[논문]마황 3종 판별을 위한 KASP 마커 개발과 활용

박보름; 이선희; 한경문; 황진우; 김형일; 백선영

doi:10.22889/kjp.2022.53.4.226

마황 3종 판별을 위한 KASP 마커 개발과 활용
Development and Utilization of KASP Markers for the Identification of Three Types of Ephedra Herbs 원문보기

생약학회지, v.53 no.4, 2022년, pp.226 - 233

박보름 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 첨단분석센터) , 이선희 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 첨단분석센터) , 한경문 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 첨단분석센터) , 황진우 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 첨단분석센터) , 김형일 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 첨단분석센터) , 백선영 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 첨단분석센터)

Abstract ▼ AI-Helper

Ephedra herbs are defined as stem of Ephedra sinica , Ephedra intermedia and Ephedra equisetina in the Korean Pharmacopoeia. It is important to use pure herbs to derive the safety and efficacy of herbal medicine. However, the identification of these herbs by conventional taxonomic methods is difficult. Recently, many studies have applied these DNA barcoding for the identification of herbal medicinal species using standard DNA markers. In this study, we report a case study in which the identification of Ephedra species was done by DNA barcoding. For identification of Ephedra species, 17 samples were collected, and a reference DNA barcode library was developed using 6 markers (rbcL, matK, ITS2, ycf1, ycf3, and rpoC2). To develop KASP-SNP markers, we selected 4 markers (ycf1, ycf3, rpl2, and rbcL), which were able to distinguish three Ephedra species. In the result, the specific markers for each of the three Ephedra were clustered into FAM-positive section, whereas non-targeted plants were clustered either HEX-positive or negative section. Therefore, we have developed KASP assay that allow rapid and easy Ephedra species identification using three KASP markers.

주제어

표/그림 (8)

표 Table I. Voucher specimens of plant raw materials and accession number
표 Table II. PCR primer used for sequencing
표 Table III. Oligonucleotide sequence
표 Table IV. SNP location and genotype
표 Table V. Ephedra-specific KASP marker sequence
표 Table VI. KASP analysis results of raw materials
그림 Fig. 1. KASP assay result on plant raw materials. Four KASP markers analysis 11 Ephera plants. E. sinica (orange cycle, ●) emit FAM on NEFM21ES(a) and NEFM21Ephedra(d). E.intermedia (purple cycle, ●) emit FAM on NEFM21EI(b) and NEFM21Ephedra(d). E. equisetina (green cycle, ●) emit FAM on NEFM21EE(c) and NEFM21Ephedra(d). DW(black triangle, ▲), FAM positive oligo (red triangle, ▲) and HEX positive oligo(blue triangle, ▲) are used as negative and positive controls for fluorescence values and which do not have a direct meaning.
표 Table VII. KASP analysis results of diet herbal medicines and food

AI 본문요약
AI-Helper

제안 방법

KASP 마커의 SNP 판별력 확인 − 제작한 KASP 마커가 SNP자리의1개의 염기서열의 차이에 따라 다른 형광값을 나타내는지 확인하기 위해서 Macrogen(Seoul, Korea)에서 단일 가닥의 올리고 뉴클레오타이드를 제작하였다
염기서열 분석결과와 GenBanK에 등록된 염기서열 정보를 바탕으로 ycf3의 324번째 뉴클레오타이드에서 초마황 특이 SNP를, ycf1의 2586번째 뉴클레오타이드에서 중마황 특이SNP를, rpoC2의 2074번째 뉴클레오타이드에서 목적마황 특이 SNP를, rbcL의 103번째 뉴클레오타이드에서 마황속 특이적인 SNP를 찾았다(Table IV). 그리고 4개의 SNP를 표적으로 하는 LGC genomics (Teddington, UK)에 KASP 마커 제작을 의뢰하였다. 모든 KASP 마커는 표적하는 마황과 결합했을 때 FAM 형광 양성을 보이도록 제작되었으며 각각의 프라이머 서열은 Table V과 같다.
추출한 NA는 –20°C 이하 냉동실에 보관한 뒤, KASP 분석을 수행하였다.

대상 데이터

식물재료 − 마황 3종은 식품의약품안전평가원과 동의보감소재은행에서 분양 받아 사용하였다. 그 외에 마황속 식물이거나 에페드린과 관련된 식물을 허브마을(청주), American Herbal Pharma(Soquel, CA, USA), 한국생명공학연구원 해외생물소재센터에서 구매하여 사용하였다. 식물 재료는 5.
그 외에 마황속 식물이거나 에페드린과 관련된 식물을 허브마을(청주), American Herbal Pharma(Soquel, CA, USA), 한국생명공학연구원 해외생물소재센터에서 구매하여 사용하였다. 식물 재료는 5.8S ribosomal RNA - internal transcribed spacer 2, maturase K(matK), ribulose 1, 5 bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit(rbcL), RNA polymerase beta subunit (rpoC2), YCF1, YCF3 유전자 분석을 통해 종 분석 이후 사용하였다(Table I).
식물재료 − 마황 3종은 식품의약품안전평가원과 동의보감소재은행에서 분양 받아 사용하였다
제품에 대한 분석법 적용 − 시중에 유통되고 있는 제품에서의 분석법 적용을 확인하기 위해서 마황이 들어있을 것으로 예상되는 다이어트 제품을 5개와 인터넷 직구를 통해 차 1종을 구매하였다

성능/효과

1). 따라서 제작한 KASP 마커는 SNP 위치에서 서로 다른 형광이 붙여진 2개의 Forward primer가 경쟁 반응을 하며 유전자형에 따라 FAM 또는 HEX 형광을 방출하는 것을 확인하였다. 이에따라 제작한 올리고 뉴클레오타이드는 대상 식물의 DNA를 대신해서 형광값에 대한 양성대조군으로 사용 가능함을 확인하였다.
KASP 마커의 SNP 판별력 확인 − 제작한 KASP 마커가 SNP자리의1개의 염기서열의 차이에 따라 다른 형광값을 나타내는지 확인하기 위해서 Macrogen(Seoul, Korea)에서 단일 가닥의 올리고 뉴클레오타이드를 제작하였다. 실험결과, FAM 양성 올리고 뉴클레오타이드(red triangle)와 KASP 마커가 결합하여 FAM 양성을 띠고 X축에 위치하였으며, HEX 양성 올리고 뉴클레오타이드(blue triangle)와 결합하여 HEX 양성을 띠고 Y축에 위치하였다(Fig. 1).
torreyana 1개)에 대해 11개의 유전자 구간의 염기서열 분석을 진행하였다. 염기서열 분석결과와 GenBanK에 등록된 염기서열 정보를 바탕으로 ycf3의 324번째 뉴클레오타이드에서 초마황 특이 SNP를, ycf1의 2586번째 뉴클레오타이드에서 중마황 특이SNP를, rpoC2의 2074번째 뉴클레오타이드에서 목적마황 특이 SNP를, rbcL의 103번째 뉴클레오타이드에서 마황속 특이적인 SNP를 찾았다(Table IV). 그리고 4개의 SNP를 표적으로 하는 LGC genomics (Teddington, UK)에 KASP 마커 제작을 의뢰하였다.
따라서 제작한 KASP 마커는 SNP 위치에서 서로 다른 형광이 붙여진 2개의 Forward primer가 경쟁 반응을 하며 유전자형에 따라 FAM 또는 HEX 형광을 방출하는 것을 확인하였다. 이에따라 제작한 올리고 뉴클레오타이드는 대상 식물의 DNA를 대신해서 형광값에 대한 양성대조군으로 사용 가능함을 확인하였다.

후속연구

본 연구를 통해서 개발된 KASP 마커 4종은 마황속 식물중에서 초마황, 중마황, 목적마황을 판별할 수 있으며 혼합이나 가공된 제품 형태에서도 마황의 함유 여부를 확인할 수 있어 한약재 감별뿐만 아니라 인터넷 직구를 통한 부정 불법 식품을 확인할 수 있는 유용한 시험법으로 활용 가능하다고 생각된다.

참고문헌 (23)

Ministry of Food and Drug Safety (2019) The Korean Pharmacopoeia, Cheongju, Korea.？
Ministry of Food and Drug Safety (2021) 2021 Food & Drug Statistical Yearbook, Cheongju, Korea.？
Gonzalez-Juarez, D. E., Escobedo-Moratilla, A., Flores, J., Hidalgo-Figueroa, S., Martinez-Taguena, N., Morales-Jimenez, J., Muniz-Ramirez, A., Pastor-Palacios, G., Perez-Miranda, S., Ramirez-Hernande,z A., Trujillo, J. and Bautista, E. (2020) A review of the ephedra genus: distribution, ecology, ethnobotany, phytochemistry and pharmacological properties. Molecules 25: 3283.？

상세보기
Flora of China Editorial Committee (2018) Flora of China. Flora of China.？
Nasir, E. (1981) Flora of Pakistan. In Agriculture Research Conference, Islamabad (Pakistan).？
Kitani, Y., Zhu, S., Omote, T., Tanaka, K., Batkhuu, J., Sanchir, C., Fushimi, H., Mikage, M. and Komatsu, K. (2009) Molecular analysis and chemical evaluation of ephedra plants in Mongolia. Biol. Pharm. Bull. 32: 1235-1243.？

상세보기
Lee, S. H., Yoon, J. H., Lee, G. S. and Ju, Y. S. (2016) The morphological identification for three authentic species of ephedrae herba. Korean Herb. Med. Inf. 4: 43-49.？
Su, X. L., Lin, R. C., Wong, S. K., Tsui, S. K. and Kwan, S. Y. (2003) Identification and characterisation of the chinese herb langdu by LC?MS/MS analysis. Phytochemical Analysis 14: 40-47.？

상세보기
Han, E. H., Kim, Y. H. and Lee, S. W. (2015) Development of molecular biological techniques for the differentiation of medicinal plant species. J. Plant. Biotechnol. 42: 6-12.？

원문보기 상세보기
Cui, J. F., Zhou, T. H., Zhang, J. S. and Lou, Z. C. (1991) Analysis of alkaloids in chinese ephedra species by gas chromatographic methods. Phytochemical Analysis 2: 116-119.？

상세보기
Zhao, Y. S., Xie, L. X., Mao, F. Y., Cao, Z., Wang, W. P., Zhao, Q. P. and Zhang, X. H. (2016) Identification of ephedra species by phylogenetic analyses using matK and ITS1 sequences. Acta Soc. Bot. Pol. 85: 3492.？

상세보기
Long, C., Kakiuchi, N., Takahashi, A., Komatsu, K., Cai, S. and Mikage, M. (2004) Phylogenetic analysis of the DNA sequence of the non-coding region of nuclear ribosomal DNA and chloroplast of ephedra plants in China. Planta med. 70: 1080-1084.？

상세보기
Kakiuchi, N., Nakajima, I., Kurita, Y., Long, C., Cai, S. and Mikage, M. (2006) Studies on cultivated ephedra plants in inner mongolia autonomous region and ningxia hui autonomous region. Biol. Pharm. Bull. 29: 746-749.？

상세보기
Wang, G., Bai, X., Chen, X., Ren, Y. and Han, J. (2022) Development of a genus-universal nucleotide signature for the identification and supervision of ephedra-containing products. Molecules 27: 2342.？

상세보기
Zheng, Y., Gao, H., Song, M., Lin, Y., Fan, J., Zhang, Y. and Liu, X. (2021) Identification of plant materials containing ephedrine alkaloids based on DNA barcoding and TaqMan real-time PCR assay. Acta Physiol. Plant 43: 1-10.？

상세보기
Techen, N., Khan, I. A., Pan, Z. and Scheffler, B. E. (2006) The use of polymerase chain reaction (PCR) for the identification of ephedra DNA in dietary supplements. Planta Med. 72: 241-247.？

상세보기
Guo, Y., Tsuruga, A., Yamaguchi, S., Oba, K., Iwai, K., Sekita, S. and Mizukami, H. (2006) Sequence analysis of chloroplast chlB gene of medicinal ephedra species and its application to authentication of ephedra herb. Biol. Pharm. Bull. 29: 1207-1211.？

상세보기
Chen, X., Cui, Y., Nie, L., Hu, H., Xu, Z., Sun, W., Gao, T., Song, J. and Yao, H. (2019) Identification and phylogenetic analysis of the complete chloroplast genomes of three ephedra herbs containing ephedrine. Biomed. Res. Int. 2019: 5921725.？

상세보기
Park, B. R., Lee, S. H., Eom, K. Y., Noh, E. Y., Han, K. M., Hwang, J. W., Kim, H. I. and Baek, S. Y. (2022) Development of method using LC-ESI-MS/MS and KASP for identification of Gymnema sylvestre in food. J. Food Hyg. Saf. 37: 46-54.？

원문보기 상세보기
Abourashed, E. A., El-Alfy, A. T., Khan, I. A. and Walker, L. (2003) Ephedra in perspective-a current review. Phytother. Res. 17: 703-712.？

상세보기
Ministry of Food and Drug Safety (2022) Food Sanitation Act, Cheongju, Korea.？
Korea Customs Service (2021) Key feature of 2021 e-commerce import. Available from: https://eiec.kdi.re.kr/policy/materialView.do?num222185. Accessed 23 October 2022.？
Korea Customs Service (2021) Korea customs service - ministry of food and drug safety joint inspection at the customs clearance stage for pre-block harmful foods on direct overseas purchase. Available from: https://www.korea.kr/news/press-ReleaseView.do?newsId156462141. Accessed 23 October 2022.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증