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문제 정의
- 현재 benzo(a)pyrene에 대한 분석법으로는 환경부에서 고시한 토양오염공정시험기준”에서 제시하고 있는 속슬렛 분석법과, 식품의약품안전평가원에서 발행한 “벤조피렌 시험법 실무해설서“에서 제시하고 있는 초음파 추출법, 액-액 추출법 등이 많이 사용되고 있으나, 이와 같은 분석법은 분석 시 많은 시간이 소요되며, 과량의 용매가 사용되기 때문에 식품 또는 환경시료 중 benzo(a)pyrene에 대한 분석 시 효율적인 신속분석법이 필요한 실정이다[7, 8]. 따라 서 본 연구에서는 현재 전 세계적으로 식품 및 농산물 시료 중 잔류농약 분석 시 신속분석법으로 널리 사용되어지고 있는 QuEChERS분석법 개선을 통해 식품, 농산물, 토양 등 다 양한 시료에 대한 benzo(a)pyrene 분석에 사용될 수 있는 신속잔류분석법을 확립하여 benzo(a)pyrene에 대한 분석능력 개선 및 안전관리에 일조하고자 하였다.
제안 방법
- Benzo(a)pyrene에 대한 신속 전처리 분석법 확립을 위해 여러 문헌에서 신속분석법으로 많이 시도되고 있는 QuEChERS 분석법을 전처리 방법 및 추출용매에 따른 추출효율을 비교⋅ 분석하였다.
- 분석 컬럼은 Venusil PAH (Agela Technologies, Wilmington, USA)를 사용하였으며, 여기파장 260 nm, 방출파장 420 nm 에서 가장 높은 감도를 보였다. GC-MS/MS 및 LC-MS/MS 는 scan 분석하여 최적의 Multiple-Reaction Monitoring (MRM) 조건을 확인하였다.
- 본 연구에서는 HPLC-FLD (Agilent Technologies, Santa Clara, USA), GC-MS/MS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), LC-MS/MS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 이용하여 각 기기별 최적의 기기분석조건 을 확립하여 분석을 진행하였다. HPLC-FLD는 최신문헌을 통 해 benzo(a)pyrene의 여기파장과 방출파장을 조사한 후[9], 기기분석하여 최적의 감도를 보이는 파장을 확인하였다. 분석 컬럼은 Venusil PAH (Agela Technologies, Wilmington, USA)를 사용하였으며, 여기파장 260 nm, 방출파장 420 nm 에서 가장 높은 감도를 보였다.
- 그 후 각 시료가 담겨있는 conical tube에 MgSO4, NaCl이 함유된 QuEChERS 분석 kit (4 g MgSO4, 1 g NaCl, 1 g sodium citrate, 0.5 g disodium citrate sesquihydrate) 를 넣고 진탕(1,500 rpm, 1 min) 및 원심분리(3,000 rpm, 10 min)하여 상징액을 0.2 μm membrane filter에 통과시켜 여과 후 기기분석을 진행하였다.
- 대표시료는 우리나라 국민들의 주식인 쌀과 양념 농산물 중 다소비 되는 풋고추와 홍고추, 작물을 재배하는 토양을 시료로 선정하여 를 이용한 QuEChERS를 이용한 신속분석법 확립을 수행하였다. 농산물시료 쌀, 풋고추, 홍고추는 시중에 서 구입하여 마쇄 후 쌀은 10 g, 풋고추, 홍고추는 5 g 을 사 용하였으며, 토양시료는 친환경 논농지의 토양을 자연건조 시 킨 후 2 mm 체에 통과한 토양시료 10 g을 측량하여 conical tube에 넣어 분석 시 사용하였다.
- 2 μm membrane filter에 통과시켜 여과 후 기기분석을 진행하였다. 동일한 분석법에 PSA dSPE 과정을 추가한 전처리 분석법과 QuEChERS 분석 kit를 대신 하여 sodium sulfate anhydrous, sodium chloride를 첨가 한 전처리 분석법에 대한 추출효율을 평가한 후 적합한 전처리 분석법을 선정하였다. 선정한 전처리 분석법에 acetonitrile, n-hexane, acetonitrile:n-hexane (9:1, v/v), acetone을 추출용매로 하여 용매조건별 추출효율을 비교 분석하여 농산물 (쌀, 풋고추, 홍고추) 및 토양 시료 중 benzo(a)pyrene 분석 시 적합한 전처리 분석법을 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 HPLC-FLD (Agilent Technologies, Santa Clara, USA), GC-MS/MS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), LC-MS/MS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 이용하여 각 기기별 최적의 기기분석조건 을 확립하여 분석을 진행하였다. HPLC-FLD는 최신문헌을 통 해 benzo(a)pyrene의 여기파장과 방출파장을 조사한 후[9], 기기분석하여 최적의 감도를 보이는 파장을 확인하였다.
- 본 연구에서는 acetonitrile, acetone, n-hexane (Merk, Darmstadt, Germany), sodium sulfate anhydrous, sodium chloride (Daejung, Siheung, Korea) QuEChERS kit (Phenomenex, Torrance, USA), PSA dSPE (BEKOlut, Bruchmühlbach-Miesau, Germany)를 이용하여 시료를 추출하였다. 분석 시 homogenizer (Kinematica, Luzern, Switzerland), Centrifugal separator (Beckman coulter life science, Brea, USA), Centrifugal separator (Hanil science, Gimpo, Korea)를 이용하여 benzo(a)pyrene을 분석하였다.
- Benzo(a)pyrene에 대한 신속 전처리 분석법 확립을 위해 여러 문헌에서 신속분석법으로 많이 시도되고 있는 QuEChERS 분석법을 전처리 방법 및 추출용매에 따른 추출효율을 비교⋅ 분석하였다. 분석은 쌀, 풋고추, 홍고추, 토양 각각의 시료를 습윤 화 과정 없이 conical tube에 옮겨 증류수, acetonitrile 10 mL를 첨가 후, 고추시료는 작물체내 침투해 있는 benzo(a)pyrene 추출을 위해 마쇄추출(3 min, 20,000 rpm)을 진행하였다. 그 후 각 시료가 담겨있는 conical tube에 MgSO4, NaCl이 함유된 QuEChERS 분석 kit (4 g MgSO4, 1 g NaCl, 1 g sodium citrate, 0.
- 산출 된 정량한계를 고려하여 4개 시료에 대한 Low(10 μg/kg), Mid(50 μg/kg), High(100 μg/kg) 3농도를 설정하였으며, 각 농도에 대한 회수율 시험을 수행하였다.
- 동일한 분석법에 PSA dSPE 과정을 추가한 전처리 분석법과 QuEChERS 분석 kit를 대신 하여 sodium sulfate anhydrous, sodium chloride를 첨가 한 전처리 분석법에 대한 추출효율을 평가한 후 적합한 전처리 분석법을 선정하였다. 선정한 전처리 분석법에 acetonitrile, n-hexane, acetonitrile:n-hexane (9:1, v/v), acetone을 추출용매로 하여 용매조건별 추출효율을 비교 분석하여 농산물 (쌀, 풋고추, 홍고추) 및 토양 시료 중 benzo(a)pyrene 분석 시 적합한 전처리 분석법을 확인하고자 하였다.
- 검출한계 및 정량한계 산출을 위해 본 연구의 신속분석법 을 이용하여 추출한 10 μg/kg 수준의 시료 7반복에 대한 편차를 산출하였다. 편차 값에 3배를 곱하여 검출한계(Limit of Detection, LOD)를 산출하였으며, 검출한계에 3배를 곱하여 정량한계(Limit of Quantitation, LOQ)를 산출하였다. 산출 된 정량한계를 고려하여 4개 시료에 대한 Low(10 μg/kg), Mid(50 μg/kg), High(100 μg/kg) 3농도를 설정하였으며, 각 농도에 대한 회수율 시험을 수행하였다.
- 회수율 시험은 수준 1 (10 μg/kg), 수준 2 (50 μg/kg), 수준 3 (100 μg/kg)의 3농도를 7반복으로 각각의 시료에 가하였으며, 30분 동안 방치하여 표준물질을 시료에 완전히 흡수시킨 후 수행하였다.
대상 데이터
- 농산물 시료 쌀, 고추(풋고추, 홍고추)를 시중에서 구입하여 마쇄한 후 쌀 10 g, 고추(풋고추, 홍고추) 5 g을 칭량하였으며, 토양시료는 자연건조 시켜 2 mm 체에 통과시킨 후 10 g을 칭량하여 회수율 시험에 사용하였다. 회수율 시험은 수준 1 (10 μg/kg), 수준 2 (50 μg/kg), 수준 3 (100 μg/kg)의 3농도를 7반복으로 각각의 시료에 가하였으며, 30분 동안 방치하여 표준물질을 시료에 완전히 흡수시킨 후 수행하였다.
- 대표시료는 우리나라 국민들의 주식인 쌀과 양념 농산물 중 다소비 되는 풋고추와 홍고추, 작물을 재배하는 토양을 시료로 선정하여 를 이용한 QuEChERS를 이용한 신속분석법 확립을 수행하였다. 농산물시료 쌀, 풋고추, 홍고추는 시중에 서 구입하여 마쇄 후 쌀은 10 g, 풋고추, 홍고추는 5 g 을 사 용하였으며, 토양시료는 친환경 논농지의 토양을 자연건조 시 킨 후 2 mm 체에 통과한 토양시료 10 g을 측량하여 conical tube에 넣어 분석 시 사용하였다.
- Benzo(a)pyrene은 PAHs 중 인체발암물질로 가장 잘 알려 진 물질로서 안전성에 대한 문제가 확대되고 있다. 본 연구에서 회수율 시험을 위해 사용된 benzo(a)pyrene은 Sigma-aldrich (Saint Louis, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 화학구조 는 Fig. 1과 같다.
- 본 연구에서는 acetonitrile, acetone, n-hexane (Merk, Darmstadt, Germany), sodium sulfate anhydrous, sodium chloride (Daejung, Siheung, Korea) QuEChERS kit (Phenomenex, Torrance, USA), PSA dSPE (BEKOlut, Bruchmühlbach-Miesau, Germany)를 이용하여 시료를 추출하였다.
데이터처리
- 검출한계 및 정량한계 산출을 위해 본 연구의 신속분석법 을 이용하여 추출한 10 μg/kg 수준의 시료 7반복에 대한 편차를 산출하였다.
- 본 연구에서 확인된 QuEChERS 분석을 활용한 신속분석 법과 현행 benzo(a)pyrene 분석 시 추출효율이 우수하여 다 양한 분야에서 사용되어 지고 있는 속슬렛 추출법과의 추출 효율을 비교⋅분석하였다.
- 분석법의 신뢰성 확보를 위해 분석법에 대한 유효성 검증 을 수행하였다. HPLC-FLD는 5수준의 표준물질을 분석하여 기울기로 작성하였으며, 0.
이론/모형
- 본 연구의 QuEChERS 분석을 활용한 신속분석법의 신뢰 성 확보를 위해 분석법에 대한 유효성 검증을 수행하였으며, 유효성 검증 시험은 ‘시험법 마련 표준 절차 AOAC 가이드라인’에 준하여 수행하였다[10].
성능/효과
- GC-MS/MS 의 회수율 및 반복⋅재현성은 85.8~100.8%, 0.6~5.3%였으며, LC-MS/MS는 86.3~111.9%, 1.1~7.1%로 산출되었다.
- 9999이상의 직선성을 확인할 수 있었다. GC-MS/MS, LC-MS/MS는 matrix matched하여 5 수준으로 기울기를 작성하였으며, 4개의 시료에서 모두 0.999 이상의 직선성을 보였다.
- HPLC-FLD는 5수준의 표준물질을 분석하여 기울기로 작성하였으며, 0.9999이상의 직선성을 확인할 수 있었다.
- 농산물 및 토양 시료 중 benzo(a)pyrene 분석 시 적합한 전처리 분석법을 선정하기 위해 전처리 방법에 따른 회수율을 3반복 분석하였으며, dSPE 과정을 거치지 않고 MgSO4, NaCl이 함유된 QuEChERS 분석 kit를 넣고 진탕 및 원심 분리 후 여과하여 분석한 방법에서 가장 높은 수준의 추출효율을 보였다(Table 1)
- 본 연구에서 확인된 QuEChERS 분석을 활용한 신속분석 법과 현행 benzo(a)pyrene 분석 시 추출효율이 우수하여 다 양한 분야에서 사용되어 지고 있는 속슬렛 추출법과의 추출 효율을 비교⋅분석하였다. 두 분석법에 대한 3반복 회수율 분석결과, 두 분석법 모두 80% 이상의 높은 회수율을 보이는 것을 확인할 수 있었다(Table 3).
- 본 연구의 QuEChERS 분석을 활용한 신속분석법과 속슬렛 분석법과의 추출효율 비교 시 두 분석방법 모두 높은 수준의 회 수율을 확인할 수 있었다. 전처리 분석시간은 QuEChERS 분 석을 활용한 신속분석법의 경우 20분 내외로 속슬렛 추출법 960분(16시간) 대비 97% 이상 분석시간이 확실하게 개선되었으며, 사용되는 유기용매의 양을 비교한 결과 QuEChERS 분석을 활용한 신속분석법은 10 mL 내외인 반면 속슬렛 추출법은 300 mL로 96%이상 유기용매 사용량을 절감할 수 있 었다.
- HPLC-FLD는 최신문헌을 통 해 benzo(a)pyrene의 여기파장과 방출파장을 조사한 후[9], 기기분석하여 최적의 감도를 보이는 파장을 확인하였다. 분석 컬럼은 Venusil PAH (Agela Technologies, Wilmington, USA)를 사용하였으며, 여기파장 260 nm, 방출파장 420 nm 에서 가장 높은 감도를 보였다. GC-MS/MS 및 LC-MS/MS 는 scan 분석하여 최적의 Multiple-Reaction Monitoring (MRM) 조건을 확인하였다.
- 선정한 추출방법 중 추출용매에 따른 회수율을 3반복 분석한 결과, 4종의 추출용매 중 acetonitrile을 이용하여 분석 하였을 때 가장 높은 수준의 추출효율을 보였다(Table 2).
- 시험결과 HPLC-FLD, GC-MS/MS, LC-MS/MS 모두 4개 의 시료에서 유효회수율 범위인 70~120%를 만족하였고, 변이계수 또한 10%이하의 값으로 산출되었다.
- 본 연구의 QuEChERS 분석을 활용한 신속분석법과 속슬렛 분석법과의 추출효율 비교 시 두 분석방법 모두 높은 수준의 회 수율을 확인할 수 있었다. 전처리 분석시간은 QuEChERS 분 석을 활용한 신속분석법의 경우 20분 내외로 속슬렛 추출법 960분(16시간) 대비 97% 이상 분석시간이 확실하게 개선되었으며, 사용되는 유기용매의 양을 비교한 결과 QuEChERS 분석을 활용한 신속분석법은 10 mL 내외인 반면 속슬렛 추출법은 300 mL로 96%이상 유기용매 사용량을 절감할 수 있 었다. 이러한 결과를 [11, 12]의 선행연구결과를 토대로 분석 해보았을 때 QuEChERS 분석법이 농약의 잔류분석 등 다양 한 분야에서 분석시간 단축과 유기용매 사용을 줄일 수 있는 분석법으로 널리 사용되고 있어 농산물(쌀, 풋고추, 홍고추) 및 토양 시료 중 benzo(a)pyrene 분석시험에서도 동일한 결과 를 얻을 수 있는 것으로 사료된다.
- 회수율 시험은 쌀, 고추(풋고추, 홍고추), 토양에 대해 7반복으로 수행하였으며, HPLC-FLD의 검출한계는 1.8~3.1 μg/kg, 정량한계는 5.4~9.4 μg/kg이였으며, 회수율 및 반복⋅재현성은 86.1~98.2%, 0.6~8.7%로 산출되었다.
후속연구
- 따라서 농산물(쌀, 풋고추, 홍고추) 및 토양 시료 중 benzo(a)pyrene 분석 시 본 연구의 신속분석법을 활용한다면 효율적인 분석이 가능할 것이며, 본 연구에서 수행한 농산물(쌀, 풋고추, 홍고추) 이외 다른 농산물 에 대해서도 QuEChERS 분석법을 개선한 분석법에 대한 연 구가 이루어진다면 농산물 및 토양 중 benzo(a)pyrene 안전 관리체계 구축에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
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