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문제 정의
- 본 연구는 복합생균제(L. plantarum, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae)를 0%(CON, 대조군), 0.25%(PC1) 및 0.5%(PC2)수준으로 급여하여 육계의 생산성, 장기 무게, 혈액 생화학적성상 및 면역지표, 소화효소 활성도, 분의 미생물 군락 및 유해가스 발생에 미치는 영향을 조사하기 위해 실시되었다. 복합생균제 급여는 체중 등과 같은 생산성에는 유의적 영향을미치지 않았다.
제안 방법
- 최종 분해산물인 glucose는 Sigma glucose assay kit로서 450 nm에서 측정하였다. Leucine aminopeptidase(LAP) 활성도는 Gal-Garber and Uni(2000)의 방법을 변형한 것으로 leucine p-nitroaniline를 기질로 사용하여 ELISA reader를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 각 조직의 단백질 분석은 BCA 방법(Pierce BCA protein, Assay Kit 23225)으로 570 nm 에서 ELISA reader로서 측정하였다.
- subtilis는 Tryptic Soy Broth(Difco, Lab, USA)에서 24시간 배양(37℃)한 후 생성된 집락을 조사하여 log10로 전환하였다. Saccharomyces cerevisiae는 YPD 배지를 이용하여 24시간 배양 후 생성된 집락의 숫자를 log10로 전환하여 cfu를 계산하였다. E.
- 소장은 십이지장에서 결장부위까지 전체를 채취하여 길이를 측정하였다. 그 후 소장 전반부(십이지장-맹낭부위)를 절개한 후 생리식염수로 3회 연속으로 세척하여 내용물을 제거하고 grass slide를 이용하여 점막세포를 분리하였다. 다시 일정량의 생리식염수를 혼합하여 5,000 rpm에서 원심분리(Vision, VS-15,000 CF)하여 점막세포를 세척하고, 무게를 측정한 후 –70℃에서 냉동 보관하였다.
- 냉동 보관된 분 1 g을 멸균 생리식염수에 현탁하여 homogenizer로 균질화시킨 후 희석하여 생균수 측정용 시료로 사용하였다. 시료는 멸균수로서 10배씩 연속적 희석방법(ten-fold serial dilution method)으로 내용물 1 g에 함유된 균의 집락수를 colony forming unit(cfu)로 계산하였다.
- 따라서 본 연구는 L. plantarum, B. subtilis 및 Saccharomyces cerevisiae 등이 함유된 복합생균제를 육계에 수준별(0%, 0.25% 및 0.5%)로 급여 시 생산성, 소화효소 활성도, 혈액생화학성분과 면역지표, 분중의 미생물 균총과 유해가스 발생에 미치는 영향을 조사하였다.
- SH) 가스 농도를 측정하기 위해 시험군당 8 반복으로 200 g씩 수거하여 진공 폴리비닐 봉지(Tedlar bag, 2 L)에 밀폐하였다. 밀폐 후 24시간동안 37℃에서 배양기에서 배양을 시킨 후 가스포집기(Gastec GV-100S, Japan)를 이용하여 테드라 백의 콕을 통해 1분간 흡입하여 H2S 및 mercaptane 가스 농도를 각각 측정하였다.
- subtilis 및 Saccharomyces cerevisiae 등이 106 cfu kg—1 이상 함유된 복합생균제(D&A, Haman, Korea)를 사용하였다. 사양관리 방법으로서 닭이 충분히 먹을 수 있는 사료를 자유급이하고, 음수는 자동 급수기로서 급여하였다. 점등관리는 시험 동안 23시간 점등하고, 계사 온도는 33℃에서 22℃까지 육계 사육실 온도관리 프로그램에 따라 조절하였다.
- 사양시험 28일째 육계가 일정 기간(12시간) 배설한 분중황화수소(H2S) 및 mercapane(CH3SH) 가스 농도를 측정하기 위해 시험군당 8 반복으로 200 g씩 수거하여 진공 폴리비닐 봉지(Tedlar bag, 2 L)에 밀폐하였다. 밀폐 후 24시간동안 37℃에서 배양기에서 배양을 시킨 후 가스포집기(Gastec GV-100S, Japan)를 이용하여 테드라 백의 콕을 통해 1분간 흡입하여 H2S 및 mercaptane 가스 농도를 각각 측정하였다.
- 사양시험 종료 후 처리군당 평균 체중에 가까운 6∼8수를 선발하여 체중을 측정하고 에테르 마취 후 경정맥을 절개하여 sodium heparin이 함유된 진공 시험관에 채혈하였다.
- 시료는 멸균수로서 10배씩 연속적 희석방법(ten-fold serial dilution method)으로 내용물 1 g에 함유된 균의 집락수를 colony forming unit(cfu)로 계산하였다. 선택한 배지 및 배양조건으로서 Lactobacilli는 MRS agar(DIFCO, KS, USA)를 이용하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 집락 숫자를 log10로 전환하여 cfu를 계산하였다. B.
- 4)를 적정비율로 혼합하여 grind homogenizer로서 1분간 균질화 하였다. 소장 점막세포막의 효소를 분리하기 위해 2% triton X-100을 혼합한 조직을 실온에서 1시간 방치한 후 4℃, 5,000rpm에서 원심분리한 상청액에서 효소활성도를 측정하였다. 이당류 소화효소인 maltase와 sucrase 활성도는 Dahlgvist(1968)의 방법을 변형하여 ELISA reader를 이용하여 분석하였다.
- 소장은 십이지장에서 결장부위까지 전체를 채취하여 길이를 측정하였다. 그 후 소장 전반부(십이지장-맹낭부위)를 절개한 후 생리식염수로 3회 연속으로 세척하여 내용물을 제거하고 grass slide를 이용하여 점막세포를 분리하였다.
- Ross종(308)을 구입하여 3일 동안 케이지 사육환경에 적응시키고, 4일령에 개체별 체중을 측정하여 평균 체중에 가까운 216수를 선별하여 실험에 공시하였다. 시험군은 대조군(CON), 복합생균제 0.25%(PC1) 및 복합생균제 0.5%(PC2)등 3군으로 각 처리군 당 72수를 9 반복(8수/케이지)으로 완전임의 배치하였다. 시험 기간은 4일령부터 35일령까지 총31일 동안 케이지 사육하였다.
- 소장 점막세포막의 효소를 분리하기 위해 2% triton X-100을 혼합한 조직을 실온에서 1시간 방치한 후 4℃, 5,000rpm에서 원심분리한 상청액에서 효소활성도를 측정하였다. 이당류 소화효소인 maltase와 sucrase 활성도는 Dahlgvist(1968)의 방법을 변형하여 ELISA reader를 이용하여 분석하였다. 최종 분해산물인 glucose는 Sigma glucose assay kit로서 450 nm에서 측정하였다.
- 이어서 복강을 절개하여 간, 소장, 비장 등을 채취하여 무게를 측정하고 —70℃에 분석 시까지 보관하였다.
- 사양관리 방법으로서 닭이 충분히 먹을 수 있는 사료를 자유급이하고, 음수는 자동 급수기로서 급여하였다. 점등관리는 시험 동안 23시간 점등하고, 계사 온도는 33℃에서 22℃까지 육계 사육실 온도관리 프로그램에 따라 조절하였다. 체중은 0, 3, 21 및 35일령, 사료 섭취량은 21일령 및 35일령에 조사하여 증체량과 사료요구율을 계산하였다.
- 각 조직의 단백질 분석은 BCA 방법(Pierce BCA protein, Assay Kit 23225)으로 570 nm 에서 ELISA reader로서 측정하였다. 조사한 모든 효소의 특이적 활성도(specific activity)는 전체 활성도에서 단백질 mg당 농도로 나누어 표시하였다.
- 점등관리는 시험 동안 23시간 점등하고, 계사 온도는 33℃에서 22℃까지 육계 사육실 온도관리 프로그램에 따라 조절하였다. 체중은 0, 3, 21 및 35일령, 사료 섭취량은 21일령 및 35일령에 조사하여 증체량과 사료요구율을 계산하였다. 기타 사양 관리는 경남과학기술대학교 동물사육장의 사양관리방법에 준하여 실시되었다.
- 혈중 생화학성분 중 glucose, total protein, triglyceride, total cholesterol, aspartate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT) 등은 자동혈액생화학분석기(Mindray, BS-120, Mindry Bio Medical Electronics Co., Shnzhen, China)로서 분석하였다. 혈청과 소장점막에서 분비형 면역글로불린 A(sIgA)분석은 Chicken IgA(Abcam, ab Cat No.
- , Shnzhen, China)로서 분석하였다. 혈청과 소장점막에서 분비형 면역글로불린 A(sIgA)분석은 Chicken IgA(Abcam, ab Cat No. 157691 ELISA Sandwitch quantitative assay kit)를 이용하여 실시되었다. 소장 점막세포는 조직 1 g을 PBS 4 mL를 넣고 grind homo- genizer로서 1분간 동안 균질화한 후 5,000 rpm에서 10분간 원심분리한 상청액을 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- Ross종(308)을 구입하여 3일 동안 케이지 사육환경에 적응시키고, 4일령에 개체별 체중을 측정하여 평균 체중에 가까운 216수를 선별하여 실험에 공시하였다. 시험군은 대조군(CON), 복합생균제 0.
- 5%(PC2)등 3군으로 각 처리군 당 72수를 9 반복(8수/케이지)으로 완전임의 배치하였다. 시험 기간은 4일령부터 35일령까지 총31일 동안 케이지 사육하였다. 시험사료는 한국가축사양표준(가금, 2012)에 기초하여 옥수수, 대두박 위주로 배합한 것으로 육계 전기사료(4∼10일령), 중기(11∼21일령) 및 후기(22∼35일령)로 구분하여 복합생균제를 시험설계의 비율(%)에 따라 혼합하였다(Table 1).
- 시험사료는 한국가축사양표준(가금, 2012)에 기초하여 옥수수, 대두박 위주로 배합한 것으로 육계 전기사료(4∼10일령), 중기(11∼21일령) 및 후기(22∼35일령)로 구분하여 복합생균제를 시험설계의 비율(%)에 따라 혼합하였다(Table 1).
- 시험에 사용된 생균제는 L. plantarium, B. subtilis 및 Saccharomyces cerevisiae 등이 106 cfu kg—1 이상 함유된 복합생균제(D&A, Haman, Korea)를 사용하였다.
데이터처리
- 모든 자료는 평균±표준편차로 표기하였다.
- 복합생균제 급여에 따른 육계 생산성, 혈액 생화학성분과 면역 지표, 소화효소 활성도, 미생물 총균수(cfu) 및 가스 발생량은 SAS package program(SAS, 2004)을 이용하여 General Linear Model(GLM) Procedure에 따라 유의성을 검정하고, 유의차가 인정될 때 Tukey 방법에 따른 95% 수준에서 다중검정을 실시하였다. 모든 자료는 평균±표준편차로 표기하였다.
이론/모형
- Leucine aminopeptidase(LAP) 활성도는 Gal-Garber and Uni(2000)의 방법을 변형한 것으로 leucine p-nitroaniline를 기질로 사용하여 ELISA reader를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 각 조직의 단백질 분석은 BCA 방법(Pierce BCA protein, Assay Kit 23225)으로 570 nm 에서 ELISA reader로서 측정하였다. 조사한 모든 효소의 특이적 활성도(specific activity)는 전체 활성도에서 단백질 mg당 농도로 나누어 표시하였다.
- 냉동 보관된 분 1 g을 멸균 생리식염수에 현탁하여 homogenizer로 균질화시킨 후 희석하여 생균수 측정용 시료로 사용하였다. 시료는 멸균수로서 10배씩 연속적 희석방법(ten-fold serial dilution method)으로 내용물 1 g에 함유된 균의 집락수를 colony forming unit(cfu)로 계산하였다. 선택한 배지 및 배양조건으로서 Lactobacilli는 MRS agar(DIFCO, KS, USA)를 이용하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 집락 숫자를 log10로 전환하여 cfu를 계산하였다.
- 친염증 사이토카인으로 Chicken IL-1β(R&D System, Cat: NO MBS 454453)는 ELISA Sandwitch quantitative assay kit 방법으로 분석하였다.
성능/효과
- Lactobacillus 및 Saccharomyces cerevisiae는 복합생균제 0.5% 급여 시 대조군보다 이들 미생물군의 cfu 값이 현저히(P<0.05) 증가하는 것으로 관찰되었다.
- 간과 흉선 무게는 복합생균제 급여에 따른 영향이 없었으나, 소장 점막세포 무게는 PC1군에서 유의하게(P<0.05) 증가하였다.
- 05) 감소하였으며, 메틸메르캅탄(CH3SH) 발생량 역시 50% 수준으로 낮았다. 결론적으로 복합생균제 급여(0.25% 및 0.5%)는 육계의 생산성에는 영향을 미치지 않았지만 0.5% 수준으로 급여할 경우 소장 점막세포의 sIgA 증가와 유익 미생물 균총의 증식을 유도하여 분의 유해가스 발생을 감소시키는 것으로 나타났다.
- 결론적으로 본 연구는 복합생균제 급여(0.25∼0.5%)에 따라 육계의 생산성에는 영향을 미치지 않았지만, 소장 점막세포에서 체액성 면역작용을 증강하고 유익균 증식과 유해균의 억제작용이 나타났다.
- 또한, E. coli cfu 값은 복합생균제 0.5% 급여군에서 유의하게(P<0.05) 감소하여 복합생균제 급여가 유해 미생물의 번식을 억제하는 기능이 있는 것으로 보인다.
- 또한, 간 기능 수치는 나타내는 AST 및 ALT 지표 역시 정상 수준으로 0.25∼0.5% 복합생균제 급여는 육계의 간 조직에 부정적인 영향이 없는 것으로 나타났다.
- 또한, 간 기능을 나타내는 AST 및 ALT 등과 같은 혈액 생화학적 지표 역시 정상 수준으로 0.25∼0.5% 복합생균제 급여는 육계의 간 조직에 부정적인 영향이 없는 것으로 나타났다.
- 혈액과 소장 점막세포의 IL-1β 수준은 복합생균제 급여에 따른 차이가 없었다. 또한, 복합생균제 급여가 소장 점막세포의 maltase, sucrase 및 leucine aminopeptidase 활성도에는 영향을 미치지 않았다. 한편 Lactobacillus 및 Saccharomyces cerevisiae cfu 수준은 복합생균제 0.
- 3). 메틸메르캅탄 발생량은 샘플간 변이가 커서 유의적 차이는 없었지만, 복합생균제 급여 시 대조군의 약 50% 수준으로 낮게 발생되는 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 복합생균제 0.5% 급여 시 분에서 황화수소(H2S) 발생량은 유의하게(P<0.05) 감소하였으며, 메틸메르캅탄(CH3SH) 발생량 역시 50% 수준으로 낮았다.
- 복합생균제 급여에 따른 육계의 장기 무게를 조사한 결과(Table 3), 간, 췌장과 비장의 무게는 차이가 없어 생균제 급여(0.25∼0.5%)가 이들 장기의 무게에는 영향을 미치지 않았다.
- 복합생균제 급여에 따른 육계의 혈액에서 albumin, total protein, cholesterol, glucose 등과 같은 생화학성분은 대조군과 생균제 급여군(PC1 및 PC2) 모두 비슷한 수치를 보였다(Table 4). 또한, 간 기능을 나타내는 AST 및 ALT 등과 같은 혈액 생화학적 지표 역시 정상 수준으로 0.
- , 2016). 본 시험에서 복합생균제 급여 시 육계의 증체와 사료이용성 등 생산성에는 유의적 차이가 없었다. 이러한 결과는 생균제 급여가 육계의 성장 및 사료 이용성이 개선되지 않았다는 연구 결과들(Awad et al.
- acidophilus와 casei등을 육계에게 급여 시 IgA 수준이 증가되는 것으로 보고하였다. 본 연구결과 복합생균제(L. plantarium, B. subtilis 및 Saccharomyces cerevisiae) 급여 시에도 소장점막세포의 sIgA수준이 증가되는 것으로 나타났다. 따라서 생균제 균종에 따라 다소 차이는 있지만 생균제 급여는 소장에서 체액성 면역 활성에 긍정적인 작용을 하는 것으로 판단된다.
- 본 연구는 생균제 급여에 따라 혈중 생화학성분은 차이가 없는 것으로 나타났다. Park et al.
- 본 연구에서 복합생균제 급여 시 소장과 혈액에서 친염증 사이토카인(IL-1β)에는 변화가 없었으나, 점막세포에서 면역항체(sIgA) 수준은 현저히 증가되었다.
- (1998)은 유산균 급여 시 육계의 맹장에서 맹장의 Lactobacilli 균총은 유의적 차이가 없었지만 coliform 균총은 현저히 감소하였다고 보고하였다. 본 연구에서는 생균제 급여에 따라 분중의 E. coli는 감소하고 Lactobacilli 균총은 현저히 증가하였으나, 소장 점막세포에 존재하는 maltase, sucrase 및 leucine aminopeptidase 활성도에서는 차이를 보이지 않았다.
- 2% 수준의 생균제 첨가 시 NH3와 H2S의 발생량이 현저히 감소되어 유해가스의 생성을 억제할 수 있음을 보고하였다. 본 연구에서도 생균제 0.5% 첨가군에서 H2S 발생 수준이 유의적으로 감소(69%)하고 메르캅탄 농도가 약 50% 감소하는 효과가 나타나 특히 사육조건이 열악한 농장에서 생균제를 급여할 경우 축분의 냄새를 현저히 감소시킬 수 있을 것으로 판단된다. 육계의 사육환경 조건의 개선은 가축의 에너지 대사작용에도 긍정적 영향을 미처 생산성 개선으로 이어질 수 있다.
- (2009)의 연구에 의하면 생균제 급여 시 비장, F낭 등 면역 장기의 변화는 없었지만, 소장의 무게가 증가하고, 흡수 세포의 융모(villi)와 음와(crypt) 깊이 비율과 융모 길이가 증가하여 소장의 건강에 유익한 결과를 보였다. 본 연구에서도 생균제급여 시 비장, F-낭 등 면역 장기의 변화는 없었지만 0.25% 급여군에서 대조군에 비해 점막세포의 무게가 증가하는 것으로 나타났다. 한편, Pourakbari et al.
- 분비형 면역글로불린 A(sIgA) 수준은 PC2군에서 대조군과 비교해 소장 점막세포에서 유의하게(P<0.05) 증가하였으며, 혈액에서도 PC2군에서 대조군보다 약 20% 증가하는경향을 보였다.
- 분에서 생성되는 유해가스(H2S 및 CH3SH) 농도를 살펴보면 복합생균제 0.5% 급여군(PC2)에서 황화수소의 발생량은 유의하게(P<0.05) 감소하는 것으로 분석되었다(Fig. 3).
- 이러한 결과로 보면 복합생균제 0.5% 수준의 급여는 소장점막세포에서 sIgA 분비량을 증가시켜 체액성 면역작용을 향상시키는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과로 보아 0.25∼0.5% 수준의 복합생균제 급여 시 통계적으로 육계의 생산성에는 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 전 사육 기간(4∼35일령)의 사양 성적을 살펴보면 대조군과 복합생균제 급여군 간에 체중 및 사료 요구율 등에서 유의적 차이가 없었지만 0.5% 복합생균제 급여군(PC2)에서 증체(1.7%)와 사료요구율(1.5%)이 다소 개선되는 효과를 보였다.
- 한편 Lactobacillus 및 Saccharomyces cerevisiae cfu 수준은 복합생균제 0.5% 급여군에서 대조군보다 유의하게(P<0.05) 증가하였고, E. coli cfu값은 감소하였다(P<0.05).
- 2에 각각 나타난 바와 같다. 혈액에서 sIgA 수준은 복합생균제 급여에 따른 통계적 차이는 변화는 없었으나, 급여수준에 따라 sIgA은 증가하는 경향을 보였다. 소장 점막세포에서 sIgA 수준은 PC2군에서 대조군보다 유의하게(P<0.
후속연구
- 5%)에 따라 육계의 생산성에는 영향을 미치지 않았지만, 소장 점막세포에서 체액성 면역작용을 증강하고 유익균 증식과 유해균의 억제작용이 나타났다. 또한, 분중의 유해가스 발생을 억제하여 환경친화형 축산에서 생균제가 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 판단된다.
- subtilis가 유산균의 성장에 큰 영향을 미치는 사실을 증명하였다. 이와 같은 연구결과들로 보아 단일 종류의 생균제보다는 효과가 검증된 다양한 종류의 복합생균제를 육계에게 급여할 경우, 보다 안정적인 효과는 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
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