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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 추후 환자에서 분리된 MRSA 분리 배 양 균주를 대상으로 분자유전학적인 분석을 통해 mecA 및 mecB 유전자를 검출하고, Staphylococcal cassette chromosome (SCC) mec typing과 mec complex typing을 시행하여, MRSA 분리 배양 균주의 아형을 분석한 후, 관련 선행연구를 통해 의료기관 환경에서 분리된 MRSA의 분자유전학적 특성 분석결과와 비교 분석하여 그 결과를 바탕으로 항생제 내성 세균에 관한 병원 내 감염관리 및 소독체계 확립에 대한 기초자료로 제공하고자 하였다.
- 본 연구에서는 환자의 비강으로부터 분리 배양된 총 39건의 MRSA 분리 배양 균주를 이용해 mecA 유전자 검출, SCCmec typing과 mec complex typing을 분석해 보고자 하였다. 임 상 환자의 비강으로부터 분리 배양된 MRSA 총 39주 중 SCCmec type-II가 24건, type-II/IVa가 2건, type-II/V가 1건, type-IVa가 1건, not-typeable이 11건으로 분석되었으 며, mec complex type A가 29건, not-typeable이 10건이었 으며, type B는 없는 것으로 분석 되었다.
제안 방법
- 2018년 1월부터 3월까지 국내 대전지역 소재 2차 의료기관에서 폐렴이나 고열 및 기타 폐질환자의 nasal swab으로부터 분리 배양된 된 총 39주의 MRSA를 대상으로 SCCmec과 mec complex 아형의 분자유전학적 특성을 분석하였다.
- BAP 배지에서 유의한 집락을 0.45% 생리 식염수에 부유시켜 McFarland 탁도가 0.6∼0.9이 되게 탁도를 맞춘 후 MicroScan WalkAway-96 자동화 동정 시스템(Beckman Coulter) 장비를 이용하여 항생제 감수성 시험을 시행하였다.
- SCCmec과 mec complex typing 및 메티실린 내성 유전자인 mecA 유전자 검출을 수행하기 위해 추출한 1 μL gDNA (약 10 μg/μL)를 주형 DNA로 10 μL Prime Taq PCR Premix (GeNet Bio, Daejeon, Korea), 각각의 10 pmole/μL Forward primer와 reverse primer를 7 μL 멸균 증류수를 첨가하여 총 20 μL의 혼합액을 만들어 multiplex PCR을 수행하 였다.
- 9이 되게 탁도를 맞춘 후 MicroScan WalkAway-96 자동화 동정 시스템(Beckman Coulter) 장비를 이용하여 항생제 감수성 시험을 시행하였다. 결과의 정확도를 위해 표준균주인 S. aureus ATCC 29213를 사용하여 주 1회 임상검체와 동일한 방법으로 항생제 감수성 시 험을 실시하여 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, Wayne, PA, USA) 기준 허용범위에 적절한지 확인하였다. 항생제 감수성 시험 시행 후 감수성과 내성 여부의 판정은 CLSI 가이드라인에서 권고하는 표준 값을 적용하여 실시하였다.
- 환자의 비강으로부터 채취된 모든 검체는 혈액우무배지 (blood agar plate, BAP) (BNF KOREA, Gimpo, Korea)에 접종하여 37°C 세균 배양기에서 18∼24시간 배양하였다. 계대 순수 배양을 통해 단일 집락으로 분리된 세균은 Gram 염색을 시행하여 Gram 양성 및 음성 세균을 분리하였고, MicroScan WalkAway-96 자동화 동정 시스템(Beckman Coulter, West Sacramento, CA, USA)을 이용해 세균 종을 동정하였다.
- 반응이 끝난 PCR 산 물 3 μL를 1.5% agarose/TBE gel에 분주하여 전기영동을 통 해 그 결과를 확인하였다(Figure 1).
- SCCmec과 mec complex typing 및 메티실린 내성 유전자인 mecA 유전자 검출을 수행하기 위해 추출한 1 μL gDNA (약 10 μg/μL)를 주형 DNA로 10 μL Prime Taq PCR Premix (GeNet Bio, Daejeon, Korea), 각각의 10 pmole/μL Forward primer와 reverse primer를 7 μL 멸균 증류수를 첨가하여 총 20 μL의 혼합액을 만들어 multiplex PCR을 수행하 였다. 본 연구에 사용한 primer의 염기서열은 기존 연구자료를 바탕으로 시행하였다(Table 1, 2) [9, 10]. 반응이 끝난 PCR 산 물 3 μL를 1.
- BAP 배지에서 배양된 세균의 집락을 5% ChelexⓇ Resin (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)/TBE 용액 500 μL에 혼탁 시킨 후 100°C에서 10분간 끓인 후 6,032 ×g로 2분간 원심분리 한 후 상층액을 이용하였다. 이후 추출한 genomic DNA (gDNA)는 Nanodrop 2,000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 장비를 이용해 농도와 순도를 측정하였다.
- aureus ATCC 29213를 사용하여 주 1회 임상검체와 동일한 방법으로 항생제 감수성 시 험을 실시하여 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, Wayne, PA, USA) 기준 허용범위에 적절한지 확인하였다. 항생제 감수성 시험 시행 후 감수성과 내성 여부의 판정은 CLSI 가이드라인에서 권고하는 표준 값을 적용하여 실시하였다. 항생제 감수성 시험에 사용된 항생제는 azithromycin, β-lactamase, ciprofloxacin, clindamycin, daptomycin, erythromycin, fosfomycin, fusidic acid, gentamicin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, mupirocin, rifampin, synercid, teicoplanin, tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, vancomycin을 포함해 총 19종이다.
- 환자의 비강으로부터 채취된 모든 검체는 혈액우무배지 (blood agar plate, BAP) (BNF KOREA, Gimpo, Korea)에 접종하여 37°C 세균 배양기에서 18∼24시간 배양하였다.
대상 데이터
- 항생제 감수성 시험에 사용된 항생제는 azithromycin, β-lactamase, ciprofloxacin, clindamycin, daptomycin, erythromycin, fosfomycin, fusidic acid, gentamicin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, mupirocin, rifampin, synercid, teicoplanin, tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, vancomycin을 포함해 총 19종이다.
성능/효과
- Ciprofloxacin, azithromycin, clindamycin, erythromycin, levofloxacin, moxifolxacin에 대해서는 내성율이 66.6∼74.3%였으며, fusidic acid와 tetracycline에 대해서는 내성율이 43.6∼ 61.5%, 그리고 fosfomycin, mupirocin, rifampin에는 15.4∼ 30.7%의 내성율을 나타냈다.
- 7%)가 내성을 나타냈다. SCCmec type-II/IVa형에 속하는 것으로 보이는 총 2주의 MRSA의 항생제 감수성 시험 결과는 ampicillin, amox/Kclav, imipenem, oxacillin, penicillin, azithromycin, clindamycin, ciprofloxacin, erythromycin, levofloxacin, moxifloxacin 등 11개의 항생제에 대한 공통 내성을 나타냈으며, 1주(50%)는 앞에서 언급한 11개 항생제와 더불어 gentamycin에 대한 추가적인 내성을 나타냈다.
- SCCmec type-II/V형에 속하는 것으로 보이는 1주의 MRSA의 항생제 감수성 시험 결과는 ampicillin, amox/K clav, imipenem, oxacillin, penicillin, azithromycin, clindamycin, ciprofloxacin, erythromycin, levofloxacin, moxifloxacin, tetracycline, fusidic acid, gentamycin, fosfomycin, rifampin 등 15개의 항생제에 대한 내성을 나타냈다.
- 8%)는 앞에서 언급한 12개 항생제와 더 불어 fusidic acid에 대해서도 추가적인 내성을 나타냈다. SCCmec type-II형에 속하는 총 24주의 MRSA 중 16주 (66.7%)가 gentamycin에 대한 내성을 나타냈으며, 11주 (45.8%)가 fosfomycin에 대한 내성을 나타냈고, rifampin과 mupirocin에 대해서는 각각 4주(16.7%)가 내성을 나타냈다. SCCmec type-II/IVa형에 속하는 것으로 보이는 총 2주의 MRSA의 항생제 감수성 시험 결과는 ampicillin, amox/Kclav, imipenem, oxacillin, penicillin, azithromycin, clindamycin, ciprofloxacin, erythromycin, levofloxacin, moxifloxacin 등 11개의 항생제에 대한 공통 내성을 나타냈으며, 1주(50%)는 앞에서 언급한 11개 항생제와 더불어 gentamycin에 대한 추가적인 내성을 나타냈다.
- SCCmec type-II형에 속하는 총 24주의 MRSA 중 22주 (91.7%)가 ampicillin, amox/K clav, imipenem, oxacillin, penicillin, azithromycin, clindamycin, ciprofloxacin, erythromycin, levofloxacin, moxifloxacin 등 11개 항생제에 대해 내성을 나타냈으며, 19주(79.2%)는 앞에서 언급한 11개 항생제와 더불어 tetracycline에 대해서도 추가적인 내성을 나타냈고, 17주(70.8%)는 앞에서 언급한 12개 항생제와 더 불어 fusidic acid에 대해서도 추가적인 내성을 나타냈다. SCCmec type-II형에 속하는 총 24주의 MRSA 중 16주 (66.
- SCCmec type-IVa형에 속하는 1주의 MRSA의 항생제 감 수성 시험 결과는 ampicillin, amox/K clav, imipenem, oxacillin, penicillin, azithromycin, clindamycin, ciprofloxacin, erythromycin, levofloxacin, moxifloxacin, gentamycin 등 12개의 항생제에 대한 내성을 나타냈다.
- SCCmec과 mec complex 아형 분석 결과, 환자의 비강에서 분리 배양된 MRSA 39주 중 22주가 mec complex group A이면서 SCCmec type-II 아형으로 분류되어 가장 많은 분포를 나타냈고, 다음으로 mec complex와 SCCmec 아형 모두 유형이 밝혀지지 않은 not-typeable이 8주로 많은 분포를 나타낸 반면, mec complex group A이면서 SCCmec type-II/V와 SCCmec type-IVa가 각각 1주로 가장 적은 분포를 나타냈다. 이 결과는 HA-MRSA의 SCCmec 아형 중 SCCmec types-II형이 가장 우세하다는 과거의 연구결과와 유사한 양상을 나타내었다[9, 12].
- SCCmec과 mec complex 아형분석에서 not-typeable로 분류된 MRSA 8주 모두 ampicillin, amox/K clav, imipenem, oxacillin, penicillin 등 5가지 항생제에 공통으로 내성을 나타냈으며, 그 중 1주(12.5%)는 tetracycline과 gentamycin등 2가지 항생제에 대해 추가적인 내성을 나타냈으며, 1주(12.5%)는 azithromycin, clindamycin, erythromycin를 포함해 3가지 항생제에 추가적인 내성을 나타냈고, 1주(12.5%)는 azithromycin, clindamycin, ciprofloxacin, erythromycin, levofloxacin, moxifloxacin, tetracycline, gentamycin, mupirocin을 포함해 9가지 항생제에 추가적인 내성을 나타냈다(Table 4).
- mec complex group A형으로만 분류된 총 3주의 MRSA는 모두 ampicillin, amox/K clav, imipenem, oxacillin, penicillin 등 5가지 항생제에 공통으로 내성을 나타냈으며, 1주(33.3%)는 tetracycline, gentamycin, mupirocin 등 3가 지 항생제에 대한 추가적인 내성을 나타냈으며, 1주(33.3%)는 azithromycin, clindamycin, ciprofloxacin, erythromycin, levofloxacin, moxifloxacin, tetracycline, fosfomycin, rifampin, mupirocin 등 10가지 항생제에 대한 추가적인 내성을 나타냈다.
- 임 상 환자의 비강으로부터 분리 배양된 MRSA 총 39주 중 SCCmec type-II가 24건, type-II/IVa가 2건, type-II/V가 1건, type-IVa가 1건, not-typeable이 11건으로 분석되었으 며, mec complex type A가 29건, not-typeable이 10건이었 으며, type B는 없는 것으로 분석 되었다. 결론적으로, 환자의 비강으로부터 분리된 MRSA 분리 배양 균주 중 SCCmec type-II와 mec complex type A 아형이 가장 많이 분포하고 있었으며, 이 결과는 의료기관 획득 MRSA에 관한 다른 연구결과와 유사한 결과를 나타냈다. 이후 환자의 비강으로부터 분리 배양된 not-typeable 아형의 MRSA 균주를 대상으로 국내에 서 발견되는 새로운 MRSA 아형 규명에 관한 추가 연구가 필요할 뿐만 아니라, MRSA 분리 배양 균주의 아형을 분석함으로써 그 분자적 특성을 분석한 결과를 바탕으로 병원 감염관리를 위한 기초자료를 제공할 수 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 MRSA로 분리 배양된 총 39주에 대한 항생제 감 수성 시험 결과, 환자의 비강에서 분리 배양된 MRSA 총 39주 모두 ampicillin, amox/K clav, imipenem, oxacillin, penicillin 등 5가지 항생제에 공통으로 내성을 나타냈다. 본 연구를 통해 환자의 비강에서 분리된 MRSA 아형 중 가장 많은 비중을 차지하는 SCCmec type-II아형에 속하는 총 24주(61.5%)의 MRSA 중 22주(91.7%)가 ampicillin, amox/K clav, imipenem, oxacillin, penicillin, azithromycin, clindamycin, ciprofloxacin, erythromycin, levofloxacin, moxifloxacin 등 11개 항생제에 대해 내성을 나타냈으며, 12가지 항생제에 대한 내성을 나타낸 MRSA가 19주(79.2%), 13가지 항생제에 대한 내성을 나타낸 MRSA는 17주(70.8%)에 달했다. 반면에, 환자의 비강에서 분리된 총 8주(20.
- 본 연구에서 MRSA로 분리 배양된 총 39주에 대한 항생제 감 수성 시험 결과, 환자의 비강에서 분리 배양된 MRSA 총 39주 모두 ampicillin, amox/K clav, imipenem, oxacillin, penicillin 등 5가지 항생제에 공통으로 내성을 나타냈다. 본 연구를 통해 환자의 비강에서 분리된 MRSA 아형 중 가장 많은 비중을 차지하는 SCCmec type-II아형에 속하는 총 24주(61.
- 본 연구에서는 환자의 비강으로부터 분리 배양된 총 39건의 MRSA 분리 배양 균주를 이용해 mecA 유전자 검출, SCCmec typing과 mec complex typing을 분석해 보고자 하였다. 임 상 환자의 비강으로부터 분리 배양된 MRSA 총 39주 중 SCCmec type-II가 24건, type-II/IVa가 2건, type-II/V가 1건, type-IVa가 1건, not-typeable이 11건으로 분석되었으 며, mec complex type A가 29건, not-typeable이 10건이었 으며, type B는 없는 것으로 분석 되었다. 결론적으로, 환자의 비강으로부터 분리된 MRSA 분리 배양 균주 중 SCCmec type-II와 mec complex type A 아형이 가장 많이 분포하고 있었으며, 이 결과는 의료기관 획득 MRSA에 관한 다른 연구결과와 유사한 결과를 나타냈다.
- 현재까지 밝혀진 SCCmec type은 type I에서 VI까지 크게 분류되며 내성유전자를 포함하는 plasmid나 transposon 등에 따라 subtype이 매우 다양한 것으로 나타났다. 본 연구에서 는 환자의 전체를 대상으로 MRSA의 보균율을 조사한 것이 아니기 때문에, 환자로부터 분리 배양된 MRSA 특성을 대변하기에는 통계학적 유의성이 낮을 수 있기 때문에 분자 아형에 따른 항생제 내성 패턴의 특성을 정확하게 비교 분석하기에는 제한점 이 있을 수 있다.
- 2%)으로 분석되었다. 환자로부터 분리 배양된 MRSA 39주의 mec complex 아형 분석 결과, group A가 29건 (74.4%), not-typeable이 10건(25.6%)이었으며, group B는 없는 것으로 분석되었다(Table 3).
- 환자의 비강에서 분리 배양된 39주의 MRSA 임상분리균주 를 대상으로 mecA 유전자 검출을 위한 PCR 분석을 실시한 결과 총 39주의 모든 MRSA 균주(100%)에서 양성이 나오는 것을 확인하였다.
- 환자의 비강에서 분리 배양된 39주의 MRSA는 oxacillin을 포함하여 ampicillin, amox/K clav, imipenem, penicillin 에 모두 내성을 나타냈으나, daptomycin, linezolid, synercid, teicoplanin, trimethoprim/sulfamethoxazole, vancomycin에는 모두 감수성을 나타냈다. Ciprofloxacin, azithromycin, clindamycin, erythromycin, levofloxacin, moxifolxacin에 대해서는 내성율이 66.
- 환자의 비강에서 분리 배양된 MRSA 39주에 속하는 모든 SCCmec과 mec complex 아형은 ampicillin과 amox/K clav에 모두 내성을 나타냈다.
- 환자의 비강으로부터 분리 배양된 MRSA 39주의 SCCmec 아형 분석 결과 SCCmec type-II가 24건(61.5%), SCCmec type-II/IVa가 2건(5.1%), SCCmec type-II/V가 1건(2.6%), SCCmec type-IVa가 1건(2.6%), SCCmec not-typeable이 11건(28.2%)으로 분석되었다. 환자로부터 분리 배양된 MRSA 39주의 mec complex 아형 분석 결과, group A가 29건 (74.
후속연구
- 따라서 병원내 MRSA 감염 환자 발생 시 이에 따른 후속조치를 실시함에 앞서 병원내에서 MRSA의 전파를 예방할 수 있는 사전 대책을 더욱 강구하고 적극적으로 감염의 예방을 홍보하는 것이 매우 중요할 것으로 판단된다. 또한, 면역력이 저하 및 억제된 환자나 기저질환을 가지고 있는 고령자 등에서 새롭게 출현하는 항생제 내성균의 발생위험이 높고, 균의 국내 유입 및 확산 이 감염관리의 새로운 문제로 대두되고 있기 때문에 이러한 내성균의 출현을 최대한 억제하고, 조기에 발견하여 적절한 예방 지침을 시행함으로써 감염과 확산을 예방하는 것이 중요할 것으로 사료된다.
- 따라서 병원내 MRSA 감염 환자 발생 시 이에 따른 후속조치를 실시함에 앞서 병원내에서 MRSA의 전파를 예방할 수 있는 사전 대책을 더욱 강구하고 적극적으로 감염의 예방을 홍보하는 것이 매우 중요할 것으로 판단된다. 또한, 면역력이 저하 및 억제된 환자나 기저질환을 가지고 있는 고령자 등에서 새롭게 출현하는 항생제 내성균의 발생위험이 높고, 균의 국내 유입 및 확산 이 감염관리의 새로운 문제로 대두되고 있기 때문에 이러한 내성균의 출현을 최대한 억제하고, 조기에 발견하여 적절한 예방 지침을 시행함으로써 감염과 확산을 예방하는 것이 중요할 것으로 사료된다.
- 이 결과는 HA-MRSA의 SCCmec 아형 중 SCCmec types-II형이 가장 우세하다는 과거의 연구결과와 유사한 양상을 나타내었다[9, 12]. 본 결과에서 나타난 nottypeable 8주의 경우 기존에 알려지지 않은 다른 아형의 존재 임을 확인하기 위해 SCCmec 부위의 DNA sequencing 분석을 통한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 현재까지 밝혀진 SCCmec type은 type I에서 VI까지 크게 분류되며 내성유전자를 포함하는 plasmid나 transposon 등에 따라 subtype이 매우 다양한 것으로 나타났다. 본 연구에서 는 환자의 전체를 대상으로 MRSA의 보균율을 조사한 것이 아니기 때문에, 환자로부터 분리 배양된 MRSA 특성을 대변하기에는 통계학적 유의성이 낮을 수 있기 때문에 분자 아형에 따른 항생제 내성 패턴의 특성을 정확하게 비교 분석하기에는 제한점 이 있을 수 있다. 하지만, 본 연구결과와 의료기관 획득MRSA에 관한 다른 연구결과와 유사한 결과를 나타내었으며[14], 이는 본 연구가 병원내에서 언제든 MRSA집단 감염으로 인한 피부와 연조직 감염 환자가 발생할 가능성이 있으며, 이로 인해 집단감염 초래할 수 있다는 중요성을 지니고 있다.
- 결론적으로, 환자의 비강으로부터 분리된 MRSA 분리 배양 균주 중 SCCmec type-II와 mec complex type A 아형이 가장 많이 분포하고 있었으며, 이 결과는 의료기관 획득 MRSA에 관한 다른 연구결과와 유사한 결과를 나타냈다. 이후 환자의 비강으로부터 분리 배양된 not-typeable 아형의 MRSA 균주를 대상으로 국내에 서 발견되는 새로운 MRSA 아형 규명에 관한 추가 연구가 필요할 뿐만 아니라, MRSA 분리 배양 균주의 아형을 분석함으로써 그 분자적 특성을 분석한 결과를 바탕으로 병원 감염관리를 위한 기초자료를 제공할 수 것으로 사료된다.
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