[국내논문]가습기 살균제 성분(PHMG, PGH, CMIT/MIT)의 사람 피부세포 독성 및 제브라피쉬 뇌신경 독성 비교 연구 Comparison study of dermal cell toxicity and zebrafish brain toxicity by humidifier sterilizer chemicals (PHMG, PGH, CMIT/MIT)원문보기
가습기 살균제 성분(PHMG, PGH, CMIT/MIT)의 노출에 의한 다양한 장기에 대한 독성들에 대해서 피해사례는 계속 증가하고 있으나, 세포모델과 동물모델에서의 연구와 보고는 아직 부족한 실정이다. 심혈관 독성, 간 독성, 배아 독성에 대해서는 최근 알려져 있으나 뇌신경 독성과 피부 독성에 대해서는 상대적으로 적게 알려져 있다. 본 연구에서는 이들 세 가지 성분들의 피부 독성과 뇌신경 독성을 사람 피부섬유세포와 제브라피쉬 동물모델을 대상으로 각각 평가하였다. 사람피부섬유세포에 세 가지의 성분들을 0, 2, 4, 6, 8, 16 mg L-1 (최종농도)로 처리하였을 때, 세포 생존율은 PHMG가 33%로 가장 낮았고, PGH가 49%, CMIT/MIT가 40%의 생존율을 보였다. 세포배양액 내의 산화물을 정량해본 결과, PHMG 처리된 세포가 28 nmol MDA로 가장 높았고, PGH가 13 nmol MDA, CMIT가 21 nmol MDA를 보였다. 제브라피쉬 사육수조에 PHMG, PGH, CMIT를 40 mg L-1의 최종농도가 되도록 희석한 후, 제브라피쉬를 30분간 노출시킨 후 중뇌의 광시개영역(optic tectum)을 횡면 미세절단하여 산화물의 생성정도를 비교해본 결과, CMIT/MIT를 처리한 그룹에서 대조군 대비 17배 많은 산화물의 생성이 있었고, PGH를 처리한 그룹에서는 15배, PHMG를 처리한 그룹에서는 11배 많은 산화물이 관찰되어 심각한 뇌신경계 독성을 보여주었다. 결론적으로 세 가지 종류의 가습기 살균제 성분들에서 모두 심각한 피부세포 독성과 뇌신경계 독성이 나타났는데, 피부 독성은 특히 PHMG가, 뇌신경계 독성은 특히 CMIT/MIT가 가장 심각하였다. 이들 결과들은 가습기 살균제에 노출된 어린이들이 뇌신경계 독성을 통하여 언어장애, 운동장애, 발달장애 등을 겪게 될 수도 있음을 실험적으로 제시한다.
가습기 살균제 성분(PHMG, PGH, CMIT/MIT)의 노출에 의한 다양한 장기에 대한 독성들에 대해서 피해사례는 계속 증가하고 있으나, 세포모델과 동물모델에서의 연구와 보고는 아직 부족한 실정이다. 심혈관 독성, 간 독성, 배아 독성에 대해서는 최근 알려져 있으나 뇌신경 독성과 피부 독성에 대해서는 상대적으로 적게 알려져 있다. 본 연구에서는 이들 세 가지 성분들의 피부 독성과 뇌신경 독성을 사람 피부섬유세포와 제브라피쉬 동물모델을 대상으로 각각 평가하였다. 사람피부섬유세포에 세 가지의 성분들을 0, 2, 4, 6, 8, 16 mg L-1 (최종농도)로 처리하였을 때, 세포 생존율은 PHMG가 33%로 가장 낮았고, PGH가 49%, CMIT/MIT가 40%의 생존율을 보였다. 세포배양액 내의 산화물을 정량해본 결과, PHMG 처리된 세포가 28 nmol MDA로 가장 높았고, PGH가 13 nmol MDA, CMIT가 21 nmol MDA를 보였다. 제브라피쉬 사육수조에 PHMG, PGH, CMIT를 40 mg L-1의 최종농도가 되도록 희석한 후, 제브라피쉬를 30분간 노출시킨 후 중뇌의 광시개영역(optic tectum)을 횡면 미세절단하여 산화물의 생성정도를 비교해본 결과, CMIT/MIT를 처리한 그룹에서 대조군 대비 17배 많은 산화물의 생성이 있었고, PGH를 처리한 그룹에서는 15배, PHMG를 처리한 그룹에서는 11배 많은 산화물이 관찰되어 심각한 뇌신경계 독성을 보여주었다. 결론적으로 세 가지 종류의 가습기 살균제 성분들에서 모두 심각한 피부세포 독성과 뇌신경계 독성이 나타났는데, 피부 독성은 특히 PHMG가, 뇌신경계 독성은 특히 CMIT/MIT가 가장 심각하였다. 이들 결과들은 가습기 살균제에 노출된 어린이들이 뇌신경계 독성을 통하여 언어장애, 운동장애, 발달장애 등을 겪게 될 수도 있음을 실험적으로 제시한다.
Toxicities to many organs caused by humidifier disinfectants have been reported. Recently, humidifier disinfectants have been reported to cause cardiovascular, embryonic, and hepatic toxicities. This study was designed to investigate the toxic mechanism of humidifier disinfectants and compare toxici...
Toxicities to many organs caused by humidifier disinfectants have been reported. Recently, humidifier disinfectants have been reported to cause cardiovascular, embryonic, and hepatic toxicities. This study was designed to investigate the toxic mechanism of humidifier disinfectants and compare toxicity in a cellular model and a zebrafish animal model. Because brain toxicity and skin toxicity have been less studied than other organs, we evaluated toxicity in a human dermal cell line and zebrafish under various concentrations of humidifier disinfectants that included polyhexamethyleneguanidine phosphate (PHMG), oligo-[2-(2-ethoxy)-ethoxyethyl-guanidinium-chloride] (PGH) and methylchloroisothiazolinone/methylisothiazolinone (CMIT/MIT). A human dermal fibroblast cell line was treated with disinfectants (0, 2, 4, 6, 8, and 16 mg L-1) to compare their cytotoxicity. The fewest PHMG-treated cells survived (up to 33%), while 49% and 40% of the PGH- and CMIT/MIT-treated cells, respectively, survived. The quantification of oxidized species in the media revealed that the PHMG-treated cells had the highest MDA content of around 28 nM, while the PGH- and CMIT/MIT-treated cells had 13 and 21 nM MDA, respectively. As for brain toxicity, treatment of the zebrafish tank water with CMIT/MIT (final 40 mg L-1) for 30 min resulted in a 17-fold higher production of reactive oxygen species (ROS) than in the control. Treatment with PGH or PHMG (final 40 mg L-1) resulted in 15- and 11-fold higher production, respectively. The humidifier disinfectants (PHMG, PGH, and CMIT/MIT) showed severe dermal cell toxicity and brain toxicity. These toxicities may be relevant factors in understanding why some children have language disorders, motor delays, and developmental delays from exposure to humidifier disinfectants.
Toxicities to many organs caused by humidifier disinfectants have been reported. Recently, humidifier disinfectants have been reported to cause cardiovascular, embryonic, and hepatic toxicities. This study was designed to investigate the toxic mechanism of humidifier disinfectants and compare toxicity in a cellular model and a zebrafish animal model. Because brain toxicity and skin toxicity have been less studied than other organs, we evaluated toxicity in a human dermal cell line and zebrafish under various concentrations of humidifier disinfectants that included polyhexamethyleneguanidine phosphate (PHMG), oligo-[2-(2-ethoxy)-ethoxyethyl-guanidinium-chloride] (PGH) and methylchloroisothiazolinone/methylisothiazolinone (CMIT/MIT). A human dermal fibroblast cell line was treated with disinfectants (0, 2, 4, 6, 8, and 16 mg L-1) to compare their cytotoxicity. The fewest PHMG-treated cells survived (up to 33%), while 49% and 40% of the PGH- and CMIT/MIT-treated cells, respectively, survived. The quantification of oxidized species in the media revealed that the PHMG-treated cells had the highest MDA content of around 28 nM, while the PGH- and CMIT/MIT-treated cells had 13 and 21 nM MDA, respectively. As for brain toxicity, treatment of the zebrafish tank water with CMIT/MIT (final 40 mg L-1) for 30 min resulted in a 17-fold higher production of reactive oxygen species (ROS) than in the control. Treatment with PGH or PHMG (final 40 mg L-1) resulted in 15- and 11-fold higher production, respectively. The humidifier disinfectants (PHMG, PGH, and CMIT/MIT) showed severe dermal cell toxicity and brain toxicity. These toxicities may be relevant factors in understanding why some children have language disorders, motor delays, and developmental delays from exposure to humidifier disinfectants.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 PHMG, PGH, CMIT/MIT의 사람 피부섬유세포를 모델로 한 피부 독성 비교 시험과 함께, 뇌신경조직 손상의 가능성을 조사하기 위해 제브라피쉬 동물모델에 30분간 노출하여 두뇌의 조직 손상을 비교하였다. 가습기 살균제 참사는 한국에서만 일어난 대형 인명피해이므로 해외의 선행연구에서 다양한 전신성 질환에 대한 선행연구와 참고문헌을 찾기는 힘들다.
따라서 가습기 살균제의 전신성 질병 유발 연구는 한국 국민들에게 더 많이 알려져서, 추가 연구를 통해 안전성을 신속하게 확보할 필요성이 있다. 본 연구는 예비적 성격의 연구로서 잠재적인 피부 독성과 두뇌 독성에 대한 가습기 살균제 원료물질의 독성을 비교하였다.
가설 설정
A: Cell viability was assessed by the trypan blue assay and hematoxylin-eosin staining during passage of the HDF cell line.
B: The percentage of SA- ß- gal - positive cells in the same size (7.4 mm2) cell culture area and the same total number of cells at P= 7.
제안 방법
PHMG 혹은 PGH와 유사한 구조를 가지는 구아니딘 계열의 살균제인 Akacid Plus의 살균효과를 보고한 선행논문 (Buxbaum et al. 2006)에 따르면 최저 저해 농도 (minimal inhibitory concentrations; MIC)가 대부분 세균과 곰팡이의 경우 1~32 mg L-1에 해당하였으므로, 본 연구에서는 피부세포 독성의 경우 최종 1~16 mg L-1 농도가 되도록 배양액에 처리하였고, 제브라피쉬 두뇌 독성의 경우 40 mg L-1 의 농도로 사육수에 희석하여 실시하였다.
제브라피쉬 노출 후, 뇌를 분리하여 중뇌 시개영역(mid brain optic tectum)을 확보하고, 확보된 두뇌조직을 급속 냉동 박편기(microcryotome, Leica 1510S, Germany)를 사용하여 7 μm 두께로 미세 횡단절단하여 냉동 박편조직을 준비하였다.
2017)와 제브라피쉬의 생존 시간을 고려하여 노출시간을 30분으로 정하였다. 각 그룹당 20 마리씩 사용하였으며, 노출 후 즉시 해부하여 조직 적출과 냉동 박편염색을 실시하였다. 제브라피쉬의 사육과 모든 실험 프로토콜은 영남대학교 실험동물위원회의 승인을 받았고, 제브라피쉬의 사육과 실험은 영남대학교 생명공학관에서 실시하였다.
2008). 산화물과 반응한 DHE가 발색하는 빨간색 형광을 형광현미경 (Nikon Eclipse 2000 microscope, Tokyo, Japan)으로 분석하였다 (Ex = 588 nm, Em = 615 nm). 발색된 형광이미지의 정량적인 분석은 ImagePro plus software (version 4.
HDF는 100 mm 세포 배양 접시에 1 × 105 개의 세포를 37°C에서 5% CO2humidified incubator를 사용하여 배양하였다.
야생형 (wildtype) 제브라피쉬 10~12 주령을 충남대학교 질환모델링제브라피쉬은행 (ZCDM)에서 분양받아서 표준사육방법에 따라 사육하였고(NussleinVolhard and Dahm 2002), 가습기 살균제 성분 (PHMG, PGH, CMIT/ MIT)이 각각 최종농도 0.004%로 희석되어 있는 사육수조에서 30분간 노출하였다.
데이터처리
제브리피쉬 노출시험에서는 4개 그룹(대조군, PHMG, PGH, CMIT/MIT) 간의 비교는 oneway analysis of variance (ANOVA)를 이용한 Duncan multiple range test를 사용하여 유의성을 구하였다.
모든 실험 결과 수치는 평균±표준편차 (mean±SD)로 표시하였으며, 이중 샘플을 사용하여 3회 이상의 독립적 실험을 통해 도출되었다.
발색된 형광이미지의 정량적인 분석은 ImagePro plus software (version 4.5.1.22; Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 실시하였다.
이론/모형
냉동 박편된 두뇌조직 내의 산화물 형성 정도를 OwusuAnsah 등의 방법에 따라 DHE (Dihydroethidium cat # 37291; Sigma, St. Louis, MO, USA) 염색으로 비교하였다(OwusuAnsah et al. 2008).
세포의 핵과 세포질 염색은 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색 방법으로, 세포의 생존율은 Trypan blue 염색 방법으로 살아있는 세포를 hematocrit 계수방법으로 산출하였다.
세포 노화 정도의 염색은 Itahana 등의 방법에 따라서 SenescenceAssociated (SA)βgal 염색 방법으로 비교하였다(Itahana et al. 2007).
세포배양액에 생성된 산화물의 양을 정량하기 위해 산화물을 발색시키는 기능을 가진 Thiobarbituric acid (TBA) 시약과 반응하는 방법 Thiobarbituric acid reactive substance (TBARS)으로 정량하였다 (Blois 1958). 이때 산화물 표준물질로 malondialdehyde(MDA)를 사용하였다.
성능/효과
1A). 그중에서도 PHMG가 처리된 세포의 생존율이 가장 낮았는데 16 mg L-1 처리농도에서 32%의 생존율을 보였고, PGH 는 49%, CMIT/MIT는 41%의 생존율을 보였다. 선형 추세선 분석을 실시하였을때, 50%의 생존율을 보이는 살균제의 농도는 PHMG가 4.
그중에서도 PHMG가 처리된 세포의 생존율이 가장 낮았는데 16 mg L-1 처리농도에서 32%의 생존율을 보였고, PGH 는 49%, CMIT/MIT는 41%의 생존율을 보였다. 선형 추세선 분석을 실시하였을때, 50%의 생존율을 보이는 살균제의 농도는 PHMG가 4.9 mg L-1, PGH가 6.5 mg L-1, CMIT/ MIT가 5.4 mg L-1을 보여 모두 유사한 독성 정도를 보였지만, 특히 PHMG가 피부 독성이 가장 높았다. Fig.
모든 살균 제 그룹들이 대조군에 비해 유의적인 증가를 보여주었고 (p<0.05), CMIT/MIT 그룹과 PGH 그룹은 PHMG 그룹에 비해 유의적인 차이를 보여주었다(p<0.05).
제브라피쉬를 각 PHMG, PGH, CMIT/MIT 살균제가 최종농도 40 mg L-1로 희석되어 있는 사육수조에 30분 동안 노출시킨 후, 선행논문에서(Gorelick et al. 2008) 제시하는 바와 같이 중뇌의 optic tectum 부분 (Fig. 3A의 FG 영 역)을 횡면 절단하여 산화물의 생성을 비교해본 결과, 아래의 DHE 형광염색 사진과 같이 CMIT/MIT에 노출된 제브라피쉬가 대조군에 비해 17배 더 많은 산화물을 보여, 가장 심각한 두뇌 독성을 보여주었고, PGH는 15배, PHMG는 11배 더 많은 산화물을 보여주었다.
세포의 계대 배양 기간 동안 형태학적 변화를 핵과 세포질 염색 및 노화 정도 염색으로 비교해본 결과 Fig. 2와 같이 계대 배양 초기(P = 7)부터 세포의 사멸로 인하여 세포 수가 감소하고(H&E 염색), 노화된 세포의 염색(SA-β-gal) 이 파란색의 증가로 관찰되었으며, 계대 배양이 진행될수록(P = 10) 세포사멸이 늘어나 세포수는 크게 감소하면서, 핵의 크기가 증대하고 노화된 세포의 수는 더욱 증가하였다.
세포배양액 속에 생성된 산화물의 양을 TBARS 방법으로 정량하여 MDA의 양으로 표현한 결과 Fig. 1B와 같이 살균제들의 처리농도와 정비례 증가하였다. 그중에서 도 PHMG를 처리한 세포에서 28 nmol MDA로 가장 높았고, CMIT/MIT를 처리한 세포에서 20 nmol MDA, PGH를 처리한 세포에서 14 nmol MDA 순이었다.
그중에서 도 PHMG를 처리한 세포에서 28 nmol MDA로 가장 높았고, CMIT/MIT를 처리한 세포에서 20 nmol MDA, PGH를 처리한 세포에서 14 nmol MDA 순이었다. 이 결과들은 PHMG를 처리한 세포에서 가장 생존율이 낮고, 산화물의 생성이 가장 많은 결과를 제시한다. 세포의 생존율이 감소할수록 산화물의 양이 늘어나는 것으로 살균제의 독성 정도와 산화물의 생성 정도가 잘 일치함을 보여준다.
이 결과들은 PHMG를 처리한 세포에서 가장 생존율이 낮고, 산화물의 생성이 가장 많은 결과를 제시한다. 세포의 생존율이 감소할수록 산화물의 양이 늘어나는 것으로 살균제의 독성 정도와 산화물의 생성 정도가 잘 일치함을 보여준다.
2B에서 보는 바와 같이 PHMG를 처리한 경우 대조군에 비해 10배 많은 SA-β-gal 에 염색된 세포를 보여주었고, PGH와 CMIT/MIT를 처리한 경우도 대조군에 비해 8배와 9배 많은 SA-β-gal에 염색된 세포를 보여주었다. 총세포수는 대조군에 비해, PHMG를 처리한 경우 2.9배 감소하였고, PGH와 CMIT/MIT를 처리한 경우도 대조군에 비해 2.2배와 2.4배 감소하였다. 이러한 피부 섬유세포의 독성은 Lundov 등이 보고한 MIT의 피부 앨러지 독성(Lundov et al.
결론적으로, 본 연구진의 선행논문 및 현재 결과와 함께, 다른 참고논문들을 종합해 볼 때, 가습기 살균제의 세 가지 주요 성분들 PHMG, PGH, CMIT/MIT가 피부 독성과 뇌신신경조직 독성에도 영향을 미칠 수 있음을 제시할 수 있다. 따라서, 본 연구에서 도출된 결과를 바탕으로 향후 마우스를 비롯한 다른 포유류 동물모델을 이용한 검증 실험도 필요할 것으로 기대가 되며, 가습기 살균제에 의한 다양한 조직 및 장기의 손상, 전신 질병, 유전 독성에 관한 후속연구가 계속 진행될 수 있도록 정부의 중, 장기적인 지원이 절실히 필요하다.
후속연구
결론적으로, 본 연구진의 선행논문 및 현재 결과와 함께, 다른 참고논문들을 종합해 볼 때, 가습기 살균제의 세 가지 주요 성분들 PHMG, PGH, CMIT/MIT가 피부 독성과 뇌신신경조직 독성에도 영향을 미칠 수 있음을 제시할 수 있다. 따라서, 본 연구에서 도출된 결과를 바탕으로 향후 마우스를 비롯한 다른 포유류 동물모델을 이용한 검증 실험도 필요할 것으로 기대가 되며, 가습기 살균제에 의한 다양한 조직 및 장기의 손상, 전신 질병, 유전 독성에 관한 후속연구가 계속 진행될 수 있도록 정부의 중, 장기적인 지원이 절실히 필요하다.
참고문헌 (19)
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