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문제 정의
- TNF-α와 함께 건선 유발 사이토카인으로 알려진 IL-17A에 의한 신호조절에서 quercetin의 관여하는지 확인하고자 하였다.
- 그러나, 건선과 같은 자가면역성 만성 피부질환 등에 대한 quercetin의 효능과 활성 연구는 많이 보고되지 않았다. 따라서 본 연구는 표피층을 이루는 인간 각질형성세포인 HaCaT 세포주를 활용해 quercetin 이 피부 염증 개선에 미치는 효과와 작용 기전을 밝히고자 하였다. 건선은 대표적인 피부 자가면역 질환으로 각질형성세포에서 생성되는 케라틴 단백질의 과발현 및 과각화로 인한 두꺼운 각질층 형성, 그리고 면역 세포들로부터 과도한 사이토카인, 케 모카인 분비로 인한 만성 피부 염증 유발이 가장 큰 특징이다[34].
- 따라서 본 연구에서는 in vitro 건선 모델인 TNF-α/IL-17A 유도 HaCaT 세포주 모델에서 quercetin에 의한 CCL20 및 케라틴 단백질 조절 기능을 규명하고 건선 억제 효능을 규명하였다.
제안 방법
- HaCaT 세포주를 6-well plate에 8.0×105 cells/well로 분주하여 37℃, CO2 5% 배양기에서 24시간 동안 안정화하고, serum-free 배지 조건에서 TNF-α (20 ng/mL)와 quercetin을 농도별로 처리하였다.
- HaCaT 세포주에 IL-17A를 100 ng/mL 농도로 처리했을 때 무처리군 대비 112.4±2.07% 세포 생존율을 보였으며, IL-17A와 quercetin (10 μg/mL)을 동시 처리한 시험군에서는 무처리군 대비 119.4±0.57% 세포 생존율을 확인하여 추후 실험에 적용하였다.
- TRIzol reagent (Ambion, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 total RNA를 추출하고, Revertra ACE kit (Toyobo, Osaka, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. PCR 반응은 StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 장비를 이용하여 50 ℃ 2분, 95 ℃ 10분 holding stage, 95 ℃ 15초, 60 ℃ 1분 cycling stage로 총 45회 실시하였다. 위 실험에서 사용한 probe들은 Table 1에 별도로 표기하였다.
- RIPA Buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), Protease and Phosphatase Inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific) 혼합액을 100 μL를 분주한 뒤 단백질을 추출하고 전기영동을 실시하였다.
- Louis, MO, USA) 및 IL-17A (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 각각의 농도 조건에서 처리한 후 serum-free 배지 조건에서 quercetin을 각 농도별로 동시 처리하였다. TRIzol reagent (Ambion, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 total RNA를 추출하고, Revertra ACE kit (Toyobo, Osaka, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. PCR 반응은 StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 장비를 이용하여 50 ℃ 2분, 95 ℃ 10분 holding stage, 95 ℃ 15초, 60 ℃ 1분 cycling stage로 총 45회 실시하였다.
- PVDF membrane에 transfer시킨뒤 4℃에서 primary antibody (1:1000)를 처리하였다. 그 후 secondary antibody (1:10000)를 1시간 동안 처리한 뒤 ECL 용액(Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 PVDF membrane 위에 분주하고, 이미지 처리 장치(MicroChemi 4.2, DNR, Neve Wamin, Israel)를 이용하여 단백질 발현을 관찰하였다. 이후 Image J 프로그램(N.
- 0×105 cells/well로 분주하여 37℃, CO2 5% 배양기에서 24시간 동안 안정화하고, serum-free 배지 조건에서 TNF-α (20 ng/mL)와 quercetin을 농도별로 처리하였다. 기존 배지를 제거한 뒤 차가운 DPBS (Welgene)로 3회 washing 하였다. RIPA Buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), Protease and Phosphatase Inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific) 혼합액을 100 μL를 분주한 뒤 단백질을 추출하고 전기영동을 실시하였다.
- 기존 배지를 제거한 후 phenol red-free 배지와 CCK-8 용액을 각각 10:1로 희석하여 well에 500 μL씩 분주하였고 30분간 반응시킨 후 상등액만 별도로 채취하여 450 nm 조건에서 흡광도를 측정하였다.
- 따라서 IL-17A 처리 조건에서 quercetin에 의한 IκBα mRNA 변화를 관찰하였다.
- 따라서 TNF-α에 의해 유도된 HaCaT 세포주에서 quercetin에 의한 CCL20 신호 전달 조절 메카니즘을 규명하기 위해, western blot 기법을 활용하여 IκBα/NFκB complex 내 IκBα의 인산화 조절 여부를 확인하였다.
- 따라서 TNF-α에 의해 유도된 HaCaT 세포주에서 quercetin에 의한 STAT3 단백질의 인산화를 관찰하였다.
- 마지막으로 HaCaT 세포주에 TNF-α 및 IL-17A를 동시 처리하여 활성을 유도한 후, quercetin의 사이토카인 발현 조절 기능을 관찰하였다.
- TNF-α와 함께 건선 유발 사이토카인으로 알려진 IL-17A에 의한 신호조절에서 quercetin의 관여하는지 확인하고자 하였다. 먼저, CCK-8 assay를 통해 IL-17A 및 quercetin에 의한 세포 독성을 확인하였다. HaCaT 세포주에 IL-17A를 100 ng/mL 농도로 처리했을 때 무처리군 대비 112.
- 본 연구에서는 시험관 내 건선 유사 모델인 TNF-α 또는 IL17A 단독 처리 조건 및 TNF-α/IL-17A 동시 처리 조건에서 유도된 HaCaT 세포주를 사용하여 quercetin의 건선 피부염 개선 효능을 관찰하였다.
- 이때 건선 유발을 위해 TNF-α (Sigma aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 IL-17A (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 각각의 농도 조건에서 처리한 후 serum-free 배지 조건에서 quercetin을 각 농도별로 동시 처리하였다.
- 2, DNR, Neve Wamin, Israel)를 이용하여 단백질 발현을 관찰하였다. 이후 Image J 프로그램(N.I.H, Bethesda, MD, USA)을 통해 단백질의 발현량을 정량화 하였다. 실험에서 사용된 모든 항체는 Table 2에 별도로 표기하였다.
대상 데이터
- HaCaT 세포주(Human keratinocyte cell lines)는 고려대학교 (Seoul, Republic of Korea)에서 분양 받았으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Welgene, Gyeongbuk, Korea)에 10% Fetal bovine serum (Welgene)과 1% Penicillin-Streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 혼합한 배지를 이용해 37 ℃ , CO2 5% 조건에서 배양하였다.
- TNF-α는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, IL17A는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, 모두 PBS (Welgene, Gyeongbuk, Korea) buffer에 녹여 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 quercetin hydrate는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, dimethyl sulfoxide에 10 mg/mL 농도로 용해한 뒤 −20 ℃에 보관하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복 측정을 실시하여 각 군별로 평균과 표준편차를 사용해 표기 하였으며, Student’s t-test를 활용하여 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- Cell counting kit-8 (CCK-8 assay, DogenBio, Seoul, Korea) 방법으로 세포독성을 평가하였다. HaCaT 세포를 24-well plate에 5.
- 3 Quercetin down regulates IκBα and STAT3 phosphorylation in the presence of IL-17A. Cell viability was analyzed by CCK-8 assay to understand the effect of IL-17A. (A) Concentration of 10 μg/mL was found to be the maximum concentration without inducing cytotoxicity.
- TNF-α 및 quercetin이 HaCaT 세포주에 미치는 독성을 평가하기 위해 CCK-8 assay를 수행하였다.
성능/효과
- IL-1α mRNA 발현량을 확인한 결과, TNF-α/ IL-17A 처리군은 무처리군 대비 2.5±0.07 배 증가하였으며 quercetin 2.5, 5, 10 μg/mL 처리군은 TNF-α/IL-17A 처리군대비 각각 30.6±8.43, 30.6±5.87, 10.3±6.51% 감소하였다(Fig. 4A).
- IL-1β 유전자 발현은 TNF-α/IL-17A 처리군에서 무처리군대비 2.0±0.21 배 증가하였고, quercetin을 농도별로 처리한 결과 TNF-α/IL-17A 처리군 대비 각각 35.7±5.67, 39.0±5.48, 39.2±2.44% 감소하였다(Fig. 4B).
- IL-17A 처리군은 무처리군 대비 1.4±0.09배 증가하였고, IL-17A 및 quercetin 10 μg/mL 농도로 동시 처리한 결과 IL-17A 단독 처리군 대비 각각 55.8±5.28% mRNA 발현이 감소하였다(Fig. 3B).
- IL-6 mRNA 발현량은 quercetin 단독 처리군에서 무처리군 대비 13.5±0.68% 감소하였고, TNF-α/IL-17A 처리군은 무처리군 대비 3.8±0.44 배 증가하였다.
- Serum-free 조건에서 TNF-α (20 ng/mL)와 quercetin을 동시 처리한 결과, quercetin 10 μg/mL 농도 조건에서 세포 생존율이 131.5±7.13%로 세포독성이 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 1A).
- TNFα mRNA TNF-α/IL-17A 처리군에서 무처리군 대비 4.6±0.30배 상향 조절되었다.
- TNF-α로 유도된 HaCaT 세포주에서 인산화된 IκBα 단백질은 약 6.7±0.07배 증가하였고, quercetin을 각각 농도별 2.5, 5, 10 μg/mL로 처리한 결과 IκBα 단백질의 인산화가유의성 있게 억제되었다(Fig. 2A).
- TNF-α로 유도된 HaCaT 세포주에서 인산화된 STAT3 단백질은 6.9±0.12배 증가되었고, quercetin에 의해 STAT3 단백질 인산화가 유의성 있게 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 2C).
- 건선 피부염 시험 모델인 TNF-α 유도 HaCaT 세포주에 quercetin을 최대 10 μg/mL 농도 조건으로 처리한 후 염증성 사이토카인 IL-1α, IL-1β, IL-6의 mRNA 발현을 확인한 결과, TNF-α 단독 처리군에서 IL-1α mRNA 발현량은 무처리군 대비 2.5±0.40배 증가하였고, 양성대조군으로 사용된 brazilin은 TNF-α 처리군 대비 64.3±4.56% 감소하였으며, quercetin 2.5, 5, 10 μg/mL 농도별로 처리한 결과 TNF-α 처리군 대비 각각 33.8±9.00, 37.8±9.98, 49.1±7.14% 감소하였다 (Fig. 1B).
- 건선 피부염의 중요한 인자인 CCL20 케모카인의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과, TNF-α에 의해 활성화된 HaCaT 세포주에서 CCL20 mRNA 발현량이 무처리군 대비 5.6±0.55배 증가되어 TNF-α 유도 HaCaT 세포주에서 CCL20 mRNA 발현이 정상적으로 작동하였음을 확인하였다.
- 결론적으로, quercetin이 TNF-α 유도된 HaCaT 세포주에서 NF-κB, STAT3 신호전달 활성화를 억제함으로써 염증성 사이토카인 및 CCL20 케모카인발현을 효과적으로 저해한다는 것을 입증하였다.
- 3B). 또한 IL-17A로 유도된 HaCaT 세포주에서 quercetin에 의한 STAT3 인산화 조절 여부를 관찰한 결과, 무처리군 대비 IL17A 처리군에서 STAT3 단백질 인산화가 유도된 것을 확인하였고, quercetin은 유의성 있게 STAT3 단백질의 인산화를 억제 하였다 (Fig. 3C). 인산화된 STAT3 단백질 정량 분석 결과, quercetin 10 μg/mL 처리군에서 약 36.
- 마지막으로 CCL20 mRNA 발현량을 확인하였을 때, TNF-α/IL-17A 처리군에서는 무처리군 대비 8.7±0.53배로 발현이 증가하였고, 이때 quercetin을 농도별로 처리한 결과 2.5 μg/mL 농도에서는 CCL20 mRNA 발현 감소가 나타나지 않았으나 5, 10 μg/mL 농도에서 각각 34.0±2.23, 54.6±0.81% 감소되었다(Fig. 4E).
- 마지막으로 TNF-α/IL17A 동시 처리하여 HaCaT 세포를 자극한 후 quercetin에 의해 IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α 및 CCL20 mRNA 발현이 억제되어 in vitro 세포 수준에서는 최대 10 μg/mL 조건에서 유의미한 개선 효과가 관찰되었다.
- 1F). 마지막으로 건선에서 비특이적으로 증가되는 KRT6A 및 KRT16의 발현 변화를 관찰한 결과, KRT6A 및 KRT16 유전자의 mRNA 발현량 또한 quercetin에 의해 농도 의존적 방식으로 감소하였다(Fig. 1H). 위 결과들을 통해 quercetin은 TNF-α 로 유도된 HaCaT 세포주에서 염증성 사이토카인, 케모카인 분비를 억제할 뿐 아니라 건선 피부에서 비특이적으로 증가하는 KRT6A/16 발현 또한 유의적으로 억제함을 알 수 있었다.
- 양성 대조군인 brazilin을 7 μg/mL 농도 조건으로 처리하였을 때 TNFα 단독 처리군 대비 약 79.0±2.23% 감소하였고, 동일한 조건에서 TNF-α와 quercetin을 각 농도별로 동시 처리한 결과 TNF-α 단독 처리군 대비 각각 19.5±5.71, 32.5±4.64, 52.9±4.59% 감소하여 농도 의존적 방식으로 감소됨을 확인하였다(Fig. 1F).
- 위 결과들을 통해 quercetin은 TNF-α 로 유도된 HaCaT 세포주에서 염증성 사이토카인, 케모카인 분비를 억제할 뿐 아니라 건선 피부에서 비특이적으로 증가하는 KRT6A/16 발현 또한 유의적으로 억제함을 알 수 있었다.
- 위 결과를 토대로 TNF-α로 활성화된 HaCaT 세포주에서 quercetin에 의한 염증성 사이토카인 및 CCL20 케모카인의 발현 조절 기작은 IκBα 및 STAT3 인산화 신호조절과 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다.
- 이 뿐만 아니라 quercetin은 건선에서 발현되는 KRT6A, KRT16 유전자 mRNA 발현과 IL-17A 자극에 의한 IκBα mRNA 수준 및 STAT3 인산화를 유의하게 억제하였다.
- 이러한 결과 들은 quercetin이 TNF-α 또는 IL-17A 단독 처리 조건에서 나타난 결과와 마찬가지로 TNF-α/IL-17A 유도 HaCaT 세포주에서 염증성 사이토카인 및 케모카인의 유전자 발현이 유의적으로 억제함을 보여준다.
- 이를 정량 분석한 결과, 양성 대조군으로 사용한 brazilin은 약 96.3±0.40% 감소시켰고, quercetin 10 μg/mL 농도 조건에서 99.1±0.27% 감소시켰다(Fig. 2D).
- 인산화된 IκBα 단백질은 양성 대조군으로 사용한 brazilin 처리군에서 약 92.2±3.05% 감소 하였고, quercetin 2.5, 5, 10 μg/mL 처리군에서는 TNF-α 단독 처리군 대비 17.3±2.41, 75.8±3.57, 91.1±2.10% 감소하였다 (Fig. 2B).
- 인산화된 STAT3 단백질 정량 분석 결과, quercetin 10 μg/mL 처리군에서 약 36.3±6.81% STAT3 단백질 인산화를 억제하였다(Fig. 3D).
후속연구
- 이러한 결과는 건선 피부염 유발 인자들의 quercetin에 의한 선택적 제어를 보여주며, 이는 건선 피부염 개선 소재로서의 개발 가능성을 보여준다. 따라서 향후 건선 피부염 세포 모델에서의 quercetin 효능 결과를 바탕으로 전임상 동물실험 및 임상시험을 통해 건선 피부염 개선 후보 물질로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
- 마지막으로 TNF-α/IL17A 동시 처리하여 HaCaT 세포를 자극한 후 quercetin에 의해 IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α 및 CCL20 mRNA 발현이 억제되어 in vitro 세포 수준에서는 최대 10 μg/mL 조건에서 유의미한 개선 효과가 관찰되었다. 이러한 결과는 건선 피부염 유발 인자들의 quercetin에 의한 선택적 제어를 보여주며, 이는 건선 피부염 개선 소재로서의 개발 가능성을 보여준다. 따라서 향후 건선 피부염 세포 모델에서의 quercetin 효능 결과를 바탕으로 전임상 동물실험 및 임상시험을 통해 건선 피부염 개선 후보 물질로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
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