성은 총 페놀 함량 측정과 동일한 방법으로 계산하였다.
혼합액 190 μL와 검액 10 μL를 vortex로 충분히 혼합한 후 암상태의 실온에서 30분간 반응시켰다.
대상 데이터
20-hydroxyecdysone, pinoresinol diglucoside 표준품은 식품의약품안전처(Cheongju, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Acetonitrile (ACN)과 water는 이동상으로 사용되며, high-performance liquid chromatography (HPLC) grade로 Honeywell International, Inc.
20-hydroxyecdysone, pinoresinol diglucoside 표준품은 식품의약품안전처(Cheongju, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Acetonitrile (ACN)과 water는 이동상으로 사용되며, high-performance liquid chromatography (HPLC) grade로 Honeywell International, Inc. (Charlotte, NC, USA)의 제품을 사용하였고, formic acid는 Junsei Chemical Co. (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 항산화 실험에 사용된 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), potassium persulfate, acetic acid, 2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s- triazine (TPTZ), FeCl3⋅6H2O, trolox, gallic acid는 Sigma-Aldrich Co.
본 연구에 사용한 두충과 우슬은 녹원제약(Seoul, Korea)에서 구입하였으며 식품의약품안전처에서 인증한 우수 한약 제조 및 품질 관리 기준이 적용된 한약재를 사용하였다. SJ004의 구성 약재인 두충, 우슬을 분쇄기를 이용하여 각각 분말화한 후 1 : 1 비율로 총 30 g을 칭량하여 준비하였다. 용매는 100%, 70% 주정, 증류수를 약재 총량의 5배수로 준비하였고 각각 1시간동안 환류추출하였다.
1% formic acid의 물(A)과 ACN (B)를 기울기 조건으로 하여 5% (B)로 시작하여 20분까지 20% (B), 25분까지 20% (B), 30분까지 5% (B)로 하여 1 mL/min으로 유지하였다. 검출기의 파장은 230 nm으로 분석하였다.
08% formic acid의 물과 ACN을 17 : 3 비율로 혼합한 용액을 기울기 조건 없이 1 mL/min으로 유지하였다. 다파장 검출기를 이용하여 분석한 후 245 nm으로 추출하여 확인하였다. 두충의 지표성분인 pinoresinol digluco-side는 C18 ODS 컬럼을 이용하였으며, 이동상은 0.
본 연구에 사용한 두충과 우슬은 녹원제약(Seoul, Korea)에서 구입하였으며 식품의약품안전처에서 인증한 우수 한약 제조 및 품질 관리 기준이 적용된 한약재를 사용하였다. SJ004의 구성 약재인 두충, 우슬을 분쇄기를 이용하여 각각 분말화한 후 1 : 1 비율로 총 30 g을 칭량하여 준비하였다.
본 연구의 모든 실험결과는 같은 조건으로 3회 반복실험을 통해 평균±표준편차(mean±standard deviation)로 결과 값을 내었다.
05)에서 검증하였다. 본 연구의 통계는 IBM SPSS Statistics 22 프로그램(IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 사용하였고, 통계기법은 analysis of variance paired t-test법으로 구하였다.
이론/모형
ABTS free radical 소거능은 Arnao 등25)의 방법을 이용하여 측정하였다. 증류수를 이용하여 제조한 7.
Fe2+chelate 활성은 Benzi법을 변형한 방법26)에 따라 측정하였다. 증류수를 이용하여 제조한 acetate buffer, 40 mM HCl을 이용하여 제조한 10 mM TPTZ와 증류수를 이용하여 제조한 20 mM Fecl3⋅6H2O 용액을 준비하여 10 : 1 : 1 비율로 혼합한 후 35℃ incubator에서 사용 직전까지 보관하였다.
, Tokyo, Japan)을 사용하였다. Micro plate reader는 EPOCH2모델(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)을 사용하였으며 HPLC는 LC-20A, CBM-20A, LC-20AT, SIL-20AC, CTO-20AC, DGU-20A5R, SPD-M20A, LC-PDA 모델(Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 사용하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 동결건조기는 Lyoph-Pride03모델(Ilsinbiobase Co., Yangju, Korea)을, 감압 농축기는 N2110 모델(Eyela Co., Tokyo, Japan)을 사용하였다. Micro plate reader는 EPOCH2모델(BioTek Instruments, Inc.
성능/효과
1. SJ004는 추출 용매에 따라 최종 수율이 증류수(27.45%), 70% 주정(23.73%), 100% 주정(10.35%)의순으로 낮게 나타났다. 조제 수율을 고려하였을 때100% 주정은 수율이 낮아 추출 용매로 선정하기에무리가 있었다.
밸리데이션 결과 표준곡선의 직선성은 상관계수가 모두 1.000으로 나타났으며, 정량한계와 검출한계 모두 5 μg/mL보다 낮아 정상적인 범위에서 분석이 이루어졌음을 확인할 수 있었다.
우슬의 20-hydroxyecdysone, 두충의 pinoresinol diglucoside 각각 정확성은 ±5% 이내의 편차를 보여 지표물질로서 손색이 없음을 확인하였다.
직선성에서 얻은 검량선의 방정식에 증류수, 70% 주정, 100% 주정으로 추출한 각 샘플의 피크면적 값을 대입하여 계산한 결과 20-hydroxyecdysone은 각각 0.692±0.002, 0.674±0.002, 2.682±0.011 ㎎/g의 함량을 보였으며, pi-noresinol diglucoside는 각각 1.771±0.004, 1.575±0.012, 6.821±0.015 ㎎/g의 함량을 보였다(Table Ⅳ).
본 연구에서는 환자들에게 처방하여 효능을 보였던 조합을 사용하였으며, 어떤 용매로 추출하였을 때 가장 효율적인 지를 확인하고자 하였다. 추출 수율은 추출 온도, 시간, 압력 등 여러 조건에 따라 달라질 수 있는데 본 실험에서 진행한 SJ004의 추출방식에서는 증류수 추출이 가장 높은 수율을 보였고 100% 주정 추출이 가장 낮은 수율을 보였지만, 지표성분의 함량은 100% 주정 추출물이 2.682 ㎎/g의 값으로 가장 높게 추출되었다28). 이는 용매를 물로 추출하거나 장시간 고온으로 끓였을 때에는 전분이 다량으로 검출된다는 보고와 동일하게 전분같은 무효 물질들이 더 많이 추출된 것으로 생각된다29).
항산화 활성에서는 총 페놀 화합물, ABTS, FRAP 각각 100% 주정 추출물이 70% 주정, 증류수 추출물보다 높은 활성을 보였다. 이는 Na 등30)의 보고와 같이 증류수 추출보다 에탄올을 추출했을 때의 폴리페놀 함량이 증가한 것은 일치하였으나, Lee 등31)의 홍삼을 에탄올 추출 조건으로 끓였을 때 페놀성 화합물이 EtOH 농도 80% 이상 추출했을 때 감소하였다는 연구와 다른 경향을 보였다.
효율적인 추출용매를 선정하기 위하여 확인한 수율, 항산화능, 지표성분 밸리데이션에서 기대되는 생리활성은 100% 주정 추출물이 가장 우수하지만, 조제적인 측면에서 수율을 고려하면 70% 주정 추출물이 가장 효율적이었다.
후속연구
선정된 용매에서 유효성을 더 높이기 위하여 용매 및 open column 등의 분획 연구가 더 필요하다. 본 연구에서 진행한 항산화 활성은 생리 활성의 정도를 측정하기 위함이지 구체적인 세포실험 또는 동물실험이 아니기에 임상 적용에는 한계를 보인다. 하지만 활성산소에 대해서는 최근 여러 매체를 통해 알려진 바로 폐, 심장혈관 계통, 콩팥, 간, 혈액, 피부, 눈 등 다양한 부위에서 질병 및 부상이 나타나는데 항산화 기능을 가진 한약재 추출물이 염증 및 통증을 감소시킨다는 연구들이 보고되고 있기 때문에 항염증 및 항통증에 대한 근거가 될 수 있었다32-34).
이처럼 지속적인 세포실험 및 동물실험의 진행을 통해 해당 물질의 기전을 규명하여 효능에 대한 정확한 근거를 갖출 필요가 있다. 한방의료기관에서 조제 시마다 동일한 약을 만들기 위해 지표물질의 분석법 및 타당성을 확인하고 유효성을 확인하기 위한 연구를 지속해서 보완하는 작업을 시행하는 것은 SJ004의 가치를 높여줄 뿐 아니라, 한약이 표준화, 과학화로 나아가는 발걸음이 될 것이다.
이는 Na 등30)의 보고와 같이 증류수 추출보다 에탄올을 추출했을 때의 폴리페놀 함량이 증가한 것은 일치하였으나, Lee 등31)의 홍삼을 에탄올 추출 조건으로 끓였을 때 페놀성 화합물이 EtOH 농도 80% 이상 추출했을 때 감소하였다는 연구와 다른 경향을 보였다. 한약재의 종류에 따라 적합한 추출방법과 전처리를 적용함으로써 높은 항산화 활성을 가진 추출물을 얻는 것이 가능할 것이라 판단된다.
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