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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 김치에서 분리한 유산균의 내열성, 항균활성, 단백질분해능, 장내부착능 및 항산화능 검증 등을 통한 프로바이오틱스 제품으로서의 가능성 확인을 목표로 하였다.
- 본 연구의 목적은 한국 전통 음식 김치에서 분리한 유산균의 특성을 연구하기 위해 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였다. 한국의 전통 발효 식품에서 젖산균을 확인하기 위해 분리된 균주의 그람염색을 수행한 후 Macrogen에서 16S rRNA 분석 결과, DKGF9(Lactobacillus plantarum), DKGF1(Lactobacillus paracasei), DKGF8(Lactobacillus casei), DK207(Lactobacillus casei), DK211(Lactobacillus casei)이 확인되었다.
- 한국의 전통 발효 식품에서 젖산균을 확인하기 위해 분리된 균주의 그람염색을 수행한 후 Macrogen에서 16S rRNA 분석 결과, DKGF9(Lactobacillus plantarum), DKGF1(Lactobacillus paracasei), DKGF8(Lactobacillus casei), DK207(Lactobacillus casei), DK211(Lactobacillus casei)이 확인되었다. 우리는 한국의 전통 발효 식품인 김치에서 분리된 5가지 LAB의 기본 생물학적 활성에 대한 실험을 수행했다. 37℃, 55℃, 65℃, 75℃에서 각각 5분, 15분 5균주의 내열성 확인 결과, 상업 균주인 Lactobacillus acidophilus LA-5의 내열성과 유사하거나 더 높음을 보여주었다.
제안 방법
- 0.75 mM 1,10-Phenanthroline(Sigma) 용액 및 2.5 mM Ferrous Sulfate Heptahydrate(Sigma) 용액을 제조하고, PBS(pH 7.4)를 제조하여 위의 용액들과 전처리한 샘플 시료를 96 Well plate(SPL life sciences, Korea)에 각각 50 μL씩 혼합한 후 마지막으로 반응 시약인 20 mM Hydrogen peroxide(Junsei chemical) 용액을 혼합하였다.
- 2,2'-Azobis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(Sigma)과 증류수를 혼합하여 7 mM의 ABTS solution을 제조하고, Potassium persulfate(Sigma)와 증류수를 혼합하여 2.45 mM Potassium persulfate을 제조하였다.
- 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine(Sigma) 및 3차 증류수를 혼합하여 10 mM TPTZ 용액을 제조한 후, HCl(Daejung chemical & metals, Korea) 및 3차 증류수를 혼합하여 제조한 40 mM HCl Solution을 혼합하여 TPTZ solution을 제조하였다.
- Cork borer로 Skim milk(BD Difco) 배지 정중앙에 Well을 뚫은 후 100–150 μL의 균을 분주하였다. 37℃ Incubator에서 24, 48, 72시간 동안 배양하여 시간마다 환의 직경을 측정하였다.
- 25 N HCl, 대조구, 접종하지 않은 MRS broth를 차례로 150μL 분주하였다. 4℃에서 흡수 후, 37℃ incubator에서 1 시간 간격으로 환의 유무를 확인하여 직경을 측정하여 항균력을 비교하였다.
- Ferric reducing antioxidant power(FRAP) 활성은 Fe(Ⅲ)-2,4,6-tripyridyls-triazine(TPTZ)가 항산화 물질에 의해 Fe(Ⅱ)-TPTZ로 환원되는 원리를 이용하여 분광법으로 측정하는 방법으로 Khanizadeh의 방법(2008)을 일부 수정하여 실험하였다[15]. 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine(Sigma) 및 3차 증류수를 혼합하여 10 mM TPTZ 용액을 제조한 후, HCl(Daejung chemical & metals, Korea) 및 3차 증류수를 혼합하여 제조한 40 mM HCl Solution을 혼합하여 TPTZ solution을 제조하였다.
- Mueller Hinton Agar(BD Difco)에 병원균을 도말 및 건조한 후 Cork borer로 well을 뚫어 분리균주 5종, 상용균주 L. acidophilus LA-5, 0.25 N HCl, 대조구, 접종하지 않은 MRS broth를 차례로 150μL 분주하였다.
- 1. Survivals of DK strains and LA-5 that are treated for 5, 15 minutes at 37℃, 55℃, 65℃, and 75℃, after separating the strains from the kimchi. All values were mean±SD of triplicates.
- 16–18시간 후 멸균된 Cap tube에 10 mL씩 소분하였다. Water bath에 37℃, 55℃, 65℃, 75℃에 각 5, 15분씩 진탕 배양하여 십진희석 후 BCP agar(Eiken chemical, Japan)에 37℃, 48시간 동안 배양 후 집락수를 계수하였다.
- 김치로부터 LAB를 분리한 후, 균주의 동정은 16S rRNA sequencing을 사용하였다. DKGF9는 16SrRNA 유전자 sequencing에서 Lactobacillus plantarum, DKGF1은 Lactobacillus paracasei로 확인되었다(GeneBank 서열과 99% 유사성).
- 김치에서 분리하여 전처리한 균주 5종을 Mucin(Sigma)에 대한 결합능을 측정하였다. Fig.
- 김치에서 분리하여 전처리한 분리 균주 5종을 37℃, 55℃, 65℃, 75℃에서 5, 15분 동안 진탕 배양시킨 후 생균수의 변화를 나타내었다(Fig. 1). 분리 균주 5종 모두 생장 온도와 가장 가까운 37℃(대조구)와 비교하였을 때, 온도가 높아질수록 낮은 생존율을 보였으며, 또한 진탕 배양시킨 시간이 길어질수록 낮을 생존율을 확인하였다.
- 반응하지 않은 균체 제거를 위해 0.85% NaCl로 각 Well을 5회 세척한 뒤 mucin에 부착된 균체회수를 위해 각 Well에 0.1% Triton X-100(Sigma) 100 μL 분주 후 Pipetting하였다.
- 배지에 Well 형성 후 균주 5종을 분주하여 흡수시킨 후, 1시간 간격으로 환 형성 및 관찰한 결과를 확인하였다(Table 2). 5종의 균주 모두 상용균주 L.
- 배지에 구멍 뚫은 후 균을 분주하여 24, 48, 72시간 동안 배양한 결과는 확인하였다(Table 3). 5종의 균주 모두 상용균주 L.
- 분리 균주의 동정을 위하여 일차적으로 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였으며, 16s rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 형태학적 특성은 그람염색 후 현미경으로 관찰하였으며, 생화학적 특성 조사는 API 50 Kit(biomerieux, France)를 이용하여 37℃에서 48시간 배양 후 실시하였고, 실험 결과는 Bergey’s manual과 API LAB PLUS 프로그램(API50 CHL, biomerieux, France)으로 비교분석하였다.
- 선별된 균 DKGF1(L. paracasei ), DKGF8(L. casei ), DKGF9(L. plantarum )를 사용한 발효유의 항산화 활성 기능을 평가하기 위해 ABTS radical scavenging activity, DPPH radical scavenging activity, FRAP assay, Hydroxyl radical scavenging assay에 대한 결과를 확인하였다(Figs. 3–6).
- 사용된 병원균주는 LB broth(BD Difco)에서 배양하였다. 실험은 Chang 등의 방법을 변형하여, Cork borer(11 mm)를 이용하여 well 형성 후 억제환의 직경(mm, diameter)을 측정하였다. 3차 계대배양한 분리 균주 5종과 LB Broth에 37℃에서 16–18시간 간격으로 3차 계대 배양한 병원균 3종(E.
- 형태학적 특성은 그람염색 후 현미경으로 관찰하였으며, 생화학적 특성 조사는 API 50 Kit(biomerieux, France)를 이용하여 37℃에서 48시간 배양 후 실시하였고, 실험 결과는 Bergey’s manual과 API LAB PLUS 프로그램(API50 CHL, biomerieux, France)으로 비교분석하였다. 유전학적 동정을 위한 16S rRNA sequencing은 유니버설 프라이머(universal primer)인 27F와 1492R을 이용하여 16S rRNA 유전자 부분을 증폭하여 DNA 서열분석(Magrogen, Korea)을 의뢰하여 확인하였다.
- 85% NaCl(Junsei Chemical, Japan) 용액에 십진희석한 뒤 시료로 사용하였다. 이 후, 희석액을 MRS agar(BD Difco, USA)에 도말하여 접종한 다음 37℃에서 48시간 동안 배양 후 MRS Agar에 나타나는 유백색의 단일 콜로니를 선택적으로 분리하기 위해 형성된 콜로니를 Loop으로 분산 도말하였다. 37℃에서 48시간 동안 배양 후 MRS agar 상에 나타난 콜로니를 백금이로 채집하여 MRS broth(BD Difco)에 3회 계대 배양하여 얻어진 균주를 20%(v/v) glycerol MRS broth에 현탁하고, –72℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.
- 형태학적 특성은 그람염색 후 현미경으로 관찰하였으며, 생화학적 특성 조사는 API 50 Kit(biomerieux, France)를 이용하여 37℃에서 48시간 배양 후 실시하였고, 실험 결과는 Bergey’s manual과 API LAB PLUS 프로그램(API50 CHL, biomerieux, France)으로 비교분석하였다.
대상 데이터
- DPPH 라디칼 소거능 측정은 Cho(2011)의 방법을 응용하여 실험하였다[14]. 2,2-Diphenyl-1- picryhydrazyl(Sigma)과 Ethanol(Samchun, Korea)을 혼합하여 0.2 mM DPPH 시약을 제조하여 사용하였다. DPPH 시약과 전처리한 Sample을 1:1 비율로 혼합하여 상온에 30분 동안 반응 후 microplate reader 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 병원성 세균은 KCTC(한국생명공학연구원 생물자원센터)에서 분양받은 Escherichia coli KCTC1682, Salmonella enterica KCTC2054, Bacillus cereus KCTC3624 3종을 균주로 사용하였다. 사용된 병원균주는 LB broth(BD Difco)에서 배양하였다.
- 실험에는 관능검사를 통해 적절한 발효취와 조직감을 가진 김치를 선발하여 멸균된 0.85% NaCl(Junsei Chemical, Japan) 용액에 십진희석한 뒤 시료로 사용하였다. 이 후, 희석액을 MRS agar(BD Difco, USA)에 도말하여 접종한 다음 37℃에서 48시간 동안 배양 후 MRS Agar에 나타나는 유백색의 단일 콜로니를 선택적으로 분리하기 위해 형성된 콜로니를 Loop으로 분산 도말하였다.
이론/모형
- ABTS 라디칼 소거능 측정은 Re(1999)의 방법을 응용하여 실험하였다[13]. 2,2'-Azobis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(Sigma)과 증류수를 혼합하여 7 mM의 ABTS solution을 제조하고, Potassium persulfate(Sigma)와 증류수를 혼합하여 2.
- DPPH 라디칼 소거능 측정은 Cho(2011)의 방법을 응용하여 실험하였다[14]. 2,2-Diphenyl-1- picryhydrazyl(Sigma)과 Ethanol(Samchun, Korea)을 혼합하여 0.
- 장내부착능 측정은 Azcarate-Peril(2009)의 방법을 통해 Mucin을 이용하여 수행하였다[11]. 96 Well plate(SPL Life Sciences, Korea)에 Mucin solution(Sigma-Aldrich, USA) 100 μL 분주 후 4℃, 24시간 동안 반응시켰다.
성능/효과
- 우리는 한국의 전통 발효 식품인 김치에서 분리된 5가지 LAB의 기본 생물학적 활성에 대한 실험을 수행했다. 37℃, 55℃, 65℃, 75℃에서 각각 5분, 15분 5균주의 내열성 확인 결과, 상업 균주인 Lactobacillus acidophilus LA-5의 내열성과 유사하거나 더 높음을 보여주었다. 장내부착능에서는 선발균주 모두 상용균주와 비교했을 때 107 CFU/mL 이상으로 우수한 결합능을 보여주었고, KCTC(한국생명공학연구원 생물자원센터)에서 분양받은 Escherichia coli KCTC1682, Salmonella enterica KCTC2054, Bacillus cereus KCTC3624 3종을 활용한 항균활성 결과, 모든 균주는 상업용 균주인 L.
- paracasei DKGF1이 가장 큰 직경을 갖고 있어 단백질분해능력이 가장 우수한 것으로 나타났다. 5개의 균주로부터 선택된 3개의 균주는 ABTS, DPPH, FRAP, Hydroxyl radical scanenging 활성을 포함하여 다양한 항산화활성 효과를 나타냈다. 결과적으로, 5가지 균주 중에서 우수한 기능성을 갖는 L.
- 분리 균주 5종 모두 생장 온도와 가장 가까운 37℃(대조구)와 비교하였을 때, 온도가 높아질수록 낮은 생존율을 보였으며, 또한 진탕 배양시킨 시간이 길어질수록 낮을 생존율을 확인하였다. 5종의 균주 모두 상용균주 L. acidophilus LA-5와 비교하였을 때 비슷하거나 우수한 생존율을 확인하였다.
- 배지에 Well 형성 후 균주 5종을 분주하여 흡수시킨 후, 1시간 간격으로 환 형성 및 관찰한 결과를 확인하였다(Table 2). 5종의 균주 모두 상용균주 L. acidophilus LA-5와 비교하였을 때 비슷하거나 우수한 항균활성을 보였으며, DK207(L. casei )의 항균활성이 가장 높게 확인되었다.
- 배지에 구멍 뚫은 후 균을 분주하여 24, 48, 72시간 동안 배양한 결과는 확인하였다(Table 3). 5종의 균주 모두 상용균주 L. acidophilus LA-5와 비교했을 때 24시간에서 72시간으로 갈수록 환의 직경이 커지는 것을 확인할 수 있었고, DK211(L. casei )를 제외하고 모두 우수한 단백질분해 능력을 보였으며, DKGF1(L. paracasei )의 단백질분해능력이 가장 우수한 것으로 확인되었고, 앞선 실험을 바탕으로 DKGF9(L. plantarum), DKGF1(L. paracasei ), DKGF8(L. casei ) 3종을 선별하여 항산화 활성을 측정하였다.
- 6과 같다. DKGF１(L. paracasei ), DKGF8(L. casei )가 대조군인 L. acidophilus LA-5 및 다른 후보균주와 비교하였을 때 우수한 항산화능이 확인되었다. 유산균은 활성산소로부터 자신을 보호하기 위한 항산화 메커니즘을 가지고 있으며, 이들 유산균의 항산화효과에 대하여 최근에 보고되기 시작하였다[16,17].
- paracasei )의 활성이 가장 높게 확인되었다. FRAP 활성 분석 결과에서는 DKGF1(L. paracasei )가 상용균주인 Lactobacillus acidophilus LA-5보다 우수한 항산화 능력을 나타내었다. Hydroxyl radical 소거능력을 측정한 결과는 Fig.
- 김치에서 분리하여 전처리한 균주 5종을 Mucin(Sigma)에 대한 결합능을 측정하였다. Fig. 2와 같이 5종의 균주 모두 107 CFU/mL로 상용균주 LA-5(L. acidophilus)와 비슷하거나 우수한 장내부착능력을 보였으며, 그 중 DKGF9(L. plantarum), DKGF1(L. paracasei ), DKGF8(L. casei )이 비슷한 수준의 장내부착능력을 보였고, 그 다음으로 DK211(L. casei ), DK207(L .casei ) 순서로 높은 장내부착능력을 확인하였다.
- 5개의 균주로부터 선택된 3개의 균주는 ABTS, DPPH, FRAP, Hydroxyl radical scanenging 활성을 포함하여 다양한 항산화활성 효과를 나타냈다. 결과적으로, 5가지 균주 중에서 우수한 기능성을 갖는 L. paracasei DKGF1이 잠재적인 프로바이오틱스 활성을 나타내며, 건강 관련 제품의 개발에 유용한 균주라고 판단된다.
- DKGF9는 16SrRNA 유전자 sequencing에서 Lactobacillus plantarum, DKGF1은 Lactobacillus paracasei로 확인되었다(GeneBank 서열과 99% 유사성). 그러나, DKGF8, DK207, DK211은 Lactobacillus casei(GeneBank 서열과 99% 유사성)로 확인되었다(Table 1).
- acidophilus LA-5와 비교하여 유사하거나 더 높은 항균 활성을 나타냈다. 단백질분해능력 실험에서, 5개의 균주는 clear-zone의 직경이 24시간에서 72시간으로 갈수록 점차 증가하고, L. paracasei DKGF1이 가장 큰 직경을 갖고 있어 단백질분해능력이 가장 우수한 것으로 나타났다. 5개의 균주로부터 선택된 3개의 균주는 ABTS, DPPH, FRAP, Hydroxyl radical scanenging 활성을 포함하여 다양한 항산화활성 효과를 나타냈다.
- 1). 분리 균주 5종 모두 생장 온도와 가장 가까운 37℃(대조구)와 비교하였을 때, 온도가 높아질수록 낮은 생존율을 보였으며, 또한 진탕 배양시킨 시간이 길어질수록 낮을 생존율을 확인하였다. 5종의 균주 모두 상용균주 L.
- 3과 같다. 분리된 3종의 유산균 중 DKGF1(L. paracasei )가 상용균주인 L. acidophilus LA-5보다 높은 활성을 보였다. DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 Fig.
- 4와 같다. 상용균주인 L. acidophilus LA-5보다 DKGF1(L. paracasei )의 활성이 가장 높게 확인되었다. DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 Fig.
- 37℃, 55℃, 65℃, 75℃에서 각각 5분, 15분 5균주의 내열성 확인 결과, 상업 균주인 Lactobacillus acidophilus LA-5의 내열성과 유사하거나 더 높음을 보여주었다. 장내부착능에서는 선발균주 모두 상용균주와 비교했을 때 107 CFU/mL 이상으로 우수한 결합능을 보여주었고, KCTC(한국생명공학연구원 생물자원센터)에서 분양받은 Escherichia coli KCTC1682, Salmonella enterica KCTC2054, Bacillus cereus KCTC3624 3종을 활용한 항균활성 결과, 모든 균주는 상업용 균주인 L. acidophilus LA-5와 비교하여 유사하거나 더 높은 항균 활성을 나타냈다. 단백질분해능력 실험에서, 5개의 균주는 clear-zone의 직경이 24시간에서 72시간으로 갈수록 점차 증가하고, L.
- 본 연구의 목적은 한국 전통 음식 김치에서 분리한 유산균의 특성을 연구하기 위해 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였다. 한국의 전통 발효 식품에서 젖산균을 확인하기 위해 분리된 균주의 그람염색을 수행한 후 Macrogen에서 16S rRNA 분석 결과, DKGF9(Lactobacillus plantarum), DKGF1(Lactobacillus paracasei), DKGF8(Lactobacillus casei), DK207(Lactobacillus casei), DK211(Lactobacillus casei)이 확인되었다. 우리는 한국의 전통 발효 식품인 김치에서 분리된 5가지 LAB의 기본 생물학적 활성에 대한 실험을 수행했다.
후속연구
- 항산화 작용은 이러한 활성산소의 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 유산균의 항산화 작용을 검토하는 것은 활성산소에 의해 유발 되는 각종 질병들을 예방하기 위한 의미 있는 기초자료로 활용될 수 있을 것이라 사료된다. 따라서 이에 대한 특성과 차이를 파악하는 것은 프로바이오틱스의 활성을 검증하는 중요한 자료가 될 것으로 사료된다.
- 따라서 유산균의 항산화 작용을 검토하는 것은 활성산소에 의해 유발 되는 각종 질병들을 예방하기 위한 의미 있는 기초자료로 활용될 수 있을 것이라 사료된다. 따라서 이에 대한 특성과 차이를 파악하는 것은 프로바이오틱스의 활성을 검증하는 중요한 자료가 될 것으로 사료된다.
- 유산균은 활성산소로부터 자신을 보호하기 위한 항산화 메커니즘을 가지고 있으며, 이들 유산균의 항산화효과에 대하여 최근에 보고되기 시작하였다[16,17]. 따라서, 차후 항산화 능력이 우수한 프로바이오틱스로서의 유용할 것으로 사료된다.
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