[논문]18α-Glycyrrhetinic acid의 위암 세포 사멸 효과에 관한 연구

김정남; 김병주

doi:10.14374/hfs.2020.28.1.63

18α-Glycyrrhetinic acid의 위암 세포 사멸 효과에 관한 연구
18α-Glycyrrhetinic acid induces apoptosis of AGS human gastric cancer cells 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.28 no.1, 2020년, pp.63 - 70

김정남 (부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부) , 김병주 (부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The purpose of this study was to investigate the anti-cancer effects of 18α-Glycyrrhetinic acid (18α-GA), a hydrolyzed metabolite of glycyrrhizin, in AGS human gastric adenocarcinoma cells. Methods : We used human gastric adenocarcinoma cell line, AGS cells. We examined cell death by MTT assay and caspase 3 and 9 assay with 18α-GA. To examine the inhibitory effects of 18α-GA, sub-G1 analysis was done the AGS cells after 24 hours with 18α-GA. Also, to investigate the inhibitory mechanisms of 18α-GA, mitogen-activated protein kinase pathways and reactive oxygen species (ROS) generation were examined. Results : 1. 18α-GA inhibited the growth of AGS cells in a dose-dependent fashion. 2. Sub-G1 fractions were significantly and dose-dependently increased by 18α-GA. 3. 18α-GA increased the caspase 3 and 9 activities in AGS cells. 4. 18α-GA inhibited proliferation of AGS cells via the modulation of c‑Jun N‑terminal kinase (JNK) signaling pathways, which results in the induction of apoptosis. 5. 18α-GA enhanced ROS accumulation in AGS cells. Conclusions : Our findings provide insight into unraveling the effects of 18α-GA in human gastric adenocarcinoma cells and developing therapeutic agents against gastric cancer.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. 18α-GA inhibited the cell viability in AGS cells.
그림 Fig. 2. Effect of 18α-GA on AGS cell apoptosis.
그림 Fig. 3. 18α-GA increased the caspase 3 and 9 activities in AGS cells.
그림 Fig. 4. Effect of 18α-GA on the JNK and p42/44 MAPK pathway in AGS cells. MTT assays were used to determine cell viabilities in the presence of (A) SP600125 (JNK II inhibitor) or (B) PD98059 (a p42/44 MAPK inhibitor).
그림 Fig. 5. 18α-GA enhanced ROS accumulation in AGS cells.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 18α-GA에 의한 위암 세포인 AGS 세포에서의 항암작용을 조사해 보았다.
본 연구에서는 18α-GA의 위암세포에서의 효능 및 작용기전을 확인하는 기초적 연구를 수행하였다.

제안 방법

18α-GA에 의한 AGS세포 사멸에서 JNK와 p42/44 MAPK 기전 관련성을 알아보기 위해서 JNK 억제제인 SP600125와 p42/44 MAPK 억제제인 PD98059을 이용하여 MTT 방법으로 세포 사멸 변화여부를 알아보았다.
18α-GA에 의한 AGS세포 사멸에서 활성산소 발생 여부를 알아보기 위해서 형광 염색제 DCF-DA를 이용하였다.
18α-GA에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 flow cytometry를 이용한 세포 주기 sub-G1분석을 실시하였다.
18α-GA에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 농도별로 세포사멸의 진행 정도를 알아보았다.
18α-GA이 AGS세포의 증식을 억제하는데 있어서 세포주기의 어느 단계를 지연시키는지 flow cytometry 를 이용하여 분석하였다.
이 세포들은 37°C에서 30분 동안 20 μl DCF-DA로 처리되었고 PBS로 세척하였다. 488/525 nm의 excitation/emission 파장에서 FACS (BectonDickinson, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
AGS세 포의 ROS 생성은 DCF-DA (2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 측정하였다.
18α-GA을 첨가한 배지에서 3일간 배양된 AGS세포를 PBS용액으로 세척한 후, 4℃에서 30분간 70% ethanol로 고정하였다. 고정후 propidium iodide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 DNA를 염색하여 Becton Dickinson FACStar Flow Cytometry를 이용하여 세포주기를 비교 분석하였다.
세포 생존율 측정은 세포 배양판 (12-well)에 암세포를 3✕10 4 cells/well 씩 분주하여 24시간 이상 배양 후 18α-GA를 다양한 농도로 처리한 다음, 37℃, 5% CO2 하에서 48시간 또는 72시간 배양한 후, MTT용액 (5 mg/ml)을 배양액 최종 부피의 1/10되게 첨가하였다.

대상 데이터

Caspase 3 과 9 assay kits를 BioMol (Plymouth, PA, USA)에서 구입하여 측정하였다. 405 nm의 흡광도에서 여러 번 측정하였다.
실험에 사용한 18α-Glycyrrhetinic acid (18α-GA)는 시그마 알드리치 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 구입한 후 사용하였다.
이 실험에 사용한 인체 위암세포는 서울대학교 암세포주 은행에서 구입한 위암 세포주 AGS이며, adenocarcinoma의 histopathology 특징을 나타내고 있다.

데이터처리

실험성적은 평균 ± 표준편차 (mean ± SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p 값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

성능/효과

18α-GA에 의한 Sub-G1 분석 결과 18α-GA 농도에 비례해서 sub-G1 peak가 증가함을 알 수 있다.
24시간 후에 18α-GA 농도 의존적으로 AGS세포가 사멸되는 효과를 보았고, sub-G1 analysis와 caspase 3 또는 9 를 통해서 세포 사멸에 apoptosis가 관여함을 알 수있었다.
Caspase 3과 9의 활성도를 측정한 결과 18α-GA에 의해 caspase 3과 9의 활성도가 농도에 의존적으로 증가함을 알 수 있고 이러한 활성도는 pan-caspase inhibitor인 zVAD-fmk에 의해서 억제됨도 알 수 있었다 (Fig. 3).
MTT assay로 SP600125 처치시 50 μM 에서 79.9 ± 4.9%, 100 μM에서 76.6 ± 0.2%, 150 μM에서 58.8 ± 4.3%, 200 μM에서 35.5 ± 2.1% (P<0.05)의 세포 생존 결과를 보였다 (Fig. 4A).
또 18α-GA에 의한 세포사멸에 JNK 기전이 관여함을 확인하였고, 활성산소가 발생되어 세포사멸을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
위암세포 사멸 효과를 측정하기 위하여 18α-GA 50, 100, 150, 200 μM 농도로 AGS세포에 시험한 결과 24시간 후인 (A)에서는 150 μM이상에서 뚜렷한 위암세포 사멸 효과를 볼 수 있었으며, 48시간 후인 (B)에서는 50 μM 이상에서 뚜렷한 위암세포 사멸 효과를 볼 수 있었다 (Fig. 1).
이번 연구에서 위암세 포주에 대한 18α-GA의 효능을 연구하여 caspase, JNK에 의존적이며 활성산소를 일으켜 세포 사멸을 일으키는 것을 확인하였다.

후속연구

따라서 18α-GA 에 의한 인체 위암세포에서의 효과를 확인할 수 있었 고, 이런 결과를 바탕으로 한의학에서 사용하는 감초의 성분 중 하나인 18α-GA 효능에 대한 적응증을 확대시킬 수 있는 좋은 자료가 될 수 있을 것으로 생각된다.
따라서 이러한 이온통로가 18α-GA에 의한 위암 성장 억제 효과에 관여하고 있는지 여부를 연구할 필요가 있다고 생각된다.
위암 치료법은 수술만이 유일한 치료 법이라고 알려져 있지만 최근에는 위암 수술 후 각종 화학요법으로 위암 치료 결과를 좋게 하고 있다⁴⁾. 따라서, 새롭고 더 효과적인 항암제를 연구하고 개발해야 한다.
. 이러한 세포사멸의 이해는 항암효능을 나타내는 다양한 물질의 반응과 작용기전을 이해할수 있으며, 새로운 항암제 개발에 중요한 아이디어를 제공할수 있다고 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	감초의 주요 활성 성분은 무엇인가?	감초는 부상이나 붓기 치료, 해독작용에 사용되고, 약제, 담배, 껌, 사탕, 음료등에서도 향신료와 감미료로 사용된다15). 감초의 주요 활성 성분은 glycyrrhizin이다16). Glycyrrhizin은 항염증, 면역조절, 항암작용 등 여러 가지 약리활동을 하고 있는 것으로 보고되고 있다17-19).
	세포사멸이 발생하는 조건은 무엇인가?	세포사멸은 발달과 노화 단계에서 정상적으로 일어나는 항상성 유지 메커니즘의 하나로 면역반응과 같은 방어기제로서도 발생할 수 있고, 세포가 질병이나 유해물질에 의해 손상되었을 때도 발생할 수 있다27,28). 이러한 세포사멸의 이해는 항암효능을 나타내는 다양한 물질의 반응과 작용기전을 이해할수 있으며, 새로운 항암제 개발에 중요한 아이디어를 제공할 수 있다고 생각된다.
	위암 치료에 있어 새롭고 더 효과적인 항암제를 연구하고 개발해야 하는 까닭은 무엇인가?	위암은 매년 거의 100만 명의 새로운 환자에게서 진단되고 있으며, 동아시아, 동유럽, 중남미 일부 지역에서 가장 높은 발병률을 보이고 있다3). 위암 치료법은 수술만이 유일한 치료법이라고 알려져 있지만 최근에는 위암 수술 후 각종 화학요법으로 위암 치료 결과를 좋게 하고 있다4). 따라서, 새롭고 더 효과적인 항암제를 연구하고 개발해야 한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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