[논문]돼지 정자 동결보존에 있어 5 ml straw의 한계성 극복

김범기; 함형빈; 김상현; 손중호; 정기화

doi:10.5352/jls.2020.30.1.77

돼지 정자 동결보존에 있어 5 ml straw의 한계성 극복
Assessing the Use of 5 ml Straws in the Cryopreservation of Boar Semen 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.1, 2020년, pp.77 - 81

김범기 (노아바이오텍) , 함형빈 (다비육종) , 김상현 (다비육종) , 손중호 (노아바이오텍) , 정기화 (경남과학기술대학교 동물소재공학과)

초록
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본 연구는 돼지정자의 동결보존에 있어 0.5 ml straw에 비해 5.0 ml straw가 가지고 있었던 제한적인 요소들을 극복하기 위하여 동결속도, 융해온도 및 융해 시간을 확립하기 위하여 실시되었다. 동결속도는 정자가 -140℃까지 도달하는 시간을 8분 30초인 동결법(FR-1)과 14분인 동결법(FR-2)으로 나누어 각각 0.5 ml 및 5 ml straw를 이용하여 동결하였으며, 동결-융해한 정자는 CASA 장비를 이용하여 정자 성상을 비교 분석하였다. 동결속도 만큼 융해 온도 및 시간 또한 매우 중요한 요소이기 때문에 융해 방법을 37℃, 50℃ 및 70℃에서 각각 115초, 45초 및 25초간 실시하여 정자 성상을 비교하였다. 그 결과 FR-2의 동결속도 보다 FR-1의 동결속도에서 높은 생존율과 운동성을 보였고, 50℃에서 45초간 융해 하였을 때 가장 높은 생존율과 운동성을 보였다(73.4±3.6; 74.5±2.2%, p<0.05). 정자의 첨체 충실성 및 형태학적 특징에서는 처리구간에 유의적인 차이가 없었다. 본 연구를 통해 얻은 데이터를 종합해볼 때, 그 동안 동결정액을 이용한 돼지 인공수정 시 5.0 ml straw가 0.5 ml straw 비해 저조한 정자 생존율 및 활력을 나타냄으로써 번식성적이 떨어져 사용을 기피하여 왔지만 개선된 프로토콜을 활용하면 동결정액을 이용한 돼지 인공수정에 있어 여러 straw를 융해해야 하는 불편함 대신에 인공수정 시 1 straw를(dose) 융해하여 사용함으로써 사용자의 편리성을 높일 뿐만 아니라 인공수정에 있어 집중력을 높여 번식성적 향상에도 기여할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to overcome some of the limiting factors that the maxi cryopreservation straw of 5 ml presents in processing boar semen. Cryopreservation of semen samples was conducted in 0.5 ml and 5.0 ml straws at two freezing rates: -140℃ in 8 minutes and 30 seconds (FR-1) and -140℃ in 14 minutes (FR-2). The straws were then thawed and the semen parameters were compared by Computer Assisted Sperm Analysis, and sperm morphology and acrosome status were examined by Coomassie blue staining. The effects of different thawing temperatures and durations were also compared, namely 37℃ for 115 sec, 50℃ for 45 sec, or 70℃ for 25 sec. In general, the FR-1 group showed higher (p<0.05) sperm viability and motility than the FR-2 group in the 5.0 ml straws. Compared to other ranges, thawing at 50℃ for 45 sec showed the highest sperm viability and motility (68.4±3.6% and 69.5±2.2%, p0.05). The data obtained in this study suggest that improving the freezing-thawing protocol for one artificial insemination dose straws (5.0 ml) retains the sperm's parameters from 0.5 ml cryopreservation, and is more convenient to handle, which could result in enhanced reproductive performance.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. Frozen-thawed sperm's morphology and acrosome integrity exam.
표 Table 1. Comparison of two different straws on post-thawed sperm parameters
그림 Fig. 1. Frozen-thawed sperm's morphology and acrosome integrity exam.

AI 본문요약
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문제 정의

그러므로 본 연구는 돼지정자 동결보존에 있어 5 ml straw 사용의 한계성을 극복하기 위하여 프로그램 동결기를 이용하여 완만동결[2]과 급속동결[29]의 방법을 개선하고자 하였고 아울러 5 ml straw 동결속도에 따른 적합한 융해 조건을 찾고자 본 연구를 수행하게 되었다.

제안 방법

, Korea)을 이용하여 정자의 생존율 및 운동성을 분석하여 운동성이 85% 이상으로 양호한 10두의 정자만을 사용하였다. 동일한 개체에서 채취한 정액을 각각 1/2씩 분주하여 0.5 ml 및 5.0 ml straw를 이용한 동결 실험에 제공하였다.
, Korea)를 이용 하여 분석하였다. 융해된 정액 1.5 ml을 37℃ 항온수조에서 추가로 10분간 가온 시키고, 37℃로 예열된 Makler counting chamber (Sefi-Medical, Israel) 위에 정액 10 μl를 떨어뜨린 후 CCD 카메라(Veltek, Korea)가 부착된 광학현미경(Nikon, Japan)에 연결하여 분석하였다.

대상 데이터

본 연구의 종돈은 다비 인공수정센터에서 보유하고 있는 듀록 품종 12두를 이용하였다. 채취한 농후 정액을 1:1(v/v)비율로 희석제(Seminark Gold, Korea)에 희석하여 실험실로 운반하였다.
채취한 농후 정액을 1:1(v/v)비율로 희석제(Seminark Gold, Korea)에 희석하여 실험실로 운반하였다. 정액은 SAIS II system (Medical Supply Co., Korea)을 이용하여 정자의 생존율 및 운동성을 분석하여 운동성이 85% 이상으로 양호한 10두의 정자만을 사용하였다. 동일한 개체에서 채취한 정액을 각각 1/2씩 분주하여 0.

데이터처리

데이터의 처리는 One way 분산분석(ANOVA)를 이용하였고(Sigma Plot ver 11), 처리 그룹간의 평균과 표준오차를 구한 후 유의성은 Duncan의 다중 범위 검정 테스트를(multiple range test) 이용하였다. 처리구 간의 유의성은 p<0.

이론/모형

정액의 동결은 프로그램 동결장치(Ice Cube 14S, Sy-Lab, Austria)를 사용하여 다음과 같이 동결하였다. 급속 동결법(FR-1)은 5℃에서 -120℃까지 분당 -50.1℃ 하강, -120℃에서 30초간 정지, -140℃까지 분당 -40℃ 하강 시키는 방법으로 총 동결시간이 8분 30초가 소요되었다. 완만동결법(FR-2)은 5℃에서 -80℃까지 분당 -39.
1℃ 하강, -120℃에서 30초간 정지, -140℃까지 분당 -40℃ 하강 시키는 방법으로 총 동결시간이 8분 30초가 소요되었다. 완만동결법(FR-2)은 5℃에서 -80℃까지 분당 -39.8℃ 하강, -80℃에서 2분 10초간 정지, -140℃까지 분당 -20℃ 하강 시키는 방법으로 총 동결시간이 14분 소요되었다. 각각의 방법으로 동결된 정액은 프로그램 종료 후 즉시 액체질소에 침지 한 후 정자 성상검사를 실시할 때까지 액체질소 통에서 보관하였다.
첨체 충실성 및 형태학적(기형) 검사는 Larson, and Miller[20]의 방법을 이용하여 파라포름 알데하이드에 고정된 정자를 Coomassie Blue 염색을 실시한 후 현미경으로 ×600배하에 검사하였다.

성능/효과

본 연구에서도 5 ml straw에 동결된 정자의 경우 37℃의 온도보다 50℃와 70℃에서 융해 하였을 때 보다 높은 생존율과 운동성을 보였으며 동결속도가 더 빠른 FR-1에서 더 높은 성상을 보였고 50℃에서 45초간 융해하였을 때 생존율 및 운동성이 양호 하였다. 이상의 결과를 바탕으로 FR-1 방법으로 동결 후 50℃에서 45초간 융해 하는 것이 5 ml straw를 이용한 돼지정자의 동결에 가장 유리한 조건이라 판단된다.
정자 동결에 있어 스트로우 용적 차이가 정자 성상에 영향을 주는지 알아보기 위한 실험(Table 1)에서 0.5 ml straw를 사용하는 동결속도와 동일한 동결속도 에서는 0.5 ml straw가 5.0 ml straw보다 유의하게 높은 생존율 및 활력을 나타내었다(Table 1, p<0.05). 이상의 결과에서 5.

후속연구

본 연구의 결과를 요약하면 동결정액을 이용한 돼지 인공수정에 있어서 1 dose 용 5.0 ml straw를 이용할 때 사용자의 편리성을 제공하고 아울러 동결정액 품질향상을 통한 우수씨수퇘지 유전자원의 효율적인 보존 및 관리가 이루어 질 수 있을 것으로 판단되며, 향후 5.0 ml straw 동결 정액을 이용한 돼지 인공수정에 있어서 융해 후 정자 생존율 및 활력의 지속 시간, 수정적기 판단, 적정 정자 농도 및 정액주입 방법 등에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	돼지의 동결 정액을 위한 제조법은 어떤 것이 있는가?	액상 정액은 보관 및 유통기간이 짧고, 보존 온도는 17℃로 시간적, 공간적 제약이 있다는 단점을 가지고 있다. 돼지의 동결 정액은 pellet 동결 정액 제조법[25] 및 maxi-straw 동결 정액 제조법[31] 등의 개발이 되어액상 정액이 가지고 있는 제약 없이 웅돈의 개량과 유전자원보존 등에 매우 활용 가치가 높다고 판단되지만, 돼지 정자의 생리적 특성으로 인한 예민한 내동성, 낮은 번식효율(수정율과 산자수 감소), 융해 과정의 문제 및 비용 과다 등의 원인으로 인하여 제한적으로 활용되고 있는 실정이다[18].
	액상 정액의 단점은 무엇인가?	세계적으로 돼지 번식에는 액상 정액을 이용한 인공수정이 90% 이상 활용되고 있고[19], 이 중에서 95%가 보존 후 3일 미만의 정액을 사용하고 있다[27]. 액상 정액은 보관 및 유통기간이 짧고, 보존 온도는 17℃로 시간적, 공간적 제약이 있다는 단점을 가지고 있다. 돼지의 동결 정액은 pellet 동결 정액 제조법[25] 및 maxi-straw 동결 정액 제조법[31] 등의 개발이 되어액상 정액이 가지고 있는 제약 없이 웅돈의 개량과 유전자원보존 등에 매우 활용 가치가 높다고 판단되지만, 돼지 정자의 생리적 특성으로 인한 예민한 내동성, 낮은 번식효율(수정율과 산자수 감소), 융해 과정의 문제 및 비용 과다 등의 원인으로 인하여 제한적으로 활용되고 있는 실정이다[18].
	FR-1 방법으로 동결 후 50℃에서 45초간 융해 하는 방법이 5 ml straw를 이용한 돼지정자의 동결에 있어 가장 유리한 조건이라고 판단한 것은 어떤 결과를 바탕으로 이루어진 것인가?	또한, 융해의 시간을 천천히 진행하였을 때 세포 내 얼음의 재결정으로 정자에 손상을 줄 수 있다고 하였다[10, 22]. 본 연구에서도 5 ml straw에 동결된 정자의 경우 37℃의 온도보다 50℃와 70℃에서 융해 하였을 때 보다 높은 생존율과 운동성을 보였으며 동결속도가 더 빠른 FR-1에서 더 높은 성상을 보였고 50℃에서 45초간 융해하였을 때 생존율 및 운동성이 양호 하였다. 이상의 결과를 바탕으로 FR-1 방법으로 동결 후 50℃에서 45초간 융해 하는 것이 5 ml straw를 이용한 돼지정자의 동결에 가장 유리한 조건이라 판단된다.

참고문헌 (33)

Abad, M., Garcia, J. C., Sprecher, D. J., Cassar, G., Friendship, R. M., Buhr, M. M. and Kirkwood, R. N. 2007. Effect of insemination-ovulation interval and addition of seminal plasma on sow fertility to insemination of cryopreserved sperm. Reprod. Domest. Anim. 42, 418-422.

상세보기
Behrman, S. J. and Saawads, Y. 1966. Heterologous and homologous inseminations with human semen frozen and stored in a liquid-nitrogen refrigerator. Fert. Ster. 17, 457-466.

상세보기
Bwanga, C. O., de Braganca, M. M., Einarsson, S. and Rodriguez-Martinez, H. 1990. Cryopreservation of boar semen in Mini- and Maxi-straws. J. Vet. Med. A. 37, 651-658.
Bwanga, C. O. 1991. Cryopreservation of boar semen. Acta. Vet. Scand. 32, 431-453.
Carvajal, G., Cuello, C., Ruiz, M., Vazquez, J. M., Martinez, E. A. and Roca, J. 2004. Effects of centrifugation before freezing on boar sperm cryosurvival. J. Androl. 25, 389-396.

상세보기
Casas, I., Sancho, S., Briz, M., Pinart, E., Bussalleu, E., Yeste, M. and Bonet, S. 2009. Freezability prediction of boar ejaculates assessed by functional sperm parameters and sperm proteins. Theriogenology 72, 930-948.

상세보기
Choi, W. C., Yang, M. H., Lee, Y. S., Cheong, H. T., Yang, B. K., Lee, D. S. C. and Park, H. 2007. Effect of thawing temperature on sperm characteristics of frozen semen in miniature pig. Reprod. Dev. Biol. 31, 175-179.
Chung, Y. H., Seo, K. D., Kim, K. K., Shim, K. S. and Lee, J. H. 1999. Effects of thawing conditions on the viability and acrosomal morphology of cryopreserved boar semen, Kor. J. Emb. Trans. 14, 131-137.
Corcuera, B. D. 1996. Efecto de la presi'on osm'otica de los diluyentes de la congelaci'on sobre la viabilidad del espermatozoide de verraco. Thesis UCM, School of Biological Sciences, Madrid.
Courtens, J. L. and Paquignon, M. 1985. Ultrastructure of fresh, frozen-thawed spermatozoa of the boar. In: Johnson LA, Larsson K (eds), Deep Freezing of boar semen. Swedish Univ. of Agri. Sci. Uppsala. pp. 61-87.
Eriksson, B. M. and Rodriguez-Martinez, H. 2000. Effect of freezing and thawing rates on the post-thaw viability of boar spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. 63, 205-220.

상세보기
Estrada, E., Rodriguez-Gil, J. E., Rocha, L. G., Balasch, S., Bonet, S. and Yeste, M. 2014. Supplementing cryopreservation media with reduced glutathione increases fertility and prolificacy of sows inseminated with frozen-thawed boar semen. Andrology 2, 88-99.

상세보기
Fiser, P. S., Pairfull, R. W., Hansen, C., Panich, P. L., Shrestha, J. N. B. and Underhill, L. 1993. The effect of warming velocity on motility and acrosome integrity of boar sperm as influnced by the rate of freezing and glycerol level. Mol. Reprod. Dev. 34, 190-195.

상세보기
Gao, D. and Critser, J. K. 2000. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41, 187-196.

상세보기
Jeulin, C., Soufir, J. C., Weber, P., Laval-Martin, D. and Calvayrac, R. 1989. Catalase activity in human spermatozoa and seminal plasma. Gamete Res. 24, 185-196.

상세보기
Kim, C. J., Lee, H., Kim, H. J., Kee, S. H. and Park, C. S. 2002. Effect of packing materials of frozen boar semen on sperm characteristics and reproductive performance. Kor. J. Ani. Rep. 26, 119-124.
Kim, E. K., Kim, J. W. and Kim, H. W. 2003. Effect of cryopreservation by slow and rapid freezing on the sperm motility Index, viability and morphology of post-thaw human spermatozoa. Kor. J. Emb. Trans. 18, 43-50.
Kim, K. S. and Song, H. B. 2005. Studies on the freezing of boar semen in vitro and in vivo fertilization capacity of frozen boar spermatozoa. Kor. J. Emb. Trans. 20, 1-8.
Knox, R. V. 2016. Artificial insemination in pigs today. Theriogenology 85, 83-93.

상세보기
Larson, J. L. and Miller, D. J. 1999. Simple histochemical stain for acrosomes on sperm from several species. Mol. Reprod. Dev. 52, 445-449.

상세보기
Mazur, P., Leibo, S. P. and Chu, E. H. 1972. A two-factor hypothesis of freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells. Exp. Cell Res. 71, 345-355.

상세보기
Mazur, P. and Cole, K. W. 1985. Influence of cell concentration on the contribution of unfrozen fraction and salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes. Cryobiology 22, 509-536.

상세보기
McLaughlin, E. A., Ford, W. C. L. and Hull, M. G. R. 1993. Effects of cryopreservaion on the human sperm acrosome and its response to A23187. J. Reprod. Fertil. 99, 71-76.

상세보기
Pickett, B. W. and Berndtson, W. E. 1974. Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: a review. J. Dairy Sci. 57, 1287-1301.

상세보기
Pursel, V. V. and Johnson, L. A. 1975. Freezing of boar spermatozoa: Fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure. J. Anim. Sci. 40, 99-102.

상세보기
Pursel, V. G. and Park., C. S. 1987. Duration of thawing on post thaw acrosome morphology and motility of boar spermatozoa frozen in 5 ml maxi-straws. Theriogenology 28, 683-690.

상세보기
Rodriguez-Gil, J. E. and Estrada, E. 2013. Artificial insemination in boar reproduction. In S. Bonet, I. Casas, W. V. Holt, & M. Yeste (Eds.), Boar reproduction. pp. 589-608. Berlin: Springer.
Saravia, F., Wallgren, M., Nagy, S., Johannisson, A. and Rodriguez-Martinez, H. 2005. Deep freezing of concentrated boar semen for intra-uterine insemination: effects on sperm viability. Theriogenology 63, 1320-1333.

상세보기
Sherman, J. 1990. Cryopreservation of human semen, in Handbook of the Laboratory Diagnosis and Treatment of Infertility, B. Keel and B. W. Webster, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla, USA. pp. 229.
Watson, P. F. 1990. Artificial insemination and the preservation of semen, In: Lamming G (ed). Marshall's Physiology of Reproduction vol. 2 Churchill Livingstone, Edinburgh, London, pp.747-869.
Westendorf, P., Richter, L. and Treu, H. 1975. Zur Tiefgefrierung von Ebersperma. Labor-und Besamungsergeb nisse mit dem Hulsnberger pailetten-Verfahren. Dtsch. Tierarzt Wschr. 82, 261-267.
Yeste, M., Estrada, E., Casas, I., Bonet, S. and Rodriguez-Gil, J. E. 2013. Good and bad freezability boar ejaculates differ in the integrity of nucleoprotein structure after freeze-thawing but not in ROS levels. Theriogenology 79, 929-939.

상세보기
Yeste, M., Rodriguez-Gil, J. E. and Bonet, S. 2017. Artificial insemination with frozen-thawed boar sperm. Mol. Reprod. Dev. 84, 802-813.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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