Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR associated protein (Cas)9을 이용하는 유전자 가위 기술은 미래 육종 기술로서 주목받고 있다. 본 연구에서는 3세대 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 누에 kynurenine 3-monooxygenase (KMO) 유전자 편집을 통한 돌연변이 유발 및 선택 교배를 통하여 유전자의 세대간 전달을 분석하고자 하였다. 유전자 편집을 위하여 누에의 KMO 유전자에 대한 3종의 가이드 RNA를 제작하고, 제작된 gRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성시켜 누에 세포주(BM-N)에 도입 후 T7 endonuclease I 분석을 수행하여 최적의 gRNA를 선발하였다. 선발된 K1N gRNA는 누에 유전자를 편집하기 위하여 Cas9 단백질과 복합체를 형성시킨 후 누에 초가 배아에 미세주사하고 사육하였다. 미세주사 후 부화율은 18% 가량으로 낮게 나타났으나 생존한 개체 중 돌연변이 발생율은 60% 이상으로 비교적 높게 나타났다. 돌연변이가 발생된 G0세대의 KMO 유전자는 이형접합자 형태로 나타났으며, 표현형의 변화는 관찰되지 않았다. 하지만 이형접합자들 사이의 근친 교배에 의해 탄생한 G1세대 돌연변이에서는 일부에서 알과 눈의 색 변화가 확인되었으며, 변이가 확인된 개체들사이의 근친교배를 통해 생산된 G2세대에서는 모든 개체에서 표현형의 변화가 나타났다. 이러한 결과에 비추어 볼 때, 유전자 가위를 이용한 돌연변이 육종에는 한계가 있으나 전통 교배 육종과 융합을 통하여 육종 기간을 비약적으로 단축시킬 수 있는 곤충 육종 기술로 발전가능성이 높다고 판단된다.
Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR associated protein (Cas)9을 이용하는 유전자 가위 기술은 미래 육종 기술로서 주목받고 있다. 본 연구에서는 3세대 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 누에 kynurenine 3-monooxygenase (KMO) 유전자 편집을 통한 돌연변이 유발 및 선택 교배를 통하여 유전자의 세대간 전달을 분석하고자 하였다. 유전자 편집을 위하여 누에의 KMO 유전자에 대한 3종의 가이드 RNA를 제작하고, 제작된 gRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성시켜 누에 세포주(BM-N)에 도입 후 T7 endonuclease I 분석을 수행하여 최적의 gRNA를 선발하였다. 선발된 K1N gRNA는 누에 유전자를 편집하기 위하여 Cas9 단백질과 복합체를 형성시킨 후 누에 초가 배아에 미세주사하고 사육하였다. 미세주사 후 부화율은 18% 가량으로 낮게 나타났으나 생존한 개체 중 돌연변이 발생율은 60% 이상으로 비교적 높게 나타났다. 돌연변이가 발생된 G0세대의 KMO 유전자는 이형접합자 형태로 나타났으며, 표현형의 변화는 관찰되지 않았다. 하지만 이형접합자들 사이의 근친 교배에 의해 탄생한 G1세대 돌연변이에서는 일부에서 알과 눈의 색 변화가 확인되었으며, 변이가 확인된 개체들사이의 근친교배를 통해 생산된 G2세대에서는 모든 개체에서 표현형의 변화가 나타났다. 이러한 결과에 비추어 볼 때, 유전자 가위를 이용한 돌연변이 육종에는 한계가 있으나 전통 교배 육종과 융합을 통하여 육종 기간을 비약적으로 단축시킬 수 있는 곤충 육종 기술로 발전가능성이 높다고 판단된다.
Gene editing technology using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) and the CRISPR associated protein (Cas)9 has been highly anticipated in developing breeding techniques. In this study, we discuss gene scissors as a tool for silkworm molecular breeding through analys...
Gene editing technology using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) and the CRISPR associated protein (Cas)9 has been highly anticipated in developing breeding techniques. In this study, we discuss gene scissors as a tool for silkworm molecular breeding through analysis of Bombyx mori Kynurenine 3-Monooxygenase (BmKMO) gene editing using the CRISPR/Cas9 system and analysis of generational transmission through mutagenesis and selective crossing. The nucleotide sequence of the BmKMO gene was analyzed, and three guide RNAs (gRNAs) were prepared. Each synthesized gRNA was combined with Cas9 protein and then analyzed by T7 endonuclease I after introduction into the BM-N silkworm cell line. To edit the silkworm gene, K1P gRNA and Cas9 complexes were subsequently microinjected into the silkworm embryos; the hatching rate was 18% and the incidence of mutation was 60%. The gene mutation was verified in the heterozygous G0 generation, but no phenotypic change was observed. In homozygotes generated by self-crossing, a mutant phenotype was observed. These results suggest that silkworm molecular breeding using the CRISPR/Cas9 system is possible and could be an effective way of shortening the time required.
Gene editing technology using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) and the CRISPR associated protein (Cas)9 has been highly anticipated in developing breeding techniques. In this study, we discuss gene scissors as a tool for silkworm molecular breeding through analysis of Bombyx mori Kynurenine 3-Monooxygenase (BmKMO) gene editing using the CRISPR/Cas9 system and analysis of generational transmission through mutagenesis and selective crossing. The nucleotide sequence of the BmKMO gene was analyzed, and three guide RNAs (gRNAs) were prepared. Each synthesized gRNA was combined with Cas9 protein and then analyzed by T7 endonuclease I after introduction into the BM-N silkworm cell line. To edit the silkworm gene, K1P gRNA and Cas9 complexes were subsequently microinjected into the silkworm embryos; the hatching rate was 18% and the incidence of mutation was 60%. The gene mutation was verified in the heterozygous G0 generation, but no phenotypic change was observed. In homozygotes generated by self-crossing, a mutant phenotype was observed. These results suggest that silkworm molecular breeding using the CRISPR/Cas9 system is possible and could be an effective way of shortening the time required.
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문제 정의
본 연구에서는, 외래 유전자의 도입에 따른 GMO 규제를 극복하기 위하여CRISPR/Cas 시스템을 이용한 누에 분자 육종 체계를 확립하고자 단백질-RNA 복합체 형태로 누에 세포 및 배아에 도입시켜 누에의 Kynurenine 3-Monooxygenase (KMO) 유전자를 편집하고, 인위적으로 유발된 KMO 유전자 돌연변이에 따른 표현형의 변화 및 세대간 전달 분석을 통해 문제점을 지적하고 육종기술로서 발전 가능성에 대하여 논의하였다.
가설 설정
The number in front and backside of each sequence stand for larva name and number of nucleotides changed, respectively. (C) Eyes of wild type and back-crossing of the BmKMO mutant 1 male (mM1) to a wild-type female. (D) Eggs of wild-type silkworm.
제안 방법
BmKMO 유전자 편집 누에를 제작하기 위하여 Cas9 단백질과 선발된 K1N gRNA 복합체를 누에의 초기배아 주공과 후부 사이 가운데 배면에 microinjection하고, 그 결과 Table 3에 나타내었다.
BmKMO 유전자의 돌연변이가 발생된 G1 세대 성충의 KMO 유전자 발현과의 연관성을 분석하기위하여, RT-PCR (Fig. 4A) 및 qRT-PCR (Fig. 4B)을 이용하여 산란 후 성충의 BmKMO 유전자의 발현을 분석하였다. 엑손 1과 2을 증폭하기 위한 primer를 gRNA 표적 부위를 포함하도록 제작하여 KMO 유전자를 증폭한 결과, 성충에서 BmKMO 유전자의 발현 감소가 확인되었다(Fig.
cDNA는 500 ng의 RNA와 PrimeScript 1st strand cDNA 합성 키트(TaKaRa, Japan)를 이용하여 합성하고, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 및 quantitative real time-PCR (qPCR)에 이용하였다. BmKMO 유전자의 발현 분석을 위하여, 엑손 부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(Table 2)와 TB Green Premix EX Taq (TaKaRa, Japan)을 이용하여 qTOWER3 (Analytik Jena, Germany)를 통해 BmKMO 유전자의 엑손을 증폭하고, BmGAPDH 유전자를 이용하여 각 시료의 표적 유전자 발현을 표준화하고 정상 나방을 기준으로 ddCt 방법을 이용하여 비교하였다.
Electroporation을 위하여 Cas9/gRNA 복합체(2 ug Cas9, 2 ug gRNA, 272 mM Sucrose, 10 mM Hepes, pH7.3)를 상온에서 10분간 형성시키고 2×106 cell/ 0.4 ml의 BM-N 세포와 혼합 후, 0.4 cm electroporation cuvette (Bio-Rad, USA)으로 옮기고, Gene Pulser X cell electroporation system (BioRad, USA)을 이용하여 750 V/cm 출력으로 15 ms 동안 전기충격을 가했다.
mori 게놈 내에서의 출현 빈도를 분석하였다. Off-target 가능성을 분석하기 위하여 PAM 서열로부터 N20, N12, 및 N8의 출현 빈도를 분석하고(Table 1), 가장 낮은 출현빈도를 나타내는 gRNA 표적 서열을 선발하여 gRNA를 합성하기 위한 Table 2의 PCR 프라이머를 제작하였다. gRNA의 합성은 GeneArt Precision gRNA synthesis kit (Invitrogen, Lithuania)를 이용하여, 사용자 매뉴얼에 따라 PCR을 통해 주형 DNA를 제작하고 시험관 내에서 RNA 중합효소를 이용하여 gRNA를 합성 후 정제하고, –80℃에 보관 후 실험에 사용하였다.
T7E1 분석은 각 엑손 부위의 PCR 산물을 95℃에서 5분간 변성 시킨 후 85℃까지 초당 2℃씩 냉각시키고, 25℃까지 초당 0.1℃씩 천천히 냉각시키면서 PCR 산물의 재결합을 유도하였다. 이 후 1 U의 T7E1 (NEB, USA)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 2% 아가로스겔에 전기영동 후 Quantity One software (Bio-Rad, USA)를 이용하여 밴드의 강도 감소율로 분석하였다.
gRNA의 합성은 GeneArt Precision gRNA synthesis kit (Invitrogen, Lithuania)를 이용하여, 사용자 매뉴얼에 따라 PCR을 통해 주형 DNA를 제작하고 시험관 내에서 RNA 중합효소를 이용하여 gRNA를 합성 후 정제하고, –80℃에 보관 후 실험에 사용하였다.
가이드 RNA의 효율을 분석하기 위하여, 선발 된 표적 부위에 대한 primer (Table 2)를 이용한 PCR을 통해 gRNA 합성을 위한 DNA 주형을 제작하고, 4종의 NTP’s와 T7 RNA 중합효소를 이용한 전사를 통해 3종의 gRNA 합성하였다.
이결과는 돌연변이가 유발된 3마리가 모두 반수체 형태의 유전자를 가지고 있기 때문으로 생각된다[6]. 다음 세대로의 돌연변이 전달을 분석하기 위하여, 선발된 돌연변이 수컷 나방(mM1)을 돌연변이 암컷 나방(mF3)과 정상 암컷 나방에 복수로 교미 시켜 mM1 및 mM1xF3의 돌연변이G1 세대 알을 확보하였다. 얻어진 알들의 발생을 유도하고 색 변화를 관찰한 결과, 역 교배한 G1-mM1 에서는 wild-type과 동일하게 검정색으로 변하는 반면(Fig.
돌연변이가 유발된 BmKMO 유전자 염기서열을 분석하기 위하여, T7E1 분석결과에 따라 5령 4일 째 유충의 다리로부터 혈림프 100 ul를 채취하고, 10,000 xg에서 원심분리를 통하여 혈림프 세포를 수집하였다. 수집된 세포로부터 Wizard SV genomic DNA를 이용하여 게놈 DNA를 추출하고 이를 주형으로 이용하여, Table 2의 프라이머와 Pfx DNA polymerase (Invitrogen, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
1). 상대적으로 길이가 긴 엑손 1과 7영역의 염기서열 내에서 CRISPRdirect 도구[16]를 이용하여 각 엑손에 존재하는 N20NGG 표적서열을 탐색하고, off-target 가능성이 있는 N12NGG, and N8NGG서열에 대하여 B. mori 유전체 데이터베이스(ASM15162V1)를 이용하여 분석하였다(Table 1). 엑손 1 및 7의 표적서열 중 off-target 출현 빈도가 가장 낮은 서열을 선발하여 각각 K1N, K7N 및 K7P로 명명하였다(Fig.
돌연변이가 유발된 BmKMO 유전자 염기서열을 분석하기 위하여, T7E1 분석결과에 따라 5령 4일 째 유충의 다리로부터 혈림프 100 ul를 채취하고, 10,000 xg에서 원심분리를 통하여 혈림프 세포를 수집하였다. 수집된 세포로부터 Wizard SV genomic DNA를 이용하여 게놈 DNA를 추출하고 이를 주형으로 이용하여, Table 2의 프라이머와 Pfx DNA polymerase (Invitrogen, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 유전자는 pJET 1.
유전자 편집 개체의 BmKMO 유전자의 발현 변화를 관찰하기 위하여, 산란 후 정상 및 돌연변이 성충으로부터 RNeasy Mini kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. cDNA는 500 ng의 RNA와 PrimeScript 1st strand cDNA 합성 키트(TaKaRa, Japan)를 이용하여 합성하고, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 및 quantitative real time-PCR (qPCR)에 이용하였다.
유전자 편집 개체의 선발은 부화한 유충을 5령 4일까지 사육하고, 유충의 다리로부터 100 ul의 혈림프를 채취 후 10,000 ×g에서 원심분리를 통하여 혈림프 세포를 수집하였다.
유전자 편집을 위한 gRNA는 온라인 분석도구(http://crispr.dbcls.jp)를 이용하여, NCBI에 등록된 KMO 유전자(Acc. No. AB063490) 엑손 1 및 7의 염기서열로부터 PAM서열을 포함한 23개 뉴클레오타이드(N20NGG) 표적 서열을 검색하고, B. mori 게놈 내에서의 출현 빈도를 분석하였다. Off-target 가능성을 분석하기 위하여 PAM 서열로부터 N20, N12, 및 N8의 출현 빈도를 분석하고(Table 1), 가장 낮은 출현빈도를 나타내는 gRNA 표적 서열을 선발하여 gRNA를 합성하기 위한 Table 2의 PCR 프라이머를 제작하였다.
이 후 1 U의 T7E1 (NEB, USA)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 2% 아가로스겔에 전기영동 후 Quantity One software (Bio-Rad, USA)를 이용하여 밴드의 강도 감소율로 분석하였다.
전기충격을 가한 세포는 6 well plate로 옮긴 후 10% FBS가 포함된 신선한 2 ml의 TNM-FH 배지를 공급하여 27℃에서 5시간 동안 배양한 후 죽은 세포를 제거하고 새로운 배지로 교체하여 67시간 동안 추가 배양하였다. 이후 배양된 세포를 수집하고 Wizard SV genomic DNA 추출키트(Promega, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하고, Table 2의 프라이머를 이용하여 각각의 표적 부위를 증폭 후 T7 endonuclease 1 (T7E1) 분석을 통하여 gRNA 효율을 검정하였다.
Microinjection을 위한 누에 알은 Kim 등[9]의 방법에 따라 준비하고 산란 후 5시간 이내에 주사를 완료하였다. 주사를 위하여 Cas9 (300 ng/ul)와 선발된 K1N gRNA (500 ng/ul)를 완충용액(5 mM KCl, 0.5 mM Phosphate buffer, pH 7.0)에 혼합 후 상온에서 10분간 방치하여 복합체를 형성시키고, micro-injector (Narishige, Japan)를 이용하여 준비된 누에 배아의 배면에 텅스텐 바늘을 이용하여 천공하여 microcapillary를 통해 10-15 nl의 복합체를 주입하고, 난각의 구멍은 Cyanocrylate 접착제를 이용하여 막은 후 보습한 배양 용기에 넣어 25℃시에서 부화할 때까지 9-10일간 보호하였다.
4)를 첨가하여 65℃에서 30 분간 배양 후 95℃에서 10분간 Proteinase K를 불활성화 시켰다. 준비된 세포 용출액 3 ul를 주형으로 하여 BmKMO 유전자의 1번 엑손을 증폭하고 T7E1 분석을 통해 유전자 편집 개체를 선발하였다.
수집된 세포로부터 Wizard SV genomic DNA를 이용하여 게놈 DNA를 추출하고 이를 주형으로 이용하여, Table 2의 프라이머와 Pfx DNA polymerase (Invitrogen, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 유전자는 pJET 1.2 blunt vector (Thermo Scientific, Lithuania)에 클로닝하여 각 유충의 40개 클론에 대한 염기서열을 분석하였다.
대상 데이터
실험에 사용한 누에는 휴면계통 보급 품종인 백옥잠(잠 123*124)을 이용하였으며, 누에 사육은 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육기준(온도, 24-27℃, 습도, 70-90%) 준하여 신선한 뽕잎을 급이하고 25℃, 16L8D 조건에서 사육하였다. 누에 난소 세포주 BM-N (CRL-8910)는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 27℃에서 10% Fetal Bovine Serum (FBS; GEMIMI, USA)를 포함하는 TNM-FH 배지(WELGENE, Korea)를 이용하여 배양하였다.
실험에 사용한 누에는 휴면계통 보급 품종인 백옥잠(잠 123*124)을 이용하였으며, 누에 사육은 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육기준(온도, 24-27℃, 습도, 70-90%) 준하여 신선한 뽕잎을 급이하고 25℃, 16L8D 조건에서 사육하였다. 누에 난소 세포주 BM-N (CRL-8910)는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 27℃에서 10% Fetal Bovine Serum (FBS; GEMIMI, USA)를 포함하는 TNM-FH 배지(WELGENE, Korea)를 이용하여 배양하였다.
데이터처리
모든 실험결과는 평균값(mean value) ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, IBM SPSS Statistics 23 (IBM, USA)를 이용한 일원배치 분산분석(Oneway Analysis of Variance; ANOVA)을 실시하고, 각 평균값의 유의성(p<0.05)은 Duncan’s multiple rage test를 실시하여 검정하였다.
이론/모형
Microinjection을 위한 누에 알은 Kim 등[9]의 방법에 따라 준비하고 산란 후 5시간 이내에 주사를 완료하였다. 주사를 위하여 Cas9 (300 ng/ul)와 선발된 K1N gRNA (500 ng/ul)를 완충용액(5 mM KCl, 0.
유전자 편집 개체의 BmKMO 유전자의 발현 변화를 관찰하기 위하여, 산란 후 정상 및 돌연변이 성충으로부터 RNeasy Mini kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. cDNA는 500 ng의 RNA와 PrimeScript 1st strand cDNA 합성 키트(TaKaRa, Japan)를 이용하여 합성하고, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 및 quantitative real time-PCR (qPCR)에 이용하였다. BmKMO 유전자의 발현 분석을 위하여, 엑손 부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(Table 2)와 TB Green Premix EX Taq (TaKaRa, Japan)을 이용하여 qTOWER3 (Analytik Jena, Germany)를 통해 BmKMO 유전자의 엑손을 증폭하고, BmGAPDH 유전자를 이용하여 각 시료의 표적 유전자 발현을 표준화하고 정상 나방을 기준으로 ddCt 방법을 이용하여 비교하였다.
성능/효과
BmKMO 유전자의 구조를 분석하기 위하여 NCBI에 등록된 Dazao 품종의 엑손 및 인트론의 구조를 분석한 결과, 유전자의 크기는 19,135 bp로서 10개의 엑손과 11개의 인트론으로 구성되어 있었다(Fig. 1). 상대적으로 길이가 긴 엑손 1과 7영역의 염기서열 내에서 CRISPRdirect 도구[16]를 이용하여 각 엑손에 존재하는 N20NGG 표적서열을 탐색하고, off-target 가능성이 있는 N12NGG, and N8NGG서열에 대하여 B.
BmKMO 유전자 편집 누에를 제작하기 위하여 Cas9 단백질과 선발된 K1N gRNA 복합체를 누에의 초기배아 주공과 후부 사이 가운데 배면에 microinjection하고, 그 결과 Table 3에 나타내었다. Cas9/K1N gRNA를 주사한 480개의 누에 알 중 87(18.1%)마리의 유충이 부화 되었으나, 이중 5.7%에 해당하는 5개체만이 5령까지 생존하여, Cas9 단백질만 주사한 그룹의 부화율(62%) 및 생존율(84.8%) 보다 현저하게 낮게 나타났다. 이러한 결과는 대부분의 CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 편집연구에서 gRNA 농도증가에 따라 부화율 및 생존율이 감소하는 경향과 일치함에 따라 일반적인 현상으로 외부에서 유입된 gRNA가 배아의 분화에 영향을 미친 것으로 판단된다[5].
1). 선발된 가이드 RNA 표적 서열은 20개의 염기로 이루어진 각각의 표적 서열은 게놈 내에서 유일하며, 그 길이를 PAM 서열 인근 12개의 염기까지 축소하여도 단1회만 존재한 것으로 확인 되었다(Table 1). Fu 등[5]에 따르면 gRNA의 표적 서열이 19 또는 18개의 염기로 축소되더라도 표적을 인지하고 절단할 수 있다고 보고하고 있다.
다음 세대로의 돌연변이 전달을 분석하기 위하여, 선발된 돌연변이 수컷 나방(mM1)을 돌연변이 암컷 나방(mF3)과 정상 암컷 나방에 복수로 교미 시켜 mM1 및 mM1xF3의 돌연변이G1 세대 알을 확보하였다. 얻어진 알들의 발생을 유도하고 색 변화를 관찰한 결과, 역 교배한 G1-mM1 에서는 wild-type과 동일하게 검정색으로 변하는 반면(Fig. 3D), 돌연변이 사이에 근친교배를 수행한 G1-mM1xF3 돌연변이의 경우 일부 알이 흰색으로 남아 있었다(Fig. 4E). Kynurenine 3-Monooxygenase는 누에의 ommochrom 생합성 경로에서 kynurenine을 3-hydroxykynurenine으로 전환시키는 역할을 하며, 알 또는 눈의 pigment granule의 oxidative condensation에 의하여 3-hydroxykynurenine이 ommochrom pigment를 형성하여 색을 나타낸다고 알려져 있다[11].
4B)을 이용하여 산란 후 성충의 BmKMO 유전자의 발현을 분석하였다. 엑손 1과 2을 증폭하기 위한 primer를 gRNA 표적 부위를 포함하도록 제작하여 KMO 유전자를 증폭한 결과, 성충에서 BmKMO 유전자의 발현 감소가 확인되었다(Fig. 4). 이러한 결과는 게놈수준에서 발생한 엑손 내 결실 돌연변이가 mRNA 전사에는 큰 영향을 미치지 못 하지만, 정상적이지 못한 mRNA의 경우 번역 과정에 단백질의 합성 및 기능 이상을 유발하기때문으로 판단된다.
유전자 편집 누에를 선발하기 위하여 5령까지 생존한 5개체의 혈림프를 이용하여 T7E1 분석을 수행한 결과(Fig. 3A), 3개체에서 유전자 편집에 따른 2밴드 패턴이 확인되었으며, BMN 세포를 대상으로 분석한 유전자 편집 효율보다 높은 60%를 나타났다(Table 3). 유전자편집이 이루어진 돌연변이 개체에 대한 염기서열 분석결과 3개체에서 모두 다른 유형의 삽입 및 결실 돌연변이를 가지고 있음이 확인 되었다(Fig.
유전자 편집이 이루어진 돌연변이의 표현형을 관찰하기 위하여 현경을 이용하여 각 나방의 눈을 관찰한 결과, 성충이 된 5마리의 나방 모두 Fig. 3C와 같이 wild type과 동일한 검정색 눈을 가지고 있었다. 이결과는 돌연변이가 유발된 3마리가 모두 반수체 형태의 유전자를 가지고 있기 때문으로 생각된다[6].
3A), 3개체에서 유전자 편집에 따른 2밴드 패턴이 확인되었으며, BMN 세포를 대상으로 분석한 유전자 편집 효율보다 높은 60%를 나타났다(Table 3). 유전자편집이 이루어진 돌연변이 개체에 대한 염기서열 분석결과 3개체에서 모두 다른 유형의 삽입 및 결실 돌연변이를 가지고 있음이 확인 되었다(Fig. 3B). 이는 CRISPR/Cas9 시스템에 의하여 발생된 PAM 서열 인근의 결절 부위가 DNA 회복기작 중 핵산분해효소에 의하여 무작위적으로 제거 또는 삽입이 이루어지기 때문으로 생각된다[6, 17].
2A). 절단된 생성물의 강도 비교를 통한 효율분석에서 K1N gRNA의 효율은 40% 이상이었으나, K7N 및 K7P의 효율은 각각 23%와 33%로 K1N보다 낮게 나타났다(Fig. 2B). 따라서 누에의 KMO 유전자 편집을 위한 최적 gRNA는 K1N이라 판단된다.
후속연구
결과적으로 본 연구와 같이 단백질 형태의 Cas9과 gRNA만을 사용 했을 때, 유전자 편집시스템의 도입을 위해 벡터 혹은 바이러스를 사용하지 않은 만큼 돌연변이 분석을 위해서는 모든 개체에 대한 유전자 분석을 수행해야 하는 수고가 발생하는 반면 외부 유전자의 도입에 대한 부담을 줄일 수 있을 것으로 생각되어 목적에 따른 도입시스템의 선택이 필요하며, 유전자 가위의 특성상 대립유전자가 동일한 유전형으로 돌연변이 유발이 이루어지지 않는 만큼 편집 부위를 정확하게 제어하는 기술이 확보된다면 육종 기간을 비약적으로 단축시킬 수 있는 곤충 육종 기술로 발전가능성이 높다고 생각된다.
이는 CRISPR/Cas9 시스템에 의하여 발생된 PAM 서열 인근의 결절 부위가 DNA 회복기작 중 핵산분해효소에 의하여 무작위적으로 제거 또는 삽입이 이루어지기 때문으로 생각된다[6, 17]. 따라서 CRISPR/Cas9 시스템을 효율적으로 이용하기 위해서는 유전자 편집 효율을 높이고 편집에 따른 염기서열을 예측 가능하도록 절단 범위를 정형화 하기 위한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
3G). 본 연구에서는 빠른 표현형의 발현을 확인하고자 G0 세대의 근친 교배와 역 교배를 통하여 G1 세대를 확보하였으나, 순종 돌연변이를 얻기 위해서는 반수체 상태의 G0세대의 돌연변이를 선발하고 부모 세대와 역 교배하여 G1세대를 생산하고, 유전자 분석을 통하여 돌연변이 유전자를 가진 개체를 선발하여 근친교배를 통해 G2세대를 생산한다면 순종돌연변이의 확보가 가능할 것으로 판단된다.
참고문헌 (21)
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