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문제 정의
- 이에 본 연구에서 ChondroT 투여가 FeCl3로 유발된 혈전에 미치는 영향을 관찰하기 위해 thromboxane,platelete activating factor (PAF)의 활성도, 지질대사물질, transaminase, erythrocytes, leukocytes, thrombocytes 함량의 변화, 경동맥 조직의 조직학적 변화 등을 관찰하여 다음과 같은 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3로 유발된 혈전에 미치는 영향을 혈소판 thromboxane, PAF와 지질대사, 경동맥 조직학적 변화, 혈청 및 혈액학적 변화를 관찰한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 광학현미경용 조직표본을 제작하기 위해 고정액(Bouinsolution)에 24시간 고정시키고 통상적인 조직 처리 과정을 거쳐 파라핀에 포매한 후 절편(4 μm 두께)을 제작하였다. Hematoxylin-Eosin 염색을 통해 혈관 조직의 조직학적 변화를 관찰하였다.
- PAF 측정은 Rat PAF (BIOMATIK)를 사용하여 측정하였다. Rat PAF가 coating된 microplate에 Rat PAFstandard, serum 100 μL를 첨가하고 plate cover로 tapping한 후에 1분간 mixing하고 37℃에 2시간 방치하였다.
- 발색반응을 중지시키기 위해 Stop solution 50 μL를 plate에 넣은 후 microplate reader (EZ Read 400; Biochrom)를 사용하여 450 nm에서 OD를 측정하였다. Standard curve를 만들어 sample의 PAF 양을 분석하였다.
- 발색반응을 중지시키기 위해 Stop solution 50 μL를 plate에 넣은 후 microplate reader (EZ Read 400; Biochrom, Cambridge, UK)를 사용하여 450nm에서 optical density (OD)를 측정하였다. Standard curve를 만들어 sample의 thromboxane 양을 분석하였다.
- Thromboxane 측정은 Rat Thromboxane (BIOMATIK,Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정하였다. Rat Thromboxane이 coating된 microplate에 Rat Thromboxane standard, serum 50 μL를 첨가 후 Biotinylated Detection Ab 50 μL 추가 후 plate cover로 tapping 한 후에 1분간 mixing하고 37℃에 45분 방치하였다.
- 광학현미경용 조직표본을 제작하기 위해 고정액(Bouinsolution)에 24시간 고정시키고 통상적인 조직 처리 과정을 거쳐 파라핀에 포매한 후 절편(4 μm 두께)을 제작하였다.
- 발색반응을 중지시키기 위해 Stop solution 50 μL를 plate에 넣은 후 microplate reader (EZ Read 400; Biochrom, Cambridge, UK)를 사용하여 450nm에서 optical density (OD)를 측정하였다.
- 羌活, 金銀花, 當歸, 威靈仙, 黃柏을 6:4:4:4:3의 비율로 배합한 복합 시료 ChondroT를 준비하였다. 복합 시료 ChondroT 총량을 105 g으로 정하였고, 열수추출법을 통해 정제수 1,000 mL에 넣어 3시간 동안 추출하였다. 50 mL로 농축된 시료를 동결 건조하여 분말을 얻었으며, 분말을 희석하여 실험에 사용하였다.
- 분리된 혈청으로 간 기능 측정 항목인 glutamic oxaloacetic transmine (GOT; aspartate aminotransferase [AST]), glutamic pyruvic transmine (GPT; alanine transaminase[ALT])는 각각 GOT-AST PⅢ Slide (Fujifilm Corporation), GPT-ALT PⅢ Slide (Fujifilm Corporation)를 사용하였으며, Fuji Dri-Chem Clinical Chemistry Analyzer (DRI-Chem4000ie; Fujifilm Corporation)으로 측정하였다.
- 분리된 혈청으로 지질대사 측정 항목인 total cholesterol (TCHO), high-density lipoprotein-cholesterol (HDLC), triglyceride (TG)는 각각 TCHO-PⅢ Slide (FujifilmCorporation, Tokyo, Japan), HDL-C-PⅢ Slide (FujifilmCorporation), TG-PⅢ Slide (Fujifilm Corporation)를 사용하였으며, Fuji Dri-Chem Clinical Chemistry Analyzer(DRI-Chem 4000ie; Fujifilm Corporation)으로 측정하였다.
- 모든 실험동물은 경동맥 혈전 유발 과정을 거친 다음 혈전 생성 시간을 측정한 후 희생시켰다. 손상된 경동맥 적출 시 최소한의 출혈을 위해 혈관 양쪽을 suture thread를 이용해 단단히 묶은 후 경동맥 3~4 mm를 적출하였다. 광학현미경용 조직표본을 제작하기 위해 고정액(Bouinsolution)에 24시간 고정시키고 통상적인 조직 처리 과정을 거쳐 파라핀에 포매한 후 절편(4 μm 두께)을 제작하였다.
- 실험동물의 경동맥에 FeCl3을 적신 filter paper를 접촉시켜 혈관 내에 혈전을 유발하는 방법을 이용하였다. 실험동물의 마취를 유도하기 위해 2% isoflurane와 질소와 산소를 7:3으로 혼합한 기체를 이용하여 모든 실험동물에게 흡입마취를 시행하여 마취를 유도하고, rat의 체온 유지를 위해 수술이 진행되는 동안 수술 pad의 온도를 37℃로 유지하였다.
- 을 적신 filter paper를 접촉시켜 혈관 내에 혈전을 유발하는 방법을 이용하였다. 실험동물의 마취를 유도하기 위해 2% isoflurane와 질소와 산소를 7:3으로 혼합한 기체를 이용하여 모든 실험동물에게 흡입마취를 시행하여 마취를 유도하고, rat의 체온 유지를 위해 수술이 진행되는 동안 수술 pad의 온도를 37℃로 유지하였다. 실험동물의 정중 경부를 절개하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 우측 경동맥을 노출시킨 후 40% FeCl3을 적신 filter paper(1.
- 실험동물의 정중 경부를 절개하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 우측 경동맥을 노출시킨 후 40% FeCl3을 적신 filter paper(1.5×3 mm)를 3분간 접촉시켰다(Fig. 1).
- 어떠한 처치도 하지 않은 정상군(Intact, n=6), FeCl3을 이용한 경동맥 혈전 유발 후 saline을 투여한 대조군(Control, n=6), FeCl3을 이용한 경동맥 혈전 유발 후 acetylsalicylic acid 10 mg/kg 투여한 양성대조군(ASA10,n=6), FeCl3을 이용한 경동맥 혈전 유발 후 ChondroT100 mg/kg 투여한 실험군(CT100, n=6), FeCl3을 이용한 경동맥 혈전 유발 후 ChondroT 200 mg/kg 투여한 실험군(CT200, n=6)으로 분리하였다.
- 이에 본 연구에서는 관절염 치료제로 개발 중인ChondroT가 인체의 혈액순환 및 응고 작용에 어떠한 영향을 미치는지 파악하기 위해 FeCl3로 유도된 혈전에서 대조군과 acetylsalicylic acid 10 mg/kg 투여한 양성 대조군(ASA10), FeCl3을 이용한 경동맥 혈전 유발 후ChondroT 100 mg/kg 투여한 실험군(CT100), FeCl3을 이용한 경동맥 혈전 유발 후 ChondroT 200 mg/kg 투여한실험군(CT200)를 비교하여 thromboxane와 PAF 활성도,지질대사, transaminase, leukocytes, erythrocytes, thrombocytes의 함량을 수치화하여 관찰하였고 혈관의 조직학적 변화를 관찰하였다.
- 전자저울(㈜카스, 양주, 한국)을 이용하여 체중을 측정하였고, 양성대조군은 acetylsalicylic acid 10 mg/kg을 경구 투여하였고, 실험군은 ChondroT 100 mg/kg, ChondroT200 mg/kg을 경구 투여하였고, 대조군은 동량의 완충액(생리식염수, saline)을 경구 투여하였다.
- 지표 성분 확인을 위해 high-performance liquid chromatography를 이용하였으며, chlorogenic acid, total decursin, berberine chloride의 3종 지표성분의 함량을 확인하였다.
- 채혈에 의하여 얻어진 혈액 중 약 100 μL를 ethylenediaminetetraacetic acid-bottle에 넣은 후 곧바로 Multispecies Hematology Analyser (HEMAVETⓇ950; The Americas Drew Scientific Inc., Oxford, CT, USA)에 주입하여 white blood cell (WBC), red blood cell (RBC), hemoglobin (HB), hematocrit (HCT), mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration, platelet (PLT), leukocytes, erythrocytes를 측정하였으며, 나머지 혈액은 VS-6000CFi((주)비전과학, 서울, 한국)에서 20분간 3,000 rpm으로 시행하여 혈청을 분리하였다.
대상 데이터
- 羌活(Osterici Radix), 金銀花(Lonicerae Folium), 當歸(Angelicae Gigantis Radix), 威靈仙(Clematidis Radix),黃柏(Phellodendri Cortex)를 (주)옴니허브(대구, 한국)에서 구입하여 사용하였으며, 아스피린(acetylsalicylic acid,ASA)를 ㈜한미약품(서울, 한국)에서 구입하여 사용하였다.
- 羌活, 金銀花, 當歸, 威靈仙, 黃柏을 6:4:4:4:3의 비율로 배합한 복합 시료 ChondroT를 준비하였다. 복합 시료 ChondroT 총량을 105 g으로 정하였고, 열수추출법을 통해 정제수 1,000 mL에 넣어 3시간 동안 추출하였다.
- 체중이 약 150-160 g인 SD계의 6주령 rat를 실내 온도 24-26℃, 습도 40-60%로 유지시킨 사육장 내에서 물과 사료를 충분히 섭취하게 하면서 적응시킨 후 실험에 사용하였다(동물실험계획 승인번호: 2019-06-03).
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 측정값은 Excel statistic program(Microsoft, Redmond, WA, USA)을 이용하여 평균과 표준오차(mean±standard error)로 나타내었으며, SPSS 21.0 ver. for Windows (IBM Co., Armonk, NY, USA)를 사용하여 각 군 간의 통계학적 분석을 하였다.
- 비모수적 방법인 Mann-Whitney U test를 시행하여 α=0.05 수준과 α=0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 1. Thromboxane 활성은 대조군과 비교하였을 때 CT200 군에서 유의하게 감소하였다.
- 2. PAF 활성은 대조군과 비교하였을 때 CT200군이유의하게 감소하였다.
- 3. 경동맥 혈관의 조직학적 변화는 대조군과 비교해보았을 때 CT200군의 혈관 내 교원섬유 부분 손상은 억제되었고, 혈전 형성은 감소를 보였다.
- 4. 혈청 지질 중 TCHO 함량은 대조군과 비교하였을 때 CT200군이 유의하게 감소하였다.
- 5. 혈청 transaminase 함량은 대조군과 비교하였을 때 각 실험군은 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- 6. 혈액 leukocyte 중 neutrophil의 경우 대조군과 비교하였을 때 CT100군에서 유의하게 감소하였다.
- 7. 혈액 erythrocytes 및 thrombocytes의 경우 대조군과 비교하였을 때 각 실험군은 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- ASA10군, CT200군에서 대조군과 비교하였을 때 유의하게 감소하였다(p<0.01)(Fig. 2, Table Ⅰ).
- 3 mg/dL를 나타내었다. ASA10군과 CT200 군은 대조군과 비교하였을 때 감소하는 경향을 보였다(Fig . 5, Table Ⅱ).
- ASA10군과 CT200 군은 대조군과 비교하였을 때 유의하게 감소하였다(p<0.05)(Fig . 6, Table Ⅱ).
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 ALT 함량에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 26.3±0.7U/L, 대조군은 26.8±2.7 U/L을 나타내었고, ASA10군은 24.6±1.3 U/L, CT100군은 29.2±2.1 U/L, CT200군은 26.6±1.1 U/L을 나타내었다.
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 AST 함량에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 67.7±2.9U/L, 대조군은 74.0±4.2 U/L을 나타내었고, ASA10군은 64.8±3.2 U/L, CT100군은 80.2±5.8 U/L, CT200군은 70.4±6.1 U/L을 나타내었다.
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 HDLC함량에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 42.7±2.4mg/dL, 대조군은 43.7±1.4 mg/dL를 나타내었고, ASA10군은 38.8±1.4 mg/dL, CT100군은 42.8±3.7 mg/dL, CT200 군은 37.8±2.2 mg/dL를 나타내었다.
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 PAF활성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 2.12±0.19pg/mL, 대조군은 2.98±0.33 pg/mL을 나타내어 정상군에 비하여 대조군은 유의한 증가를 나타내었고, ASA10군은 2.09±0.51 pg/mL, CT100군은 3.36±0.75 pg/mL, CT200군은 2.10±0.23 pg/mL을 나타내었다.
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 TCHO 함량에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 66.3±2.4mg/dL, 대조군은 67.8±2.2 mg/dL를 나타내었고, ASA10군은 61.0±1.2 mg/dL, CT100군은 63.0±4.3 mg/dL, CT200 군은 58.6±2.1 mg/dL를 나타내었다.
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 TG 함량에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 103.5±9.9 mg/dL,대조군은 132.3±37.3 mg/dL를 나타내었고, ASA10군은 59.4±6.9 mg/dL, CT100군은 135.4±22.6 mg/dL, CT200 군은 114.6±36.3 mg/dL를 나타내었다.
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 erythrocytes 및 thrombocytes 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군과 비교하였을 때 RBC, HCT, HB, PLT의 경우 각 실험군은 유의한 차이를 나타내지 않았다(Fig. 11, Table Ⅴ).
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 leukocyte 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, WBC lymphocytes, monocytes, eosinophils의 경우 대조군에 비교하였을 때 각 실험군은 유의한 차이를 나타내지 않았으나, neutrophils의 경우 대조군에 비교하였을 때 CT100군에서 유의하게 감소하였다(p<0.01)(Fig. 10, Table Ⅳ).
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 thromboxane 활성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 626.8±41.0 pg/mL, 대조군은 865.7±72.3 pg/mL을 나타내어 정상군에 비하여 대조군은 유의한 증가를 나타내었고,ASA10군은 451.3±63.5 pg/mL, CT100군은 851.2±100.3pg/mL, CT200군은 468.8±84.8 pg/mL을 나타내었다.
- ChondroT 용량별 투여가 FeCl3 유발 혈전 rat의 경동맥 혈관의 조직학적 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군의 혈관은 정상군에 비하여 혈관 내 교원섬유 부분의 손상이 두드러졌고, 혈전 형성도 현저하였으며, 대조군에 비하여 ASA10군과 CT200군의 혈관 내교원섬유 부분의 손상은 억제되었고, 혈전 형성도도 감소되었다(Fig. 4).
- ChondroT 투여가 thromboxane과 PAF의 활성도에 미친 영향을 관찰하였을 때, 대조군에 비해 ASA10군과 CT200군에서 thromboxane의 활성도가 유의미하게 감소하였고, PAF의 활성도는 CT200군에서 유의미하게 감소하였다(Table Ⅰ). Thromboxane은 혈소판 응집을 유도하고 세포의 응집력을 강하게 해주는 물질이며, thromboxane의 감소는 혈관 내 응집 효과의 저하를 유발한다24,25).
- ChondroT 투여가 경동맥 혈관의 조직학적 변화를 관찰하였을 때, FeCl3로 인해 대조군에서는 혈전이 형성되어 혈관 내부를 막고 있으며, 교원섬유의 손상도 눈에 띄게 나타나지만 ASA10군과 CT200군에서 혈관 내 교원섬유 부분의 손상이 억제되고 혈전 형성도도 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- ChondroT 투여가 지질대사에 미치는 영향을 관찰하였을 때, ASA10군과 CT200군에서 대조군에 비해 TCHO의 유의미한 감소(p<0.05)를 확인할 수 있었다(Table Ⅱ).
- 따라서 본 연구를 통해 ChondroT가 200 mg/kg에서 기존 연구에서 밝혀진 관절염 치료 효과와 더불어 thromboxane, PAF 활성도 감소, 지질대사물질 함량의 감소에 유의미한 영향을 미친다는 것을 관찰할 수 있었고, 혈관 내 교원섬유 손상 억제, 혈전 형성도 감소와 같은 조직학적 변화도 관찰할 수 있었다. 이번 연구를 통해ChondroT가 관절염 치료제로 다용되는 acetaminophen이나 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)를 대체할 수 있는 한약제제가 되길 기대해 본다.
- . 반면 이번 연구에서 CT100, CT200군에서는 ALT, AST 함량의 유의미한 변화는 없었다.
- 본 연구에 사용된 ChondroT는 羌活, 當歸, 威靈仙, 金銀花, 黃柏의 조합으로 이루어진 한약제제로 관절염 치료제로 개발 중에 있으며, 羌活은 袪風除濕止痛散寒의효능을 가지고 있어 關節疼痛를 치료하고, 當歸는 補血和血, 調經止痛하는 효능을 가지고 있어 혈액순환 개선에 유효하다. 袪風濕藥과 함께 쓰게 되면 風濕痺痛를 치료할 수 있으며, 威靈仙은 袪風濕止痺痛藥에 속하여 祛風除濕 효과와 通絡止痛 효과를 겸하여 풍습으로 인한 통증 질환을 치료할 수 있고, 金銀花는 淸熱解毒의 효과로 항염증 작용을 하고, 또한 黃柏은 淸熱燥濕의 효능이 있어 瘡瘍腫毒, 濕疹瘙痒, 濕熱瀉痢 등의 질환을 치료할 수 있는 항염증 효과가 있다23).
후속연구
- 따라서 본 연구를 통해 ChondroT가 200 mg/kg에서 기존 연구에서 밝혀진 관절염 치료 효과와 더불어 thromboxane, PAF 활성도 감소, 지질대사물질 함량의 감소에 유의미한 영향을 미친다는 것을 관찰할 수 있었고, 혈관 내 교원섬유 손상 억제, 혈전 형성도 감소와 같은 조직학적 변화도 관찰할 수 있었다. 이번 연구를 통해ChondroT가 관절염 치료제로 다용되는 acetaminophen이나 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)를 대체할 수 있는 한약제제가 되길 기대해 본다. 하지만 이번 연구의 한계로는 단회 투여 실험으로 반복 투여 시의 변화를 파악할 수 없었고 아직 임상단계에서 항응고 효과가 보고된 바 없었다.
- 하지만 이번 연구의 한계로는 단회 투여 실험으로 반복 투여 시의 변화를 파악할 수 없었고 아직 임상단계에서 항응고 효과가 보고된 바 없었다. 이에 저자는 본 연구를 통해 추후 반복 투여 연구 및 임상단계의 항응고 효과에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이번 연구를 통해ChondroT가 관절염 치료제로 다용되는 acetaminophen이나 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)를 대체할 수 있는 한약제제가 되길 기대해 본다. 하지만 이번 연구의 한계로는 단회 투여 실험으로 반복 투여 시의 변화를 파악할 수 없었고 아직 임상단계에서 항응고 효과가 보고된 바 없었다. 이에 저자는 본 연구를 통해 추후 반복 투여 연구 및 임상단계의 항응고 효과에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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