[논문]상동나무 지상부의 항혈전 활성

표수진; 이윤진; 박성익; 이창일; 박종이; 손호용

doi:10.5352/jls.2020.30.5.443

상동나무 지상부의 항혈전 활성
Evaluation of the Anti-thrombosis Activities of the Aerial Parts of Sageretia thea 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.5, 2020년, pp.443 - 451

표수진 (안동대학교 식품영양학과) , 이윤진 (안동대학교 식품영양학과) , 박성익 (경상북도 보건환경연구원) , 이창일 (경상북도 보건환경연구원) , 박종이 (경북바이오산업연구원) , 손호용 (안동대학교 식품영양학과)

초록
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현대사회는 고지방의 서구화된 식사, 과도한 스트레스 등으로 비정상적인 혈액응고 및 과다한 혈소판 응집이 증가되고 있으며, 이로 인한 다양한 혈전성 질환 위험성도 증가되고 있다. 본 연구에서는 제주 특용식물인 상동나무(Sageretia thea) 지상부의 항혈전 활성을 평가하기 위해 잎(ST-L), 줄기(ST-B), 열매(ST-F) 에탄올 추출물을 조제하고 이의 항혈전 활성, 인간 적혈구 용혈활성 및 flavonoids·phenolic acids 조성을 검토하였다. ST-B 추출물은 식용으로 이용되고 있는 ST-F 추출물보다 6.7배의 총 폴리페놀 함량을 보였으며, ST-L 추출물은 ST-F 추출물보다 2.7배 높은 총 플라보노이드 함량을 보였다. 혈액응고 저해활성 평가 결과, ST-F 추출물은 aPTT에서만 혈액응고시간 연장이 미약하게 나타났으나, ST-L 및 ST-B 추출물은 기존 항혈전제인 aspirin 및 베리류 및 한방 약재 추출물보다 트롬빈, 프로트롬빈, 응고인자들에 대해 강력한 저해활성을 나타내었다. 혈소판 응집저해 역시 ST-L 및 ST-B 추출물은 aspirin보다 우수한 응집저해 활성을 나타내었으며, 인간 적혈구에 대한 용혈활성은 1 mg/ml 농도까지 전혀 나타나지 않았다. ST-L 및 ST-B 추출물의 phenolic acid 및 flavonoids 분석결과, rutin, isoquercitrin 및 astragalin이 주요 활성물질로 확인되었다. 본 연구결과는 상동나무 잎과 줄기의 강력한 항혈전 활성의 최초 보고이며, 상동나무를 이용한 항혈전제 개발이 가능함을 제시하고 있다. 향후 상동나무에서 처음으로 확인된 isoquercitrin의 항혈전 기전에 대한 연구가 필요하다.

Abstract ▼ AI-Helper

Recently, thrombotic diseases have become rapidly more prevalent due to Westernized lifestyles and high-fat diets. In this study, the anti-thrombosis activities of the aerial parts of Sageretia thea were evaluated using ethanol extracts of the leaf (ST-L), branch (ST-B), and fruit (ST-F), and their anti-coagulation, platelet aggregation inhibition, and hemolytic toxicity were assessed. In comparison to the ST-F extract, the ST-B exhibited 6.7 times more polyphenol content, and the ST-L had 2.7 times more total flavonoid content. The ST-L and ST-B extracts showed stronger inhibitions of thrombin, prothrombin, and blood coagulation factors than aspirin, berry extracts, or commercial oriental herbs. Furthermore, ST-L and ST-B showed superior platelet aggregation-inhibitory activities than aspirin. The ST-F extract demonstrated only minor anti-thrombosis effects, and none of the extracts showed hemolysis against red blood cells up to 1 mg/ml. Phenolic acid and flavonoid analysis of the ST-L and ST-B extracts showed abundant rutin, isoquercitrin, and astragalin as the major active compounds. Further research on the anti-thrombotic activity of isoquercitrin, a rare flavonoid from quercetin, is necessary. This is the first report of isoquercitrin in Sageretia thea, and our results suggest that ST-L and ST-B extracts could therefore developed as anti-thrombosis agents.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Conditions of UPLC/MS/MS analysis for ST-L and ST-B extracts
그림 Fig. 1. Component analysis of the ethanol extracts of aerial parts of Sageretia thea.
표 Table 2. Platelet aggregation inhibitory activities of the ethanol extracts of aerial parts of Sageretia thea
그림 Fig. 2. Effect of the ethanol extracts of aerial parts of Sageretia thea on blood coagulation.
표 Table 3. Hemolytic of the ethanol extracts of aerial parts of Sageretia thea against human red blood cells
그림 Fig. 3. Diagram of impedance changes during platelet aggregation after addition of aspirin and the ethanol extracts of aerial parts of Sageretia thea in whole blood aggregometer.
표 Table 4. Flavonoids and phenolic acids identified in the ethanol extracts of aerial parts of Sageretia thea

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 제주 특산식물인 상동나무의 지상부(잎, 줄기, 열매) 추출물을 대상으로 혈액응고, 혈소판 응집, 적혈구 용혈에 미치는 활성을 평가하고, 추출물의 flavonoids 및 phenolic acids를 분석하여, 상동나무 지상부 추출물이 혈전성 질환 개선 및 예방을 위한 식의약품 및 화장품 소재로 개발 가능함을 제시하고자 하였다.

제안 방법

1% formic acid가 포함된 acetonitrile 기울기 용리를 수행하였다(Table 1). MS/MS 분석조건은 분석의 선택성과 검출감도 향상을 위해 multiple reaction monitoring (MRM) 방식으로, negative ionization mode로 수소화 된 분자이온((M-H)-)을 만들어 각 성분별 precursor ion을 선정하여 tune 작업을 통해 최적의 collision energy 및 product ion을 선택하여 spray voltage 2.0 kV, desolvation gas flow rate 800 l/hr와 cone gas flow rate 1 l/hr, desolvation temperature 450℃로 분석하였다. Orientin는 positive ionization mode로 분석하였으며, 이동상 용매는 HPLC/MS/MS용 등급을 사용하였다.
0 kV, desolvation gas flow rate 800 l/hr와 cone gas flow rate 1 l/hr, desolvation temperature 450℃로 분석하였다. Orientin는 positive ionization mode로 분석하였으며, 이동상 용매는 HPLC/MS/MS용 등급을 사용하였다.
PT 측정은 혈장 70 μl와 다양한 농도의 ST-L, ST-B 및 ST-F 추출물 10 μl를 coagulometer 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130 μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다.
ST-L, ST-B 및 ST-F 추출물의 항응고 활성은 thrombin time(TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 각각 측정하여 평가하였다[17, 21]. TT는 37℃에서 thrombin (0.
TT는 37℃에서 thrombin (0.5 U, Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 50 μl와 CaCl₂(20 mM) 50 μl, 다양한 농도의 ST-L, ST-B 및 ST-F 추출물 10 μl를 Amelung coagulometer (Amelung, Lemgo, Germany) 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100 μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다.
UPLC 분석 조건은 ACQUITY UPLC® BEH C18 1.7 μm 컬럼, 컬럼온도 40℃, 유량 350 μl/min, 주입량 2 μl, 이동상 용매는 0.1% formic acid가 포함된 증류수와 0.1% formic acid가 포함된 acetonitrile 기울기 용리를 수행하였다(Table 1).
Japan) 후 동결건조 하였다. 상동나무 잎(ST-L), 줄기(ST-B) 및 열매(ST-F) 추출물들은 DMSO에 적당한 농도로 녹여, 성분 분석 및 항혈전 활성평가에 사용하였다. 항혈전 활성평가에 사용한 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co.
상동나무 지상부 ethanol 추출물의 항응고 활성을 TT, PT, aPTT를 각각 측정하여 평가하였다. 활성대조구로는 thrombin 및 혈액응고인자 저해를 통해 혈전 생성을 억제하는 aspirin [39]을 사용하였으며, aspirin은 1.
상동나무 지상부의 ethanol 추출물을 제조한 후 이의 유용성분을 분석하였으며, 그 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 상동나무 에탄올 추출효율은 열매 > 잎 > 줄기의 순으로 나타났으며, 15.
상동나무 추출물의 flavonoids 및 phenolic acids 분석은 UPLC (Acquity i class, Waters, Milford, USA)/MS/MS(TSQ Quantum ULTRA, Thermo Fisher, Waltham, USA)를 사용하였으며, 분석 표품은 상업적으로 판매하고 있는 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 caffeic acid, cinnamic acid, ρ-coumaric acid, m-coumaric acid, ferulic acid, gallic acid, gentisic acid, 4-hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid, salicylic acid, sinapic acid, syringic acid, vanillic acid의 13종의 페놀산과 apiin, astragalin, cosmosiin, fisetin, hyperoside, isoquercitrin, kaempferol, luteolin, myricetin, orientin, quercetin, quercitrin, rutin, vitexin의 총 14종의 플라보노이드 성분을 사용하였다.
음건, 세절한 상동나무 시료들을 각각 20배의 70% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. Korea)을 가한 후 상온에서 7일 동안 침지하여 추출하였으며, 추출액을 filter paper (Whatsman No. 2)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N-1110S, Tokyo Rikakikai Co., Ltd. Japan) 후 동결건조 하였다.
이후 65 μl CaCl2 (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다.
상동나무 잎(ST-L), 줄기(ST-B) 및 열매(ST-F) 추출물들은 DMSO에 적당한 농도로 녹여, 성분 분석 및 항혈전 활성평가에 사용하였다. 항혈전 활성평가에 사용한 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며, PT reagent와 aPTT reagent는 MD Pacific Hemostasis (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)의 분석시약을 사용하여 측정하였다[19]. 기타 시약은 Sigma Co.
먼저 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP, 대구·경북혈액원)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 5×108/ml이 되도록 조정하여 사용하였으며, 응집유도제로 collagen (1 mg/ml)을 사용하였다. 혈소판 응집반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며 amplitude, slope, area under를 측정하여 평가하였다[38]. 이 때, amplitude (ohm)는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집정도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, area under는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 의미한다 [21, 38].
환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였으며, 시료 100 μl에 DNS 시약 300 μl를 첨가하고 3분간 방치한 후, 100℃에서 5분간 반응시켰으며, 이후 실온에서 방냉한 후, 반응액을 540 nm에서 측정하였다.
3에 나타내었다. 활성대조구로는 COX-1을 비가역적으로 저해하여 혈소판 응집에 중요한 역할을 수행하는 thromboxane A2 합성을 억제하는 aspirin [40]을 사용하였으며, aspirin은 0.25 및 0.125 mg/ml 농도에서 각각 무첨가구에 비해 각각 32.5 및 68.6%의 혈소판 응집율을 나타내어 농도 의존적인 강력한 혈소판 응집 저해 활성을 나타내었다. 한편, ST-L 추출물은 0.
상동나무 지상부 ethanol 추출물의 항응고 활성을 TT, PT, aPTT를 각각 측정하여 평가하였다. 활성대조구로는 thrombin 및 혈액응고인자 저해를 통해 혈전 생성을 억제하는 aspirin [39]을 사용하였으며, aspirin은 1.5 mg/ml 농도에서 용매 대조구에 비해 TT, PT, aPTT를 각각 1.82, 1.57 및 1.69배 증가시켜 우수한 항응고 활성을 확인하였다. ST-L 및 ST-B 추출물은 2.

대상 데이터

먼저 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP, 대구·경북혈액원)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 5×108/ml이 되도록 조정하여 사용하였으며, 응집유도제로 collagen (1 mg/ml)을 사용하였다.
본 실험에 사용된 상동나무 잎, 줄기, 열매는 국립산림과학원 산림약용자원연구소로부터 제공받았으며, 확증표본(FM. J.S. 20180510-01)은 산림약용자원연구소에 보관하고 있다. 음건, 세절한 상동나무 시료들을 각각 20배의 70% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co.
ST-L, ST-B 및 ST-F 추출물의 인간 적혈구 용혈 활성은 PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 추출물 100 μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500 rpm)하여 상등액 100 μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO (2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 Triton X-100 (1 mg/ml)및 amphotericin B를 사용하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다[18, 21].

데이터처리

실험 결과는 SPSS 23.0 버전을 사용하여 mean ± SD로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

이론/모형

ST-L, ST-B 및 ST-F 추출물의 혈소판 응집저해 활성은 Whole Blood Aggregometer (Chrono-log, PA, U.S.A)를 사용하여 impedance 법으로 평가하였다[38]. 먼저 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP, 대구·경북혈액원)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 5×108/ml이 되도록 조정하여 사용하였으며, 응집유도제로 collagen (1 mg/ml)을 사용하였다.
Total polyphenol (TP) 및 Total flavonoid 함량 측정은 기존의 보고된 방법[34]에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량은 phenol-sulfuric acid법을 사용하였으며, 시료 100 μl에 5% phenol 300 μl와 진한 황산 1.
상동나무 지상부 ethanol 추출물의 혈소판 응집저해 활성을 impedance 법으로 측정한 Table 2 및 Fig. 3에 나타내었다. 활성대조구로는 COX-1을 비가역적으로 저해하여 혈소판 응집에 중요한 역할을 수행하는 thromboxane A2 합성을 억제하는 aspirin [40]을 사용하였으며, aspirin은 0.
총당 정량은 phenol-sulfuric acid법을 사용하였으며, 시료 100 μl에 5% phenol 300 μl와 진한 황산 1.5 ml를 가하고 30℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 490 nm에서 측정하였다.

성능/효과

69배 증가시켜 우수한 항응고 활성을 확인하였다. ST-L 및 ST-B 추출물은 2.5 mg/ml에서 용매대조구보다 15배 이상 연장된 혈액응고시간을 나타내었으며, 특히 ST-B 추출물은 1.25 mg/ml 농도에서 TT 및 aPTT를 대조구에 비해 15배 이상 연장하였으며, PT의 경우에도 1.55배 연장하여 ST-L 추출물보다 강력한 활성을 나타내었다(Fig. 2). ST-B 추출물의 강력한 트롬빈 저해는 0.
ST-L 추출물에서는 rutin이 가장 높은 함량(664.6 μg/g)을 나타내었으며, isoquercitrin(58.8 μg/g), astragalin (3.66 μg/g)이 검출되었다.
3). 따라서, ST-L 및 ST-B 추출물은 강력한 혈소판 응집저해 활성으로 항혈전제로 사용가능함을 확인하였다.
먼저, 대조구로 사용된 DMSO와 물은 용혈 활성이 없었으며, Triton X-100은 1 mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 또한, 항암제, 항진균제로 사용되고 있는 amphotericin B의 경우 0.025mg/ml 농도에서 50% 이상 적혈구를 용혈시킴을 확인하였다. 반면 ST-L, ST-B, ST-F 추출물 모두에서 1 mg/ml 농도까지 전혀 용혈활성이 나타나지 않았다.
상동나무 지상부 ethanol 추출물의 인간 적혈구 용혈활성을 평가하였으며, 그 결과는 Table 3에 나타내었다. 먼저, 대조구로 사용된 DMSO와 물은 용혈 활성이 없었으며, Triton X-100은 1 mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 또한, 항암제, 항진균제로 사용되고 있는 amphotericin B의 경우 0.
모든 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다. 실험 결과는 SPSS 23.
이후 65 μl CaCl2 (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균치로 나타내었으며, 각각의 항응고 활성은 시료 첨가시의 응고 시간의 평균치를 무첨가시의 응고시간의 평균치의 비로 나타내었다[16, 19].
0%의 수율을 나타내었다. 부위별 추출물의 유용성분 분석 결과, 총 폴리페놀 함량은 줄기 추출물에서 가장 높은 307.5 mg/g의 함량을 보였으며, 잎 추출물(270.0 mg/g), 열매추출물(45.8 mg/g) 순으로 나타났다. 반면, 플라보노이드 함량 측정 결과는 잎 추출물(77.
상동나무 에탄올 추출효율은 열매 > 잎 > 줄기의 순으로 나타났으며, 15.5~20.0%의 수율을 나타내었다.
6%의 혈소판 응집율을 나타내어 농도 의존적인 강력한 혈소판 응집 저해 활성을 나타내었다. 한편, ST-L 추출물은 0.25 mg/ml에서 14.6%, 0.125 mg/ml에서 42.5%, 0.063 mg/ml에서 102.1%의 응집도를 나타내어 aspirin보다 강력한 응집저해 활성을 나타내었다. ST-B 추출물 역시 0.

후속연구

2). ST-B 추출물의 강력한 트롬빈 저해는 0.95 mg/ml 농도에서도 확인되어, elastase와 같은 serine계 단백질 분해효소에도 유사한 저해활성[42]을 나타내어 피부탄력개선 화장품 소재로도 이용가능하리라 판단된다. 한편 ST-F 추출물은 2.
향후 상동나무 잎의 quercetin 대사 과정 및 생태적 특성 연구와 isoquercitrin 생합성의 상관관계 연구가 필요하다고 판단된다. 이상의 결과는, 제주 특산식물인 상동나무 잎과 줄기가 새로운 항혈전제 개발 소재로 이용 가능하며, serine계 효소저해에 의한 다양한 식의약품, 화장품 소재로 개발이 필요함을 제시하고 있다.
한편 isoquercitrin (quercetin 3-glucoside)은 quercetin으로부터 생성되는 것으로 알려져 있으나, 상동나무 잎과 줄기 추출물에서는 quercetin, quercitrin (quercetin-3-rhamnoside) 및 hyperoside (quercetin-3-glalctoside)는 거의 검출되지 않으면서, 상대적으로 희귀한 isoquercitrin (quercetin 3-glucoside)을 고농도로 함유하고 있는 점은 매우 흥미로우며, 이는 β-glucosidase inhibitor가 강력한 대추잎[6]에서 isoquercitrin이 고농도로 검출되는 현상과 관련이 있을 것으로 판단된다. 향후 상동나무 잎의 quercetin 대사 과정 및 생태적 특성 연구와 isoquercitrin 생합성의 상관관계 연구가 필요하다고 판단된다. 이상의 결과는, 제주 특산식물인 상동나무 잎과 줄기가 새로운 항혈전제 개발 소재로 이용 가능하며, serine계 효소저해에 의한 다양한 식의약품, 화장품 소재로 개발이 필요함을 제시하고 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	상동나무는 무엇인가?	한편, 상동나무(Sageretia thea)는 갈매나무과(Rhamnaceae) 상동나무속(Sageretia)에 속하는 반상록성 활엽관목으로서 우리나라를 포함한 아시아와 북아메리카에 분포하며, 우리나라에서는 주로 제주도와 남해안 지역에 일부 분포한다[5]. 상동나무는 잎이 작고 가시가 있어 매발톱 나무라고도 불리며, 블루베리 열매와 색상은 비슷하나 크기는 작은 편이다.
	상동나무의 잎, 줄기, 열매 부위에서 플라보노이드 함량은?	8 mg/g) 순으로 나타났다. 반면, 플라보노이드 함량 측정 결과는 잎 추출물(77.0 mg/g) > 줄기 추출물(63.9mg/g) > 열매 추출물(28.2 mg/g) 순으로 나타났다. 총당 및 환원당 함량은 유사하게 열매 > 줄기 >잎의 순으로 나타났다.
	민간에서 상동나무의 잎과 열매는 어디에 쓰이는가?	상동나무는 잎이 작고 가시가 있어 매발톱 나무라고도 불리며, 블루베리 열매와 색상은 비슷하나 크기는 작은 편이다. 민간에서는 상동나무의 잎을 감기, 발열, 간염, 피부병 치료 등에 사용하여 왔으며, 상동나무 열매는 식용으로 이용되어 왔다[14]. 상동나무에 대한 연구로는, 상동나무 열매의 종자발아 특성[36, 37], 자생지의 생육환경 조사[35] 등의 재배학적 연구가 과거 주로 이루어졌으나, 최근에는 열매 추출물의 항산화 활성 연구[2, 14, 22, 24], 미백활성[23], 암세포 생장억제 활성[10,22]이 알려져 있으며, 특히 상동나무 잎의 경우, 플라보노이드 농축 성분의 항산화 활성[1], 잎의 플라보노이드 성분 분석을 위한 가수분해 조건 검토[32], 잎 추출물의 HIV-1 protease 활성억제 활성[31], 잎 추출물의 암세포 성장억제 활성[11, 12] 및 항염증 활성[13] 등이 알려져 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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