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문제 정의
- This study was supported by the Ministry of Food and Drug Safety (MFDS), Republic of Korea under the paradigm of a study on risk assessment and establishment of new analytical method for safety management of pesticide residues in food (19161MFDS020).
- 따라서 본 연구에서는 트리아졸계 살균제인 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸 2종의 잔류량을 신속⋅간편하게 동시 분석할 수 있는 공정 시험법을 마련하고 농산물 5종(현미, 감자, 대두, 감귤, 고추)에 모두 적용할 수 있도록 개발하여 국내외의 재배 및 수입 농산물에 대한 안전 관리의 기초자료로 활용하고자 하였다.
- 국내에서는 모니터링 목적으로 다종농약다성분 분석법을 이용하고 있으며 최근 국외에서는 잔류농약 연구에서 비교적 적은 용매 사용량과 시간 소모가 적고 간편한 장점이 있는 QuEChERS법을 이용하여 시료 전처리 및 모니터링을 하고 있다[8-10]. 또한 트리아졸계 살균제를 QuEChERS법을 이용하여 추출 및 d-SPE정제한 연구가 보고되어 있어[4,10] 본 연구에서는 다종농약다성분 분석법과 QuEChERS법을 비교 검토하였다. 다종농약다성분 분석법을 검토한 결과 평균 회수율은 감귤 및 대두에서 메펜트리플루코나졸의 경우 72.
제안 방법
- Matrix-matched calibration을 위해 0.0025, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.125 및 0.25 μg/mL의 농도가 되도록 검체의 무처리 추출물(matrix)로 희석하여 90% 이상의 matrix가 첨가된 표준용액을 조제하였다.
- 시험법의 정확성 및 반복성을 검증하기 위하여 무처리 시료에 혼합표준용액을 첨가하여 회수율 실험을 진행하였다. 대표 농산물 5품목에 대하여 처리농도는 정량한계, 정량한계 10배, 정량한계 50배에 해당하는 농도로 처리하여 각각 5반복 실험을 수행하였고 평균 회수율과 상대표준편차(relative standard deviation; RSD)를 계산하여 시험법의 정확성과 반복성을 평가하였다. 또한 전남대학교와 실험실 간 검증을 진행하여 시험법의 유효성을 확인하였다.
- 대표 농산물 5품목에 대하여 처리농도는 정량한계, 정량한계 10배, 정량한계 50배에 해당하는 농도로 처리하여 각각 5반복 실험을 수행하였고 평균 회수율과 상대표준편차(relative standard deviation; RSD)를 계산하여 시험법의 정확성과 반복성을 평가하였다. 또한 전남대학교와 실험실 간 검증을 진행하여 시험법의 유효성을 확인하였다.
- 25 μg/mL의 농도가 되도록 검체의 무처리 추출액으로 희석하여 각 농도 범위에 대한 peak의 면적으로 검량선(matrix-matched calibration)을 작성하였고, 검량선의 결정계수(coefficient of correlation; r2 )를 구하였다. 또한 크로마토그램 상에서 신호 대 잡음비(signalto noise ratio; S/N ratio)가 각각 3, 10 이상이 되는 농도를 검출한계, 정량한계로 설정하였다. 시험법의 정확성 및 반복성을 검증하기 위하여 무처리 시료에 혼합표준용액을 첨가하여 회수율 실험을 진행하였다.
- 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸 2종을 동시분석하기 위하여 LC-MS/MS (Waters, Miliford, USA)를 사용하였고, 분석용 컬럼으로 Cadenza CD-C18 (2.0 mm I.D. × 50 mm L., 3.0 μm)을 선택하였으며 이동상으로 0.1% 포름산 함유된 아세토니트릴과 0.1 % 포름산 함유된 물을 사용하여 최적의 기울기 용리 방식을 적용하였다.
- 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸 표준품을 각각 20.12 mg, 20.16 mg씩 칭량하고 20 mL의 아세토니트릴에 용해하여 1,000 μg/mL (1,000 ppm)의 표준원액을 조제하였다.
- 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸은 Log Pow 값이 각각 3.4, 3.29로 비극성을 띄며, 구조내의 방향족 화합물에 –CH3 같은 조색단이 포함되어 있어 흡광계수를 증가시켜 LC-UVD로의 분석이 가능하지만[12], positive list system(PLS) 도입에 따른 정량한계 0.01 mg/kg 수준을 확보할 수 있고, 선택성이 높아 낮은 농도 수준에서도 분석 가능한 액체크로마토그래프-질량분석기를 분석기기로 사용하였다.
- 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸의 혼합표준용액, 무처리 시료, 혼합표준용액을 첨가한 회수율 시료의 크로마토그램을 서로 비교하여 선택성(selectivity)을 확인하였다. 무처리 시료 크로마토그램 상의 메펜트리플루코나졸과 트리트코나졸의 머무름 시간과 질량 대 전하비(m/z)가 동일한 간섭물질이 검출되지 않아 본 시험법은 대상 성분을 분석함에 있어 높은 분리능과 선택성을 확인할 수 있었다(Fig.
- 13) 표준 용액(1 μg/mL)을 각각 일정한 속도(10 μL/min)로 질량검출기에 직접 주입하여 [M+H]+형태인 질량을 각각 398m/z, 318 m/z을 확인하였고, 이 때 각 성분의 cone voltage는 5-50 V로 조절하여 메펜트리플루코나졸의 경우 35 V, 트리티코나졸의 경우 25 V로 최적화하였다. 분석 대상의 선택성과 검출강도를 극대화시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM(multiple reaction monitoring) mode로 분석하였고 collisioncell의 collision energy를 조절하여 최적의 product ion을 선정하여 감도가 가장 큰 이온을 정량이온(quantification ion)으로, 다음으로 큰 이온을 정성이온(qualification ion)으로 설정하였다(Table 2).
- 시험법의 유효성을 확인하기 위해 외부 실험기관인 전남대학교와 실험실간 검증을 수행하고자 개발한 시험법을 제공한 후 동일한 방법으로 분석을 수행하여 회수율 및 상대표준편차를 비교하였다. 검증 결과 각 농도별 평균회수율은 메펜트리플루코나졸은 73.
- 01 mg/kg이었다. 시험법의 정량한계, 정량한계 10배, 정량한계 50배 수준인 0.01과 0.1, 0.5 mg/kg의처리농도로 5반복 회수율 실험을 통해 시험법의 정확성, 정밀도 및 반복성을 평가하였다. 그 결과 메펜트리플루코나졸의 평균회수율은 92.
- 또한 크로마토그램 상에서 신호 대 잡음비(signalto noise ratio; S/N ratio)가 각각 3, 10 이상이 되는 농도를 검출한계, 정량한계로 설정하였다. 시험법의 정확성 및 반복성을 검증하기 위하여 무처리 시료에 혼합표준용액을 첨가하여 회수율 실험을 진행하였다. 대표 농산물 5품목에 대하여 처리농도는 정량한계, 정량한계 10배, 정량한계 50배에 해당하는 농도로 처리하여 각각 5반복 실험을 수행하였고 평균 회수율과 상대표준편차(relative standard deviation; RSD)를 계산하여 시험법의 정확성과 반복성을 평가하였다.
- 세 가지 추출 방법 및 d-SPE 정제법(MgSO4 1200 mg, PSA 400 mg, C18 400 mg, GCB 45mg) 모두 적용하였을 때 회수율은 Table 3과 같이 우수하였다. 최근 농산물품질관리원에서 CEN 15662법을 이용한 동시다성분 시험법을 사용하고 있고, 식약처가 고시하고 있는 동시다성분 시험법의 단점을 보완하여 향후 시험법의 통일성을 위하여 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸의 시료 전처리는 CEN 15662법을 이용한 추출 후 d-SPE로 정제하는 시험법으로 확립하였다.
- 혼합표준원액을 0.0025-0.25 μg/mL의 농도가 되도록 검체의 무처리 추출액으로 희석하여 각 농도 범위에 대한 peak의 면적으로 검량선(matrix-matched calibration)을 작성하였고, 검량선의 결정계수(coefficient of correlation; r2 )를 구하였다.
- 혼합표준원액을 무처리 시험용액으로 희석하여 0.0025-0.25 μg/mL농도로 제조한 후 5 μL를 LC-MS/MS에 주입하여 분석한결과 농산물 5품목 표준용액에서 결정계수(r2) 0.99이상으로높은 직선성(linearity)을 확인하였다.
- 확립된 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸 동시시험법은 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원의 ‘식품 등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인(MFDS, 2016)’과 ‘CODEX가이드라인(CAC/GL 40-1993, 2003)’에 근거하여 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection; LOD), 정량한계(limit of quantification; LOQ), 회수율(recovery), 정확성(accuracy), 반복성(repeatability)에 대해 유효성을 검증하였다.
대상 데이터
- 메펜트리플루코나졸(99.4%) 표준품은 원제사인 BASF에서 제공받아 사용하였고, 트리티코나졸(99.2%) 표준품은 SigmaAldrich (Buchs, Switzerland)에서 구입하여 사용하였다(Fig.1). 아세토니트릴(acetonitrile)은 HPLC 등급으로 Merck(Darmstadt, Hesse, Germany)에서 구입하여 사용하였고, 추출에 사용된 kit (Part No.
- 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm × 13 mm)는 Teknokroma(Sant Cugat Del Valles, Barcelona, Spain)에서 구입하여 사용하였고 검체는 식품공전에서 규정하는 대표 농산물 5품목 현미(곡류), 감자(서류), 대두(두류), 감귤(과일류), 고추(채소류)를 무농약 농산물로 구입하여 균질화한 후 밀봉된 용기에 담아 –50 ℃에 보관한 후 실험에 사용하였다.
- 01 mg/kg 수준을 확보할 수 있고, 선택성이 높아 낮은 농도 수준에서도 분석 가능한 액체크로마토그래프-질량분석기를 분석기기로 사용하였다. 분석용 컬럼으로는 비극성 작용기와 상호 작용하여 극성 간섭물질과의 분리가 가능한 C18 컬럼을 사용하였다. 트리아졸계 살균제의 경우 이동상으로는 0.
- 1). 아세토니트릴(acetonitrile)은 HPLC 등급으로 Merck(Darmstadt, Hesse, Germany)에서 구입하여 사용하였고, 추출에 사용된 kit (Part No. 186006813)는 Waters (Leinster, Ireland)로부터 구입하였으며 정제에 사용된 kit (Part No. 5982-0029)는 Agilent Technologies (California, USA)에서 구입하였다. 멤브레인 필터(PTFE, 0.
- 분석용 컬럼으로는 비극성 작용기와 상호 작용하여 극성 간섭물질과의 분리가 가능한 C18 컬럼을 사용하였다. 트리아졸계 살균제의 경우 이동상으로는 0.1% 포름산 함유된 아세토니트릴과 0.1% 포름산 함유된 물을 사용하여 [M+H]+이온 생성이 용이함으로 본 연구에서 사용하였다[13]. 메펜트리플루코나졸(exact mass: 397.
이론/모형
- 1 % 포름산 함유된 물을 사용하여 최적의 기울기 용리 방식을 적용하였다. 각 대상 성분의 이온화 방식은 ESI (electro-spray ionization)법의 positive-ionmode를 사용하였으며 LC-MS/MS의 분석조건은 Tables 1,2와 같다.
성능/효과
- 시험법의 유효성을 확인하기 위해 외부 실험기관인 전남대학교와 실험실간 검증을 수행하고자 개발한 시험법을 제공한 후 동일한 방법으로 분석을 수행하여 회수율 및 상대표준편차를 비교하였다. 검증 결과 각 농도별 평균회수율은 메펜트리플루코나졸은 73.7-109.5%, 트리티코나졸은 74.1-112.8%이었고 RSD는 각각 15.3%, 10.4%이하로 확인되었다(Tables4, 5). 두 실험실 간의 회수율 결과에 따른 평균값은 메펜트리플루코나졸의 경우 83.
- 99이상으로높은 직선성(linearity)을 확인하였다. 검출한계는 크로마토그램 상에서 신호 대 잡음비(S/N ratio)를 3 이상, 정량한계는10 이상 되는 최소검출농도를 구하고 시험법의 희석배수를 고려하여 계산한 결과 시험법의 검출한계는 0.003 mg/kg,정량한계는 0.01 mg/kg이었다. 시험법의 정량한계, 정량한계 10배, 정량한계 50배 수준인 0.
- 5 mg/kg의처리농도로 5반복 회수율 실험을 통해 시험법의 정확성, 정밀도 및 반복성을 평가하였다. 그 결과 메펜트리플루코나졸의 평균회수율은 92.3-115.3%, 트리티코나졸의 평균회수율은91.4-108.5%이었고 RSD는 각각 4.5%, 5.3% 이하로 확인되었다(Tables 4, 5). 본 연구 결과는 Codex 가이드라인의 잔류농약 분석 기준(CODEX Alimentarius Commission, 2003)및 식품의약품안전평가원 ‘식품 등 시험법 마련 표준절차에관한 가이드라인(MFDS, 2016)’에 부합하므로 농산물 중 잔류하는 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸을 분석하는데 적합함을 확인 할 수 있었다.
- 또한 트리아졸계 살균제를 QuEChERS법을 이용하여 추출 및 d-SPE정제한 연구가 보고되어 있어[4,10] 본 연구에서는 다종농약다성분 분석법과 QuEChERS법을 비교 검토하였다. 다종농약다성분 분석법을 검토한 결과 평균 회수율은 감귤 및 대두에서 메펜트리플루코나졸의 경우 72.1%, 90.4%이었으며 트리티코나졸의 경우 44.5%, 93.4%로 감귤에서 회수율이 저조하였으며 전처리에 소모되는 시간 및 용매량이 많은 단점이 있다. QuEChERS법은 사용되는 시약의 종류에 따라 original법과 acetate염을 첨가하는 AOAC 2007.
- 메펜트리플루코나졸(exact mass: 397.08)과 트리티코나졸(exact mass: 317.13) 표준 용액(1 μg/mL)을 각각 일정한 속도(10 μL/min)로 질량검출기에 직접 주입하여 [M+H]+형태인 질량을 각각 398m/z, 318 m/z을 확인하였고, 이 때 각 성분의 cone voltage는 5-50 V로 조절하여 메펜트리플루코나졸의 경우 35 V, 트리티코나졸의 경우 25 V로 최적화하였다.
- 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸의 혼합표준용액, 무처리 시료, 혼합표준용액을 첨가한 회수율 시료의 크로마토그램을 서로 비교하여 선택성(selectivity)을 확인하였다. 무처리 시료 크로마토그램 상의 메펜트리플루코나졸과 트리트코나졸의 머무름 시간과 질량 대 전하비(m/z)가 동일한 간섭물질이 검출되지 않아 본 시험법은 대상 성분을 분석함에 있어 높은 분리능과 선택성을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 혼합표준원액을 무처리 시험용액으로 희석하여 0.
- 본 연구 결과는 Codex 가이드라인의 잔류농약 분석 기준(CODEX Alimentarius Commission, 2003)및 식품의약품안전평가원 ‘식품 등 시험법 마련 표준절차에관한 가이드라인(MFDS, 2016)’에 부합하므로 농산물 중 잔류하는 메펜트리플루코나졸과 트리티코나졸을 분석하는데 적합함을 확인 할 수 있었다.
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