[논문]LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 오성탕(五聖湯) 추출물의 항염증 및 항산화 연구

김소정; 김태준; 김이화; 김용민

doi:10.6114/jkood.2020.33.1.001

LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 오성탕(五聖湯) 추출물의 항염증 및 항산화 연구
Anti-inflammatory and Anti-oxidant Studies of Osung-tang Extracts in LPS-Induced RAW 264.7 Cells 원문보기

韓方眼耳鼻咽喉皮膚科學會誌 = The journal of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology, v.33 no.1, 2020년, pp.1 - 11

김소정 (세명대학교 화장품뷰티생명공학부) , 김태준 (세명대학교 한의과대학 한방안이비인후피부과) , 김이화 (세명대학교 한의과대학 경락경혈학교실) , 김용민 (세명대학교 화장품뷰티생명공학부)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The purpose of this study was to investigate the anti-inflammatory and anti-oxidative effects of Osung-tang(OST) extract. Methods : MTT assay was performed to confirm the survival rate of RAW 264.7 cells treated with OST extract(50-400㎍/㎖) and the production of NO from LPS-induced RAW 264.7 cells was confirmed. The mRNA expression of iNOS, COX-2, and NF-κB were measured by real-time PCR. The protein expression of iNOS, COX-2 and p-IκB were measured by western blot and the anti-oxidant activity of OST extract(50-400㎍/㎖) was investigated by measuring DPPH scavenging activity. Results : OST extract showed a cell survival rate of 90% or more at 50-400㎍/㎖. The NO production was inhibited in a dose-dependent manner in RAW 264.7 cells treated with LPS on OST treated group. mRNA expression levels of iNOS, COX-2 and NF-κB decreased in a concentration-dependent manner after treatment with OST(50-400㎍/㎖). Protein expression levels of iNOS, COX-2 and p-IκB decreased in a concentration-dependent manner after treatment with OST(50-400㎍/㎖). It was found that OST has a high free-radical scavenging ability. Conclusions : These results suggest that OST extract can be used as a treatment for various skin diseases by demonstrating its anti-inflammatory and anti-oxidant effects.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Contents of OST
표 Table 2. Gene Name and Assay ID Number in realtime PCR Analysis
그림 Fig. 1. The Effect of Osung-tang(OST) on cell viability in RAW 264.7 macrophage cells.
그림 Fig. 3. Effect of OST on LPS-induced iNOS, COX-2 and NF-κB mRNA expressions in RAW 264.7 macrophage cells.
그림 Fig. 2. Effect of OST on NO production in LPS-induced RAW 264.7 macrophage cells.
그림 Fig. 4. Effect of OST on LPS-induced iNOS, COX-2 and p-IκB protein expressions in RAW 264.7 macrophage cells.
그림 Fig. 5. Effect of OST on DPPH radical scavenging test.

AI 본문요약
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문제 정의

OST를 구성하는 개별 약재들의 항염효과는 상술한 것과 같이 연구가 되어있으나, 개별 약재들의 복합물 인 OST의 경우 선행 연구가 1례도 확인되지 않았다. 이에 본 연구는 LPS로 유도된 RAW264.7 cells에서 열수 추출된 OST의 항염증 효과와 항산화 효과를 평가하였다.
이에 본 연구는 OST에 대한 항염증 및 항산화 효과를 확인하고자 대식세포의 NF-κB 경로 억제 및 염증반응에서 생성되는 자유기의 소거능을 밝히고자 한다.

제안 방법

Tris Buffered Saline with Tween 20(TBST)로 washing 한 뒤 secondary antibody(Cell signaling, USA)를 2% skim milk와 1 : 10,000의 비율로 희석하여 2시간 동안 shaking 해주었다. 2시간이 지난 뒤 TBST로 washing 후 발현된 단백질을 측정하였다.
DPPH(Sigma, USA) 용액으로 OST의 radical 소거 능력을 실험하였다. 99% methanol (Honey well, USA)과 증류수를 1 : 1의 비율로 섞은 용액에 OST를 최종농도 50, 100, 200, 400㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 각각 만들어진 시료를 50㎕씩 취하여 DPPH (250mM) 50㎕와 혼합한 뒤 실온에서 빛을 차단하고 30분 반응 후 spectrophotometer를 이용하여 517㎚ 에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH(Sigma, USA) 용액으로 OST의 radical 소거 능력을 실험하였다. 99% methanol (Honey well, USA)과 증류수를 1 : 1의 비율로 섞은 용액에 OST를 최종농도 50, 100, 200, 400㎍/㎖가 되도록 첨가하였다.
DPPH를 사용하여 radical 소거율을 측정하였다. OST를 농도별로 50, 100, 200 및 400㎍/㎖를 처리한 결과 radical 소거율이 79.
LPS 자극에 의해 염증반응이 유도된 세포에서 OST 가 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 mRNA발현에 미치는 영향을 real-time PCR로 조사하였다.
LPS(Sigma, USA)로 염증이 유도된 RAW 264.7 cells을 사용하여 NO의 생성능을 측정했다. RAW 264.
과도하게 생성된 NO는 toxic radical로 작용하여 세포나 조직의 손상을 일으켜 염증 질환에 있어서 NO가 염증을 유발하는 인자로 생각되기도 한다 ²⁰⁾. LPS로 유도 된 RAW 264.7 세포에서 NO assay를 이용하여 NO의 생성량을 측정하였다. LPS만 처리한 군에 비해 LPS와 한방안이비인후피부과학회지 제33권 제1호(2020년 2월) OST을 동시에 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO의 생성이 감소하는 것을 확인하였다[Fig.
LPS로 유도된 RAW 264.7 cells에서 western blotting을 사용하여 염증 매개 단백질인 iNOS, COX-2 및 p-IκB의 발현 양을 확인하였다.
Membrane(Amersham™ Hybond™ P 0.45 μM PVDF; GE Healthcare Life Sciences, UK)을 95% ethanol (DUKSAN, Korea)에 활성화시켜 transfer를 진행하였다.
7 cells에서의 OST의 NO 생성 저해 효과를 측정하였다. OST 농도 50, 100, 200 및 400㎍/ ㎖와 LPS(1㎍/㎖)를 동시에 처리 후 LPS만 처리한 군과 비교하였다. NO의 생성율은 LPS만 처리한 군에선 441.
7 대식세포를 5×10 5cells/well로 6-well plate에 분주한 뒤 37℃, 5% CO 2 incubator에 24시 간 동안 안정화시켰다. OST를 농도별(50, 100, 200, 400㎍/㎖)로 LPS(1㎍/㎖)와 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 lysis buffer를 첨가해 세포를 용해시킨 후 원심분리 하여 세포막 성분들을 제거하였다.
RAW 264.7 cells에서의 OST의 NO 생성 저해 효과를 측정하였다. OST 농도 50, 100, 200 및 400㎍/ ㎖와 LPS(1㎍/㎖)를 동시에 처리 후 LPS만 처리한 군과 비교하였다.
cDNA 합성 후 TaqMan™ probe, 멸균수, primer를 넣고 정량한 cDNA를 혼합하여 total volume을 20㎕로 맞추었다.
99% methanol (Honey well, USA)과 증류수를 1 : 1의 비율로 섞은 용액에 OST를 최종농도 50, 100, 200, 400㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 각각 만들어진 시료를 50㎕씩 취하여 DPPH (250mM) 50㎕와 혼합한 뒤 실온에서 빛을 차단하고 30분 반응 후 spectrophotometer를 이용하여 517㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성비교를 위해 positive control 시약으로 ascorbic acid (Sigma, USA)를 사용하였다.
7 cells를 6-well plate에 5×105 cells/well이 되도록 분주하고 24시간동안 37℃, 5% CO2가 공급되는 배양기에서 안정화시켰다. 그 후 LPS(1㎍/㎖)와 OST을 농도별(50, 100, 200 및 400㎍ /㎖)로 1㎖씩 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 상층액을 제거하고 1× PBS buffer로 1회 세척하였다.
그 후 iNOS, COX-2 및 NF-κB를 확인하였다.
얻은 단백질은 BCA assay(Thermo fisher, USA)를 이용하여 정량하였다. 단백질을 5X SDS-PAGE Loading dye (Biosolution, Korea)을 사용하여 염색해준 뒤 전기영동 시켰다. Membrane(Amersham™ Hybond™ P 0.
LPS 처리 군은 iNOS, COX-2와 p-IκB의 발현이 증가하였고, OST를 50, 100, 200 및 400㎍/㎖로 처리한 군들에서 iNOS, COX-2와 p-IκB의 발현이 LPS만 처리한 군에 비해 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타냈다. 발현 된 단백질의 진하기 정도는 image J를 이용한 image analysis를 통해 확인하였다. 따라서 OST은 RAW 264.
배양 시 배지는 10% fetal bovine serum(FBS: GenDEPOT, USA)과 1% penicillin/streptomycin(GenDEPOT, USA)이 첨가된 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM: GenDEPOT, USA)을 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 안정화시켰다.
상층액 제거 후 OST 시료를 농도별(50, 100, 200, 400 μg/㎖로 100㎕씩 넣고 24시간 동안 배양하였다.
7 cells를 96-well plate에 5×10 4cells/well이 되도록 분주한 뒤, 24시간동안 37℃, 5% CO 2 조건에 서 안정화시켰다. 상층액을 제거하고 LPS(1㎍/㎖)와 시료를 농도별(50, 100, 200, 400㎍/㎖)로 동시에 처리하여 배양하였다. 24시간 후 배양한 상등액 100㎕을 다른 96well plate에 옮겨 준 뒤 Griess reagent (Sigma, USA) 100㎕를 섞어 30분 동안 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
배양 후 상층액을 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO)로 세포를 용해시켰다. 생성된 formazan을 spectro-photometer(SpectraMax 190; Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA)를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였고, OST의 효과를 판정하기 위한 통계학적 분석은 student t-test를 통하여 비교 분석하였다. 시료의 농도를 각 50, 100, 200 및 400㎍/㎖ 처리한 군과 대조군과 비교하였다.
정량한 RNA는 TOYOBO Revetra ACE-α® FSK101(TOYOBO, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하고 분석에 사용하였다.

대상 데이터

OST에 사용된 약재는 ㈜HMAX에서 구입하여 사용하였다. 구입한 약재들은 다음과 같다[Table 1].
본 연구에 사용한 세포주인 RAW 264.7 macrophage cells은 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하여 사용하였다. 배양 시 배지는 10% fetal bovine serum(FBS: GenDEPOT, USA)과 1% penicillin/streptomycin(GenDEPOT, USA)이 첨가된 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM: GenDEPOT, USA)을 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 안정화시켰다.

데이터처리

모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였고, OST의 효과를 판정하기 위한 통계학적 분석은 student t-test를 통하여 비교 분석하였다.

이론/모형

세포 생존율 측정은 3-(4, 5-dimethylthiazol-2yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay 로 진행하였다. RAW 264.
그 후 lysis buffer를 첨가해 세포를 용해시킨 후 원심분리 하여 세포막 성분들을 제거하였다. 얻은 단백질은 BCA assay(Thermo fisher, USA)를 이용하여 정량하였다. 단백질을 5X SDS-PAGE Loading dye (Biosolution, Korea)을 사용하여 염색해준 뒤 전기영동 시켰다.

성능/효과

1. OST를 염증매개물질 억제효과를 확인하기 위하여 마우스 대식세포인 RAW 264.7 cells에 OST를 50~400㎍/㎖의 농도별로 처리한 결과 세포독성은 없었다.
2. RAW 264.7 cells에 LPS를 처리하여 증가된 NO의 생성과 사이토카인을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시킨 것을 확인할 수 있었다.
3. OST는 LPS에 의해 유도된 iNOS 및 COX-2, NFκB의 mRNA 발현과 iNOS와 COX-2, p-IκB의 단 백질 발현을 유의성 있게 감소시켰다.
4. OST는 DPPH radical 소거 활성에 미치는 효과에 서도 농도 의존적으로 증가시켰다.
LPS 처리 군은 iNOS, COX-2와 p-IκB의 발현이 증가하였고, OST를 50, 100, 200 및 400㎍/㎖로 처리한 군들에서 iNOS, COX-2와 p-IκB의 발현이 LPS만 처리한 군에 비해 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타냈다.
7 세포에서 NO assay를 이용하여 NO의 생성량을 측정하였다. LPS만 처리한 군에 비해 LPS와 한방안이비인후피부과학회지 제33권 제1호(2020년 2월) OST을 동시에 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO의 생성이 감소하는 것을 확인하였다[Fig. 2].
LPS와 OST을 농도별 로 처리한 군에선 421.38 ± 14.58%, 399 ± 26.16%, 355.53 ± 33.67%, 337.84 ± 17.48%으로 나타나 LPS 처리군에 비하여 농도 의존적으로 감소하 였다[Fig. 2].
NO의 생성율은 LPS만 처리한 군에선 441.52 ± 32.34% 증가하였다.
OST를 농도별로 50, 100, 200 및 400㎍/㎖를 처리한 결과 radical 소거율이 79.47 ± 0.84%, 109.06 ± 1.15%, 135.96 ± 0.45% 및 136.95 ± 0.31%로 농 도 의존적으로 증가함을 나타냈다[Fig. 5].
OST을 각각 50, 100, 200, 400㎍/㎖의 농도로 처리한 RAW 264.7 세포의 생존율을 확인한 결과 control군에 비해 93.04 ± 3.45%, 93.36 ± 1.80%, 101.22 ± 2.51%, 111.20 ±1.09%으로 나타났다.
Free radical에 의한 과산화 반응은 세포막의 투과성을 증가시키고 전반적인 세포독성을 초래하여 노 화 현상이나 여러 가지 질환의 병리현상을 유도함으로 써 발암 과정에도 관여한다^25,26) . OST의 항산화 효과를 입증하기 위해 DPPH를 진행한 결과, positive control인 ascorbic acid는 radical 소거능이 143.45%로 나타났고 OST은 농도 의존적으로 소거능 이 증가하여 최고 농도인 400㎍/㎖에선 136.95%까지 나타났다[Fig. 5].
RAW 264.7 세포에 LPS와 OST을 동시에 처리하여 iNOS와 COX-2, NF-κB의 mRNA 발현을 realtime PCR로 확인한 결과, LPS에 의해 증 가된 iNOS와 COX-2 및 NF-κB가 OST에 의해 감소되는 것을 확인하였다[Fig. 3].
09%으로 나타났다. RAW 264.7 세포에서 OST 추출물 50-400㎍/㎖의 농 도범위에서 독성이 없음을 확인하였다[Fig. 1].
iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현이 감소하는 것으로 보아 OST은 염증매개물질인 NF-κB 발현 저해를 통해 iNOS와 COX-2를 억제시켜 항염증 효능을 나타냈다[Fig. 3].
따라서 OST은 RAW 264.7 cells에서 mRNA 수준과 비슷하게 iNOS, COX-2와 p-IκB의 단백질 발현을 감소시키는 것으로 확인되었다[Fig. 4].
이상의 결과는 OST가 LPS로 유도된 염증성 RAW 264.7 세포에서 염증반응을 억제하고 DPPH radical 소거 활성을 통해 항산화 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 OST의 염증억제 효과와 항산화 효과는 항원 혹은 자극물질의 자극 후 면역세포의 활성화로 cytokine 이 분비되며 염증세포의 침윤이 일어남으로써 발생하는 만성 염증성 피부 질환에 응용할 수 있을 것으로 판단된다.

후속연구

OST는 NF-κB를 억제함으로써 iNOS, NO 등을 억제할 수 있으며, 이런 측면에서 아토피피부염 등을 포함한 다양한 만성 염증성 피부 질환 에 대한 치료 소재로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
7 세포에서 염증반응을 억제하고 DPPH radical 소거 활성을 통해 항산화 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 OST의 염증억제 효과와 항산화 효과는 항원 혹은 자극물질의 자극 후 면역세포의 활성화로 cytokine 이 분비되며 염증세포의 침윤이 일어남으로써 발생하는 만성 염증성 피부 질환에 응용할 수 있을 것으로 판단된다. 만성 염증성 피부 질환 중 하나인 아토피피부염은 만성염증의 재발이 지속되는 만성재발성 습진의 일종으로 여러 면역 기전의 이상반응으로 발생하는 질환이다²⁷⁾.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	지속적인 염증반응은 인체에 어떤 영향을 미치는가?	염증반응이란, 체내에 바이러스 같은 외부 유해물질이 유입되는 경우, 면역세포가 이를 인지하여 다양한 염증매개물질을 분비해 몸을 보호해주는 기전이다. 그러나 지속적인 염증반응은 점막 손상을 촉진시켜 통증, 부종, 발작, 발열 등을 일으켜 기능장애를 유발한다1). 내독소로 잘 알려진 lipopolysaccharide(LPS)는 그람 -음성균의 세포외막에 존재하고, 대식세포 표면의 toll-like receptor4(TLR4)에 의해 인지되어 주요한 염증의 원인으로 작용한다 2).
	LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 오성탕(五聖湯) 추출물의 항염증 및 항산화 연구 radical 소거능 실험한 결과는 어떠한가?	1. OST를 염증매개물질 억제효과를 확인하기 위하여 마우스 대식세포인 RAW 264.7 cells에 OST를 50~400㎍/㎖의 농도별로 처리한 결과 세포독성은 없었다. 2. RAW 264.7 cells에 LPS를 처리하여 증가된 NO의 생성과 사이토카인을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시킨 것을 확인할 수 있었다. 3. OST는 LPS에 의해 유도된 iNOS 및 COX-2, NFκB의 mRNA 발현과 iNOS와 COX-2, p-IκB의 단 백질 발현을 유의성 있게 감소시켰다. 4. OST는 DPPH radical 소거 활성에 미치는 효과에 서도 농도 의존적으로 증가시켰다.
	염증반응이란 무엇인가?	염증반응이란, 체내에 바이러스 같은 외부 유해물질이 유입되는 경우, 면역세포가 이를 인지하여 다양한 염증매개물질을 분비해 몸을 보호해주는 기전이다. 그러나 지속적인 염증반응은 점막 손상을 촉진시켜 통증, 부종, 발작, 발열 등을 일으켜 기능장애를 유발한다1).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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