[논문]헛개나무 분획물에 의한 HDF세포의 초기 노화관련 sm22 단백질 조절

심보람

doi:10.5352/jls.2020.30.8.680

헛개나무 분획물에 의한 HDF세포의 초기 노화관련 sm22 단백질 조절
The Regulation of Early Senescence-related SM22 Protein in Human Dermal Fibroblasts by Hovenia dulcis Thunberg Fractions 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.8, 2020년, pp.680 - 687

심보람 (동남보건대학교 뷰티케어과)

초록
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본 연구에서는 Hovenia dulcis Thunberg (헛개나무)의 80% 메탄올 분획물의 항산화 및 세포 노화 억제활성을 규명하고자 하였다. 헛개나무 에틸아세테이트 분획물이 DPPH라이칼 소거능에서 가장 높은 활성 저해를 보였고 (RC₅₀ = 3.6±0.8 ㎍/ml), 총 페놀(417.2±5.3 mg GAE/ml) 및 총플라보노이드(260.6±27.5 mg QE/ml) 측정에서도 가장 높은 활성을 보였다. HDF 세포에서 노화가 진행됨에 따라 sm22의 발현이 증가되었고(p<0.001), β-갈락토시다아제의 염색양이 증가(p<0.001)되는 것을 확인하였다. 반면, sm22의 증가는 세포 노화가 진행된 세포일수록 증가폭이 감소되는 것이 확인되었고, 초기노화에서 발현이 높은 것을 알 수 있었다. 헛개나무 에틸아세테이트 분획물을 처리시 HDF세포의 EGF (p<0.01), PDGF-BB (p<0.01), SHH (p<0.05)의 사이토카인이 유의적으로 증가를 보이며, 노화 시 발생된 sm22의 수치를 감소시키는 것을 보였다. 이러한 결과는 헛개나무 에틸아세테이트 분획물이 초기 세포 노화의 작용을 조절할 수 있음을 보여준다.

Abstract ▼ AI-Helper

Several studies have proved Hovenia dulcis extracts to be an effective antidote for alcoholism, and they are frequently used in the clinical treatment of alcoholic liver disease. The purpose of this study was to investigate the anti-oxidant and anti-senescent activities of 80% methanol fractions of H. dulcis Thunberg in human dermal fibroblast (HDF) cells. The ethanol ethyl acetate fraction showed the highest inhibition of 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl radical scavenging (RC50=3.6±0.8 ㎍/ml) as well as the highest total phenol content (417.2antiholic liver disease. Extracts from e & Tech., Sungkyunkwan University, progressed in the HDF cells, SM22 expression (p<0.001) and β-galactosidase staining intensity increased (p<0.001). An increase in SM22 expression is associated with slower aging which suggests that its expression is high in early aging. HDF treatment using the ethyl acetate fraction significantly increased production of EGF (p<0.01) and PDGF-BB (p<0.01) while SHH expression was reduced (p<0.05). These results suggest that an 80% ethyl acetate fraction of H. dulcis can suppress early aging and demonstrate the potential application of the fraction as a natural anti-senescence agent.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. DPPH radical scavenging activity of Hovenia dulcis Thunberg
표 Table 2. Total phenolic and flavonoid contents of Hovenia dulcis Thunberg
그림 Fig. 1. Cell passage-induced premature senescence as measured by the sm22 expression and β-galactosidase staining in HDF cells.
표 Table 3. Correlation with DPPH radical scaving total phenolic and flavonoid contents of Hovenia dulcis Thunberg
그림 Fig. 2. Protein expression levels of senescence biomarkers.
$Fig. 3. Cells treated with the Hovenia dulcis Thunberg ethyl acetate fraction demonstrated changes in cytokine expression, senescence marker expression, and wound healing capacity.$ 그림 Fig. 3. Cells treated with the Hovenia dulcis Thunberg ethyl acetate fraction demonstrated changes in cytokine expression, senescence marker expression, and wound healing capacity.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 헛개나무의 생리활성 물질은 향후 분리 및 정제 연구가 필요할 것으로 생각되며, 본 연구는 향후 헛개나무를 이용한 세포 노화 억제 기초 자료로 제시하고자 한다.
본 연구에서는 HDF 정상세포주를 이용하여 헛개나무 분획물의 세포독성을 확인하였다. 세포독성은 미토콘드리아에서 배출되는 michondrial dehydrogenase와 반응하는 (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay에서 발생되는 tetrazolium salt를 DMSO (dimethyl sμ Lfoxide)로 용해시키는 과정에서 발생되는 오차를 줄일 수 있는 시약인 Cyto-X로 대체하여 사용하였다.
또한, 헛개나무 추출물 및 분획물은 항산화, 항균, 항 당뇨병 효과, 알코올분해능 및 숙취해소능에 따른 효과가 보고된 바 있다[19]. 본 연구에서는 헛개나무 종자추출물 및 분획물로부터 세포 노화억제 효과를 분석하고, 세포 노화에 영향을 주는 sm22의 발현을 조절하는 기작을 확인하였다.

제안 방법

Amersham ECL Western blotting detection reagent (GE Healthcare)를 이용하여 X-ray film 발색으로 측정하였다.
, KyongKido, Korea)에 희석한 시료 100 μl와 60mM DPPH용액 100 μl를 96 well plate에 분주하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 Wallac Victor2 plate reader를 이용하여 540 nm에서 항산화를 측정하였다. DPPH라디칼 소거능은 측정농도의 50% 억제농도(IC₅₀) 값으로 계산하였다.
HDF 세포주를 60 mm 세포배양 접시에 6×105 세포수로 12시간 배양한 뒤 10 μg/ml 헛개나무 분획물을 24시간 처리하여 세포를 수집하였다.
HDF 세포주를 60 mm 세포배양 접시에 6×105 세포수로 12시간 배양한 뒤 10 μg/ml 헛개나무 추출물 및 분획물을 12시간 처리하여 세포를 수집하였다.
HDF 세포주를 이용하여 계대배양 횟수에 따라 세포의 노화도를 설정하였다. 중기 노화는 계대배양 25회 후, 말기노화는 계대배양 40회 후 H₂O₂를 500 μM 처리하여 세포의 노화도를 측정하였다.
RayBio Human Cytokine Array (RayBiotech Inc, Norcross, GA, USA)를 이용하여 측정하였다. Kit에 첨부된 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였으며, Amersham ECL Western blotting detection reagent (GE Healthcare)를 이용하여 X-ray film 발색으로 측정하고, image J 프로그램을 이용하여 발색을 수치화하였다.
PCR 증폭은 QuantiTectTM SYBR® Green PCR master mix (Qiagen, Mississauga, ON, CA)을 이용하였으며, 각 확인할 타겟 primer (5' TCTGGCTGAAGAATGGCGTGATT-3'/5'-CACTGCTGCCATGTCTTTGCCTT-3')를 TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 이용하여 Q-PCR과 동일조건으로 PCR진행 후 각 생성물을 agarose gel에 전기영동하여 밴드를 확인하였다.
세포수로 12시간 배양한 뒤 10 μg/ml 헛개나무 추출물 및 분획물을 12시간 처리하여 세포를 수집하였다. RayBio Human Cytokine Array (RayBiotech Inc, Norcross, GA, USA)를 이용하여 측정하였다. Kit에 첨부된 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였으며, Amersham ECL Western blotting detection reagent (GE Healthcare)를 이용하여 X-ray film 발색으로 측정하고, image J 프로그램을 이용하여 발색을 수치화하였다.
Total RNA 시료의 순도는 Nanodrop (Thermo Scientific™ NanoDrop™ 8000 Spectrophotometer, USA)을 이용하여 측정 후 흡광도(260 nm/280 nm 및 260 nm/230 nm)값이 1.85-2.05 범위에 속함을 확인한 뒤 RNA 주형 3 μg을 대상으로 oligo-d(T) primer (20 mers; Bioneer, Korea)와 random primer (random nonamers; TakaraBio Inc., Japan)이 포함된 역전사(reverse transcription) 반응을 실시하였고, 역전사 반응은 Qiagen OneStep RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 실시하였다.
HDF 세포주를 60 mm 세포배양 접시에 6×105 세포수로 12시간 배양한 뒤 10 μg/ml 헛개나무 추출물 및 분획물을 12시간 처리하여 세포를 수집하였다. Trizol reagent를 이용하여 세포들를 파쇄시키고 1차 total RNA를 추출한 후 추출물을 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen Hilden, Germany)로 다시 순수 분리하였고, 이 때 DNA 오염을 제거하기 위해서 RNaseFree DNase를 처리과정을 포함토록 하였다. Total RNA 시료의 순도는 Nanodrop (Thermo Scientific™ NanoDrop™ 8000 Spectrophotometer, USA)을 이용하여 측정 후 흡광도(260 nm/280 nm 및 260 nm/230 nm)값이 1.
, San Diego, CA)을 이용하여 세포를 일주일간 염색하였다. 광학현미경을 통하여 염색 결과를 확인하여 세포의 노화 여부를 검증하였고, Image J 프로그램을 이용하여 염색값을 수치화 하였다.
노화에 따라 증가하는 SA-β-gal (senescence-associated βgalactosidase) 활성을 보기 위하여 35 mm로 배양된 HDF 세포를 이용하여 cellμLar senescence assay kit (Cell biolabs, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 세포를 일주일간 염색하였다.
또한, 단백질 분석을 위한 세포 노화는 각 계대배양 실험 후 H2O2를 500 μM stock 농도로 5 μl/3 ml씩 처리하였다.
세포독성은 미토콘드리아에서 배출되는 michondrial dehydrogenase와 반응하는 (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay에서 발생되는 tetrazolium salt를 DMSO (dimethyl sμ Lfoxide)로 용해시키는 과정에서 발생되는 오차를 줄일 수 있는 시약인 Cyto-X로 대체하여 사용하였다.
세포를 96 well plate에 1.5×104 세포수로 12시간 배양한 뒤 헛개나무 추출물 및 분획물을 1, 10 및 100 μg/ml로 처리하였다.
중기 노화는 계대배양 25회 후, 말기노화는 계대배양 40회 후 H2O2를 500 μM 처리하여 세포의 노화도를 측정하였다.
3 ml씩 섞어 37°C heat block에서 40분간 반응시켰다. 흡광도의 변화는 Wallac Victor2 plate reader를 이 용하여 415 nm에서 측정하였으며, 총 플라보노이드의 정량을 위하여 quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 작성 한 표준 곡선으로부터 총 플라보노이드 함량을 산출하였다.

대상 데이터

HDF (ATCC; manassas, VA, USA) 세포주를 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA), 1% P/S가 첨가된 DMEM (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) 배지에 2×105 cells/ml 세포수로 100 mm cµLture dish (SPL, Pocheon, Korea)에 분주한 후 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
HDF (ATCC; manassas, VA, USA) 세포주를 이용하여 세포의 독성테스트Cyto-X (LPS solution, Daejeon, Korea) 시약을 이용하였다. 세포를 96 well plate에 1.
12 g). 이와 동일한 방법으로 순차적으로 ethyl acetate (66.6 g), n-butanol (63.25g), 최종적으로 남은water (122.32 g)을 얻어 감압농축 및 동결건조 후 실험에 이용하였다.
항체는 anti-p56, anti-p21, anti-p16, anti-β-actin (Santa Cruze, Dallas, TX, USA) 및 anti-sm22 (Abcam, Cambridge, UK)를 이용하였다.
헛개나무 종자는 경상북도 영천시에 위치한 두손애약초에서 구입하여 본 연구의 시료로 사용하였다. 건조된 헛개나무 종자 1,205 g을 분쇄하여 48시간 80% 에탄올 1 l에 추출하였다.

데이터처리

(A) Changes in cytokine production were measured using cytokine kits. All values were expressed as a percentage (n=3) of controls and were compared by ANOVA. (B) The protein expression levels of EGF, PDGF-BB, and SHH were determined by Western blotting.
For each data, values followed by the same letter (a–c) are not statistically different at p<0.05 as measured by the Duncan test ANOVA applies between fresh and dried samples.
For each data, values followed by the same letter (a–d) are not statistically different at p<0.05 as measured by the Duncan test ANOVA applies between fresh and dried samples.
모든 생리활성 실험은 3반복 실험을 통해 수치화 하였으며, 통계분석은 one-way ANOVA로 신뢰구간 p<0.05으로 검정을 실시하였다.
05으로 검정을 실시하였다. 통계프로그램은 Graph Pad Prism 5 software (Graph Pad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 이용하였다.

이론/모형

상층액을 회수하여 Bio-Rad protein assay (Bio-Rad, CA)를 이용하여 정량 후 10~25 μg의 단백질을 SDS-PAGE gel method를 이용하여 전기영동 하였다.

성능/효과

HDF 세포주를 이용하여 헛개나무 에틸아세테이트 분획물을 처리한 결과 EGF (p<0.01), PDGF-BB (p<0.01), SHH (p<0.05)의 사이토카인이 유의적으로 증가한 것을 확인하였고(Fig. 3. A), 150 μg의 다소 많은 단백질로 분석한 결과 EGF, PDGF-BB, Shh의 단백질 분석이 헛개나무 에틸아세테이트 분획물 처리시 증가됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3B).
반면, 노화단계의 sm22의 RNA 레벨은 유사하게 H₂O₂처리시 증가됨을 알 수 있었다. 반면, 본 연구에서는 p53과 p21의 발현이 sm22만큼 높게 증가하지 않았는데, 이는 sm22는 초기 노화에 작용하는 기작으로 보이며, 세포 노화의 증가와 관련 깊은 p53 및 p21은 노화의 과정이 더 진행되면 발생할 것으로 생각된다.
천연물 유래 비극성 물질들은 다양한 항암활성을 갖지만, 정상세포에 독성을 주지 않는 것으로 보고되고 있다[12]. 본 연구결과에서도 헛개나무 에틸아세테이트 분획물에서 정상세포의 세포독성이 없는 것은 난용성인 알칼로이드, 페놀 및 플라보노이드의 영향일 것으로 사료된다.
3C). 본 연구에서는 헛개나무 에틸아세테이트 처리가 세포의 성장을 유도하는 사이토카인의 변화 및 노화유도 초기 sm22의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 헛개나무 분획물의 사이토카인 변화는 아토피성 유도된 HaCaT 세포의 TNF-α/IFN-γ의 조절, 염증성 사이토카인의 조절 이외에는 현재 보고된 바 없으며[3, 17], 이 같은 결과는 일부 세포의 세포증식에 영향을 줄 수 있을 것으로 보여진다.
2). 세포 노화 마커중 sm22의 증가를 확인하였고, H₂O₂처리시 초기노화에서는 증가된 양상이 눈에 띄는 반면 노화의 진행에 따라서 발현되어 이는 sm22의 증가가 점차 차이를 보이지 않는 것을 알 수 있었다. 반면, 노화단계의 sm22의 RNA 레벨은 유사하게 H₂O₂처리시 증가됨을 알 수 있었다.
3B). 세포 노화가 진행된 중기 노화유도된 HDF세포에서 헛개나무 에틸아세테이트 분획물 처리시 sm22의 발현이 더 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 3C). 본 연구에서는 헛개나무 에틸아세테이트 처리가 세포의 성장을 유도하는 사이토카인의 변화 및 노화유도 초기 sm22의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
성분은 여전히 불분명하지만, 헛개나무의 항산화 활성은 폴리페놀의 존재에 의해 야기될 가능성이 있다. 얻어진 결과에 기초하여, 헛개나무 추출물 및 분획물은 항산화 활성을 갖는 건강 증진제로서 잠재적 인 역할을 수행할 수 있을 뿐만 아니라 천연 항산화제를 제공할 수 있다고 할 수 있다.
이와 유사하게 에틸아세테이트가 총페놀 함량(417.2±5.3 mg GAE/ml, p<0.013) 및 총플라보노이드 함량(417.2±5.3 mg GAE/ml, p<0.006)높은 함량을 갖는 것을 알 수 있었고, 통계적으로 DPPH라디칼과 유의성이 있는 것을 확인하였다(Table 3).
5 μg/ml) 순으로 항산화 효과를 보였다. 특히 에틸아세테이트 분획물은 BHA와 유사한 항산화 RC₅₀값을 갖는 것을 확인하였다. 이와 유사하게 에틸아세테이트가 총페놀 함량(417.
헛개나무 분획물의 세포독성은 HDF 세포주에서 추출물 및 분획물에서 모두 세포독성이 없음을 확인하였다(data not shown). 천연물 유래 비극성 물질들은 다양한 항암활성을 갖지만, 정상세포에 독성을 주지 않는 것으로 보고되고 있다[12].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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