남세균은 수계나 토양 생태계에서 질소 고정 능력으로 인해 질소순환 과정에 중요한 역할을 하는 미생물로 다양한 산업분야에서 활용될 수 있는 유용 물질을 생산할 수 있다. 또한 일부 종은 수생태계에서 유해조류 번성을 일으켜 수자원의 이용을 제한한다. 일반적으로 생물소재은행은 관련 연구를 위해 남세균 배양주를 제공하는 역할을 한다. 하지만 국내 생물소재은행에서는 남세균의 체계적인 보존이 미비한 실정이다. 본 연구에서는 국내에서 분리한 Trichormus variabilis (syn. Anabaena variabilis)를 대상으로 알긴산 마이크로캡슐을 이용한 동결보존기술을 개발하였다. 동결보존제만 사용하는 일반 동결보존법과 세포를 마이크로캡슐에 포집한 후 동결보존제를 혼합하는 두 가지 방법으로 실험을 수행하였고 각각의 효율을 비교하였다. T. variabilis 동결보존 후 35일간 재배양하여 세포수를 비교한 결과 두 가지 동결보존법 모두 재생에 성공하였으며, 초기 농도 1.0 × 105 cells에서 마이크로캡슐 방법은 6.7 × 106 cells로, 일반 동결 보존법은 1.1 × 107 cells로 증가되었다. 또한 배양 14일 후 T. variabilis 세포의 부정형 형태를 발견하였다. 세포 소기관을 관찰하기 위해 투과전자현미경(TEM) 분석을 하였고 lacunae와 lipid body의 크기가 줄어든 것을 확인하였다. 세포 형태와 관련된 mreB 유전자가 동결보존 전에 비해 동결 보존 후 발현량이 54.7%로 감소된 것을 확인하였다. 본 연구결과를 통해 향후 사상성 남조류에 대하여 보존제와 마이크로캡슐을 이용한 동결보존이 가능할 것으로 기대된다.
남세균은 수계나 토양 생태계에서 질소 고정 능력으로 인해 질소순환 과정에 중요한 역할을 하는 미생물로 다양한 산업분야에서 활용될 수 있는 유용 물질을 생산할 수 있다. 또한 일부 종은 수생태계에서 유해조류 번성을 일으켜 수자원의 이용을 제한한다. 일반적으로 생물소재은행은 관련 연구를 위해 남세균 배양주를 제공하는 역할을 한다. 하지만 국내 생물소재은행에서는 남세균의 체계적인 보존이 미비한 실정이다. 본 연구에서는 국내에서 분리한 Trichormus variabilis (syn. Anabaena variabilis)를 대상으로 알긴산 마이크로캡슐을 이용한 동결보존기술을 개발하였다. 동결보존제만 사용하는 일반 동결보존법과 세포를 마이크로캡슐에 포집한 후 동결보존제를 혼합하는 두 가지 방법으로 실험을 수행하였고 각각의 효율을 비교하였다. T. variabilis 동결보존 후 35일간 재배양하여 세포수를 비교한 결과 두 가지 동결보존법 모두 재생에 성공하였으며, 초기 농도 1.0 × 105 cells에서 마이크로캡슐 방법은 6.7 × 106 cells로, 일반 동결 보존법은 1.1 × 107 cells로 증가되었다. 또한 배양 14일 후 T. variabilis 세포의 부정형 형태를 발견하였다. 세포 소기관을 관찰하기 위해 투과전자현미경(TEM) 분석을 하였고 lacunae와 lipid body의 크기가 줄어든 것을 확인하였다. 세포 형태와 관련된 mreB 유전자가 동결보존 전에 비해 동결 보존 후 발현량이 54.7%로 감소된 것을 확인하였다. 본 연구결과를 통해 향후 사상성 남조류에 대하여 보존제와 마이크로캡슐을 이용한 동결보존이 가능할 것으로 기대된다.
Cyanobacteria are microorganisms which have important roles in the nitrogen cycle due to their ability to fix nitrogen in water and soil ecosystems. They also produce valuable materials that may be used in various industries. However, some species of cyanobacteria may limit the use of water resource...
Cyanobacteria are microorganisms which have important roles in the nitrogen cycle due to their ability to fix nitrogen in water and soil ecosystems. They also produce valuable materials that may be used in various industries. However, some species of cyanobacteria may limit the use of water resources by causing harmful algal blooms in water ecosystems. Many culture collection depositories provide cyanobacterial strains for research, but their systematic preservation is not well-developed in Korea. In this study, we developed a method for the cryopreservation of the cyanobacteria Trichormus variabilis (syn. Anabaena variabilis), using alginate microcapsules. Two approaches were used for the experiments and their outputs were compared. One of the methods involved the cryopreservation of cells using only a cryoprotectant and the other used the cryoprotectant within microcapsules. After cryopreservation for 35 days, cells preserved with both methods were successfully regenerated from the initial 1.0 × 105 cells/ml to a final concentration of 6.7 × 106 cells/ml and 1.1 × 107 cells/ml. Irregular T. variabilis shapes were found after 14 days of regeneration. T. variabilis internal structures were observed by transmission electron microscopy (TEM), revealing that lipid droplets were reduced after cryopreservation. The expression of the mreB gene, known to be related to cell morphology, was downregulated (54.7%) after cryopreservation. Cryopreservation using cryoprotectant alone or with microcapsules is expected to be applicable to other filamentous cyanobacteria in the future.
Cyanobacteria are microorganisms which have important roles in the nitrogen cycle due to their ability to fix nitrogen in water and soil ecosystems. They also produce valuable materials that may be used in various industries. However, some species of cyanobacteria may limit the use of water resources by causing harmful algal blooms in water ecosystems. Many culture collection depositories provide cyanobacterial strains for research, but their systematic preservation is not well-developed in Korea. In this study, we developed a method for the cryopreservation of the cyanobacteria Trichormus variabilis (syn. Anabaena variabilis), using alginate microcapsules. Two approaches were used for the experiments and their outputs were compared. One of the methods involved the cryopreservation of cells using only a cryoprotectant and the other used the cryoprotectant within microcapsules. After cryopreservation for 35 days, cells preserved with both methods were successfully regenerated from the initial 1.0 × 105 cells/ml to a final concentration of 6.7 × 106 cells/ml and 1.1 × 107 cells/ml. Irregular T. variabilis shapes were found after 14 days of regeneration. T. variabilis internal structures were observed by transmission electron microscopy (TEM), revealing that lipid droplets were reduced after cryopreservation. The expression of the mreB gene, known to be related to cell morphology, was downregulated (54.7%) after cryopreservation. Cryopreservation using cryoprotectant alone or with microcapsules is expected to be applicable to other filamentous cyanobacteria in the future.
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문제 정의
하지만 국내 생물소재은행에서는 남세균의 체계적인 보존이 미비한 실정이다. 본 연구에서는 국내에서 분리한 Trichormus variabilis (syn. Anabaena variabilis)를 대상으로 알긴산 마이크로캡슐을 이용한 동결보존기술을 개발하였다. 동결보 존제만 사용하는 일반 동결보존법과 세포를 마이크로캡슐에 포집한 후 동결보존제를 혼합하는 두 가지 방법으로 실험을 수행하였고 각각의 효율을 비교하였다.
본 연구에서는 동결보존 대상인 남세균 T. variabilis를 일반적인 세포와 마이크로캡슐에 포집하여 동결보존제에 동결보존 한 경우의 효율을 비교하였다. 그 결과 두 가지 방법 모두 초기 농도 1.
variabilis의 동결보존 재생 14일 후 세포의 형태가 커지고 부정형적으로 변하는 것을 관찰하였다. 형태관련 유전자 별현과의 연관성을 확인하기 위하여, 남세균의 세포 형태와 연관된 mreB 유전자의 발현도를 quantitative PCR을 통해 확인해 보았다. Melting peak를 확인 해 보면 16s rRNA와 mreB 유전자 모두 84−85℃ 사이에서 peak를 보였다.
제안 방법
Ct 값은 Bio-Rad CFX manger software 제품의 기본설정을 이용하였고 relative expression의 경우 16s rRNA를 internal control로 사용하고, mreB를 목표 유전자로 설정하여 2–∆∆CT 방법으로 발현량을 산출하였다[35].
DNase digestion 후 잔여 DNA의 여부를 확인하기 위하여, DNA template가 들어가지 않은 조건(no template control, NTC)과 역전사 효소가 없는 조건(no reverse transcription control, NRTC)을 negative control로 사용하였다[34].
그 후 LabopassTM SYBR Green Q Master(Cosmogentech, Korea)를 이용해 internal control 16s rRNA primer (F-AGCCACACTGGGACTGAGACA, R-TCGCCCATTGCGGAAA)로 pre-denature 94℃에서 3분간, amplification 94℃에서 10초간, 56℃에서 30초간 40회의 증폭 과정을 반복하였다[32]. MreB 유전자의 경우 선행연구에 서 이용된 primer (Q7- AAATGTGATTGCCCTGCGA, Q8- TGCCTTCATTGACCCTCTGAA)를 이용하여 16s rRNA와 같은 온도, 시간 조건으로 quantitative PCR을 수행하였다(CFX connect real-time PCR, Bio-Rad, USA) [33].
PCR 과정에서 목표 유전자가 특이적으로 증폭되었는지 확인하기 위하여 melting curve 분석을 수행하였다. 40회의 증폭반응 후에 65℃에서 95℃까지 온도를 올리며 유전자 이중 가닥의 녹는 점을 확인하였다.
T. variabilis 세포는 동결보존 전과 후에 광학현미경, 투과전자현미경(TEM)을 통하여 세포의 변형 여부를 비교하였다. 마이크로캡슐의 경우 육안으로도 동결보존 전과 동결보존 후 14일간 재생 시 T.
T. variabilis는 동결보존 전, 동결보존 직후, 재생 14일, 재생 35일에 광학현미경(Nikon eclipse Ni, Nikon, Japan)으로 형태를 관찰하였고 10 × 4, 10 × 10, 10 × 20, 10 × 40배의 배율로 광학현미경 화상 자료를 확보하였다.
T. variabilis를 대상으로 동결보존제만 이용한 방법과 마이크로캡슐을 이용한 방법으로 동결보존 했을 때 재생효율을 비교하였다. 마이크로캡슐에 포집 된 T.
T. variabilis의 RNA는 Qiagen RNeasy mini kit (74104, Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였고 M-MuLV Reverse Transcriptase (NEB M0253, New England Biolabs Ltd., USA)를 사용하여 제공된 실험방법에 기술된 대로 cDNA를 합성하였다(https://international.neb.com/ protocols/2016/04/26/first-strand-cdna-synthesisstandard-protocol-neb-m0253). Random primer mix, buffer, dNTP, reverse transcriptase를 넣고 25℃에서 5분간, 42℃에서 한 시간 반응 후 반응 중지를 위해 65℃에서 20분간 처리하였다(First Strand cDNA Synthesis Quick Protocol).
Random primer mix, buffer, dNTP, reverse transcriptase를 넣고 25℃에서 5분간, 42℃에서 한 시간 반응 후 반응 중지를 위해 65℃에서 20분간 처리하였다(First Strand cDNA Synthesis Quick Protocol). 그 후 LabopassTM SYBR Green Q Master(Cosmogentech, Korea)를 이용해 internal control 16s rRNA primer (F-AGCCACACTGGGACTGAGACA, R-TCGCCCATTGCGGAAA)로 pre-denature 94℃에서 3분간, amplification 94℃에서 10초간, 56℃에서 30초간 40회의 증폭 과정을 반복하였다[32]. MreB 유전자의 경우 선행연구에 서 이용된 primer (Q7- AAATGTGATTGCCCTGCGA, Q8- TGCCTTCATTGACCCTCTGAA)를 이용하여 16s rRNA와 같은 온도, 시간 조건으로 quantitative PCR을 수행하였다(CFX connect real-time PCR, Bio-Rad, USA) [33].
Anabaena variabilis)를 대상으로 알긴산 마이크로캡슐을 이용한 동결보존기술을 개발하였다. 동결보 존제만 사용하는 일반 동결보존법과 세포를 마이크로캡슐에 포집한 후 동결보존제를 혼합하는 두 가지 방법으로 실험을 수행하였고 각각의 효율을 비교하였다. T.
동결보존 재생 시 세포 형태 변화와 관련하여 특정 유전자 발현에 변화가 생겨 형태적 변화가 있었을 것으로 보고 세포 형태와 관련된 유전자의 발현도를 비교하였다. 세포 형태에 관여하는 유전자 중 mreB 유전자는 세포골격을 형성하는 액틴을 생성하는 유전자로 대부분의 박테리아에서 세포 모양과 분열에 관여하는 유전자이다[46, 47].
동결보존된 시료를 재배양 한 후 혈구계수기를 이용하여 살아있는 세포수를 세는 방법으로 실험하였다. 동결보존된 T.
해외의 자원은행과 달리 국내 자원은행에서는 남세균이나 조류에 대한 동결보존 연구가 미비하다. 따라서 국내에서 분리한 사상성의 남세균인 Trichormus variabilis (sys. Anabaena variabilis)에 대하여 일반적인 세포와 동결보존제를 이용한 방법, 마이크로캡슐을 이용한 포집 방법 두 가지 방법을 이용해 동결하고 재생효율을 비교해 보았다. 아울러 재생 시 형태적인 변화를 광학 및 투과전자현미경을 통해 관찰하고 세포의 형태와 관련된 mreB 유전자의 발현도도 함께 측정하였다.
따라서 본 연구에서는 한국의 담수수계에서 분리한 사상성 남세균인 T. variabilis를 일반적인 동결보존법과 마이크로캡슐을 이용한 동결보존법으로 각기 나누어 실험하여 그 효과를 비교하였다. 또 동결보존 후 재배양 시 나타나는 형태적 유전적 차이를 관찰하기 위해 광학 및 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 세포 및 세포 내부의 형태 변화를 관찰하고 세포벽 분화와 관련된 유전자의 발현도를 비교하였다.
variabilis를 일반적인 동결보존법과 마이크로캡슐을 이용한 동결보존법으로 각기 나누어 실험하여 그 효과를 비교하였다. 또 동결보존 후 재배양 시 나타나는 형태적 유전적 차이를 관찰하기 위해 광학 및 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 세포 및 세포 내부의 형태 변화를 관찰하고 세포벽 분화와 관련된 유전자의 발현도를 비교하였다.
variabilis를 대상으로 동결보존제만 이용한 방법과 마이크로캡슐을 이용한 방법으로 동결보존 했을 때 재생효율을 비교하였다. 마이크로캡슐에 포집 된 T. variabilis와 포집되지 않은 세포를 10%의 DMSO에 4일간 동결보존 했다가 해동하여 96 well plate에 BG11과 함께 옮겨 담고 세포 재생을 확인하였다. 초기 농도는 1.
마이크로캡슐을 이용한 동결보존을 위하여, T. variabilis 세포를 원심분리 하여 상등액은 버리고 3.0 × 106 세포를 모은 후 1 ml의 2.5% 알긴산염(sodium alginate)과 혼합해 마이크로피펫을 이용하여 2.5%의 염화 칼슘(calcium chloride) 용액에 30 µl/drop으로 떨어뜨렸다.
variabilis 세포의 수를 혈구계수기로 측정하였다. 마이크로캡슐의 경우 homogenizer (Bio-vortexer homogenizer EF16425A, Daigger Scientific Inc., USA)를 이용하여 캡슐을 파쇄한 후 세포의 수를 측정하였다.
이 후 에탄올 농도별(50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%)로 처리하여 탈수시키고 1 ml의 propylene oxide를 세번 반복 처리하였다. 마지막으로 propylene oxide에 희석된 레진(resin)을 50%, 75%, 100% 순으로 처리하고 치환이 완료되면 70℃에서 레진을 굳혀주었다. 레진 블록은 PT-X ultramicrotome (RMC Products; Boeckeler Instruments, Tucson, USA)으로 얇게 절편으로 자른 후 JEM-1010 transmission electron microscope (JEOL, Japan)으로 분석하였다[30, 31].
variabilis의 배양은 광주기(L:D) 12시간: 12시간, 온도 20℃, 습도 35%, 광도 20 μmol/m2 /s 조건에서 BG11 액체배지를 이용하여 500 ml culture flask에 200 rpm의 교반 속도로 배양한 후 이용하였다. 배양된 세포는 주기적인 계대배양을 통해 유지하였고, 혈구계수기(hemocytometer, SigmaAldrich, USA)를 이용하여 관측하고 농도를 측정하였다(Nikon eclipse Ni, Nikon, Japan). 계대배양 한 지 20일 이내의 T.
Anabaena variabilis)에 대하여 일반적인 세포와 동결보존제를 이용한 방법, 마이크로캡슐을 이용한 포집 방법 두 가지 방법을 이용해 동결하고 재생효율을 비교해 보았다. 아울러 재생 시 형태적인 변화를 광학 및 투과전자현미경을 통해 관찰하고 세포의 형태와 관련된 mreB 유전자의 발현도도 함께 측정하였다. 그 결과 세포와 동결보존제를 이용한 방법이 초기 1.
상온에서 10분간 기다린 후 체를 이용하여 bead만 모아 10%의 DMSO에 넣었다. 이 후 선행연구를 통해 밝혀진 최적의 동결조건으로 자동동결장치(Planer Limited Middlesex, UK)를 이용해 분당 1℃씩 -40℃까지 온도를 내렸다가 10분간 유지하고 다시 분당 1℃씩 -70℃까지 재 냉각 하는 2단계 동결보존법으로 동결하였다[11, 12, 29]. 4일간 -70℃에 보관 후 다음 실험에 사용하였다(Fig.
배양 배지를 이용해 3회 이상 세척하고 1% osmium tetroxide 1 ml 넣고 4℃에 한 시간 고정 후 상등액 을 버리고 증류수로 3회 세척했다. 이 후 에탄올 농도별(50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%)로 처리하여 탈수시키고 1 ml의 propylene oxide를 세번 반복 처리하였다. 마지막으로 propylene oxide에 희석된 레진(resin)을 50%, 75%, 100% 순으로 처리하고 치환이 완료되면 70℃에서 레진을 굳혀주었다.
마이크로캡슐의 경우 한 well당 배지 200 µl에 bead 1개씩 넣고 20℃, 20 μmol/m2 /s, 광주기(L:D) 12시간: 12시간, 습도 35% 조건 하에서 재배양 하였다. 재배양 한 지 35일이 되었을 때 마이크로캡슐 및 각 well에 있는 T. variabilis 세포의 수를 혈구계수기로 측정하였다. 마이크로캡슐의 경우 homogenizer (Bio-vortexer homogenizer EF16425A, Daigger Scientific Inc.
그러나 본 연구에서는 재생 14일 후에 세포 크기가 커지고 구형이 아닌 부정형의 모양으로 변하였는데 이는 기존 남세균이나 사상성 미세조류의 동결보존에서 알려진 바 없었다. 재생 35일 후에는 커진 세포 내에서 여러 개의 세포로 분화된 모습을 원래 세포막이 일부 파괴된 것과 함께 관찰하였다(Figs. 3D and E). 이는 T.
투과전자현미경(TEM)을 이용하여 마이크로캡슐을 이용한 동결보존 전과 후 세포의 구조적인 차이를 관찰해 보았다. 동결보존 전 세포 내부는 주름 구조를 보이는 틸라코이드막과(thylakoid membrane) 내부의 검은색 지질체(lipid body), 회색의 카복시좀(carboxysome)과 틸라코이드막에 둘러 쌓인 하얀 공간의 lacunae가 관찰된다.
현재 국내에서 분리된 Oscillatoria, Gitlerinema와 같은 사상성 남세균과 Chlorella, Chlamydomonas, Mychonastes와 같은 녹조류에 대한 동결보존을 연구하고 있으며 동결보존 후 재배양이 되는 것을 부분적으로 확인하였다. 이번 T.
대상 데이터
Trichormus variabilis는 낙동강생물자원관의 담수생물자원은행에서 Trichormus variabilis FBCC 010004 배양주를 분양받아 실험에 이용하였다(https://fbcc.nnibr.re.kr/fbcc). T.
배양된 세포는 주기적인 계대배양을 통해 유지하였고, 혈구계수기(hemocytometer, SigmaAldrich, USA)를 이용하여 관측하고 농도를 측정하였다(Nikon eclipse Ni, Nikon, Japan). 계대배양 한 지 20일 이내의 T. variabilis 세포를 동결보존실험에 사용하였다.
연구자들은 대체로 생물소재은행(culture collection)을 통해 남세균 자원을 분양받아 연구에 이용한다. 대부분의 미생물 은행 및 조류은행에서는 남세균을 액체 배지를 이용한 계대배양으로 유지하며 관리하고 있다[9, 11−13].
성능/효과
3D). 35일간의 배양 후에는 배양 14일차 보다 더 큰 군집 모양의 세포와 완전히 재생된 사상성의 T. variabilis를 관찰 할 수 있었고 군집 형태의 세포를 확대하면 외곽의 원래 세포막과 함께 수많은 세포가 모여있는 것을 관찰하였다(Figs. 3E and 3F).
PCR 과정에서 목표 유전자가 특이적으로 증폭되었는지 확인하기 위하여 melting curve 분석을 수행하였다. 40회의 증폭반응 후에 65℃에서 95℃까지 온도를 올리며 유전자 이중 가닥의 녹는 점을 확인하였다. DNase digestion 후 잔여 DNA의 여부를 확인하기 위하여, DNA template가 들어가지 않은 조건(no template control, NTC)과 역전사 효소가 없는 조건(no reverse transcription control, NRTC)을 negative control로 사용하였다[34].
2). 4일간의 동결보존 후 35일 동안 배양한 실험에서 마이크로캡슐 포집방법보다 T. variabilis 세포만 동결보존제에 넣어 보존하는 방법이 약 2배가량 세포 농도가 높았다. 두 경우 모두 초기 세포수인 1.
T. variabilis 동결보 존 후 35일간 재배양하여 세포수를 비교한 결과 두 가지 동결보존법 모두 재생에 성공하였으며, 초기 농도 1.0 × 105 cells에서 마이크로캡슐 방법은 6.7 × 106 cells로, 일반 동결보존법은 1.1 × 107 cells로 증가되었다.
T. variabilis의 동결보존 재생 14일 후 세포의 형태가 커지고 부정형적으로 변하는 것을 관찰하였다. 형태관련 유전자 별현과의 연관성을 확인하기 위하여, 남세균의 세포 형태와 연관된 mreB 유전자의 발현도를 quantitative PCR을 통해 확인해 보았다.
3A and 3C). 광학현미경을 통해 관찰한 캡슐 내 세포도 동결보존 전의 경우 사상성이 실처럼 잘 나타나지만 동결보존 후에는 세포의 모양이 커지고 원래의 구형이 아닌 부정형으로 나타났다(Figs. 3B, 3D). 이때 세포의 형태가 변하면서 사상성이 많이 끊어진 것을 관찰하였다(Fig.
그 결과 두 가지 방법 모두 초기 농도 1.0 × 105 cells에 비해 동결보존 후 35일간 배양 시 마이크로캡슐 방법은 67배, 일반 동결보존법은 110배 증가한 세포수를 보였다.
그 결과 세포와 동결보존제를 이용한 방법이 초기 1.0 × 105 cells/well 보다 35일간 배양 후 일반 동결보존법은 6.7 × 106 cells/well, 마이크로캡슐을 이용한 동결보존법은 1.4 × 107 cells/well로 세포수가 증가하였다.
기존에 알려진 mreB의 기능과 본 연구에서 확인한 발현량 감소결과로 볼 때, 동결보존 직후에 세포 스트레스로 인해 mreB 유전자 발현이 줄어들어 재생 14일에는 세포 형태를 유지하지 못했고, 재생 35일에는 다시 mreB 유전자 발현이 정상화 되어 세포분열이 되며 세포 형태가 정상화 되었을 것으로 추측된다(Figs. 3D−F).
동결보존 후 재생 시 T. variabilis의 형태가 기존에 알려진 연구결과와 다르게 변하는 것을 관찰하였다(Fig. 3D). 일반적으로 동결보존 후 재생에는 형태가 거의 변하지 않거나 대체로 동결보존 직후 탈수작용으로 세포수축이나 엽록체 파괴를 일으킨다고 알려져 있었다[7, 27, 37].
0 × 105 cells에 비해 동결보존 후 35일간 배양 시 마이크로캡슐 방법은 67배, 일반 동결보존법은 110배 증가한 세포수를 보였다. 따라서 동결보존 후 재생효율이 마이크로캡슐 방법에 비해 일반 동결보존법이 세포 농도 증가에 더 유리하였다(Fig. 2). T.
이 mreB 유전자가 발현되지 않게 유전자를 조작하거나 세포에 중금속 스트레스를 주면 유전자 발현량이 줄어 Anabaena의 세포 모양이 부정형으로 변한다고 알려져 있다[33]. 따라서 본 연구에서는 세포 재생 후 T. variabilis의 형태 변화와 관련하여 동결보존 전과 직후에 mreB 유전자 발현량을 quantitative PCR을 이용해 확인해 보았고 그 결과 동결보존 직후에 유전자 발현이 0.547로 동결보존 전에 비하여 54.7%로 감소하 였다(Fig. 5). 기존에 알려진 mreB의 기능과 본 연구에서 확인한 발현량 감소결과로 볼 때, 동결보존 직후에 세포 스트레스로 인해 mreB 유전자 발현이 줄어들어 재생 14일에는 세포 형태를 유지하지 못했고, 재생 35일에는 다시 mreB 유전자 발현이 정상화 되어 세포분열이 되며 세포 형태가 정상화 되었을 것으로 추측된다(Figs.
variabilis 세포는 동결보존 전과 후에 광학현미경, 투과전자현미경(TEM)을 통하여 세포의 변형 여부를 비교하였다. 마이크로캡슐의 경우 육안으로도 동결보존 전과 동결보존 후 14일간 재생 시 T. variabilis의 농도가 증가하여 캡슐의 색이 확연히 녹색으로 변하는 것을 확인하였다(Figs. 3A and 3C). 광학현미경을 통해 관찰한 캡슐 내 세포도 동결보존 전의 경우 사상성이 실처럼 잘 나타나지만 동결보존 후에는 세포의 모양이 커지고 원래의 구형이 아닌 부정형으로 나타났다(Figs.
variabilis 세포의 부정형 형태를 발견하였다. 세포 소기관을 관찰하기 위해 투과전자현미경(TEM) 분석을 하였고 lacunae와 lipid body의 크기가 줄어든 것을 확인하였다. 세포 형태와 관련된 mreB 유전자가 동결보존 전에 비해 동결보존 후 발현량이 54.
세포 소기관을 관찰하기 위해 투과전자현미경(TEM) 분석을 하였고 lacunae와 lipid body의 크기가 줄어든 것을 확인하였다. 세포 형태와 관련된 mreB 유전자가 동결보존 전에 비해 동결보존 후 발현량이 54.7%로 감소된 것을 확인하였다. 본 연구결과를 통해 향후 사상성 남조류에 대하여 보존제와 마이크로캡슐을 이용한 동결보존이 가능할 것으로 기대된다.
동결보존 전 세포 내부는 주름 구조를 보이는 틸라코이드막과(thylakoid membrane) 내부의 검은색 지질체(lipid body), 회색의 카복시좀(carboxysome)과 틸라코이드막에 둘러 쌓인 하얀 공간의 lacunae가 관찰된다. 세포소기관은 원형의 형태로 보여주고 있으며 이러한 소기관 사이에 세포질(cytoplasm)로 채워져 있음을 확인하였다(Figs. 4A and 4B). 동결보존 직후에는 세포질이 감소하여 세포가 수축되면서 표면에 깊은 주름이 생기는 검은 줄이 나타나거나 lacunae와 lipid body의 크기가 줄어든 것으로 확인된다(Figs.
이 값을 2–∆∆CT 수식에 대입한 후 동결보존 전을 1로 fold change했을 때 동결보존 직후 mreB 유전자의 발현도가 0.547로 동결보존 전에 비하여 54.7%로 줄어든 것을 확인하였다(Fig. 5).
또한 지질 합성에 문제가 생기면 세포벽의 성분 변화로 인해 탄력성이 떨어지면서 세포벽이 더 단단해질 수 있다고 보고되었다[41]. 이렇게 지질 합성 경로에 변화가 온 세포는 외형적으로 구형에서 부정형으로 변하고 이로 인하여 동일한 표면적의 세포벽으로 유지하는 세포 내부의 부피는 구형에 비해 축소될 수 있어 결과적으로 부정형으로 변화된 세포는 구형에 비해 cytoplasm의 부피를 줄여 외부 스트레스에 반응할 것으로 예상된다.
전체적으로 동결보존 전에는 thylakoid가 원형을 이루고 있으며 cytoplasm이 세포 내에 충진되어 있지만, 동결보존 직후나 재배양 14일 후에는 thylakoid가 겹겹이 쌓여 있거나 뭉쳐져 있고 cytoplasm이 줄어 든 것을 확인하였다(Figs. 4B−4F).
한 개의 마이크로캡슐 안에는 최소 4.5 × 106 cells/well에서 최대 1.0 × 107 cells/well까지 평균 6.7 × 106 ± 2.2 × 106 cells/well이 관찰되었고 동결보존제를 이용해 세포만 동결보존한 경우 최소 9.3 × 106 cells/well에서 최대 1.4 × 107 cells/well까지 평균 1.1 × 107 ± 1.6 × 106 cells/well이 관찰되었다(Fig. 2).
후속연구
variabilis의 연구결과로 마이크로캡슐을 이용한 동결보존법이 다른 사상성 남세균에도 적용이 가능할 것으로 예상되나 다른 종에 대한 적용범위와 동결보존 조건 등은 후속연구를 통하여 추가적으로 확인할 필요가 있다. 또한 동결보존 기간이 길어질수록 재생률이 낮아지고 재생 시간도 오래 걸린다는 여러 선행 연구결과가 있었기 때문에 동결보존된 T. variabilis에 대하여 동결보존 기간에 따른 생존률 변화를 지속적으로 추적하는 연구도 필요하다[11, 36].
7%로 감소된 것을 확인하였다. 본 연구결과를 통해 향후 사상성 남조류에 대하여 보존제와 마이크로캡슐을 이용한 동결보존이 가능할 것으로 기대된다.
이번 T. variabilis의 연구결과로 마이크로캡슐을 이용한 동결보존법이 다른 사상성 남세균에도 적용이 가능할 것으로 예상되나 다른 종에 대한 적용범위와 동결보존 조건 등은 후속연구를 통하여 추가적으로 확인할 필요가 있다.
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