[논문]Colletotrichum fioriniae에 의한 호박 과실 탄저병의 발생 보고

김준영; 김병섭

doi:10.5423/rpd.2020.26.3.190

Colletotrichum fioriniae에 의한 호박 과실 탄저병의 발생 보고
First Report of Colletotrichum fioriniae Causing Anthracnose on Fruit of Pumpkin (Cucurbita moschata) in Korea 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.26 no.3, 2020년, pp.190 - 193

김준영 (강릉원주대학교 식물생명과학과) , 김병섭 (강릉원주대학교 식물생명과학과)

초록
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강원도 강릉시 사천면 비닐하우스에서 재배중인 호박 과실에 탄저병이 발생하였다. 병든 호박 과실에 분홍색의 분생포자 층이 동심원으로 나타나 점차 확대되어 과실이 무르는 증상을 나타내었다. 원인균을 규명하기 위하여 순수 분리 후 균학적 특성 및 ITS, GAPDH, CHS-1, HIS3, ACT, TUB2 염기서열 분석결과 Colletotrichum fioriniae로 동정하였다. 또한, 병원성이 확인되었고 접종시험에서 동일한 균이 반복적으로 분리되었다. 따라서, 이러한 결과를 바탕으로 C. fioriniae에 의한 호박 과실에 발생하는 탄저병의 발생을 국내 처음으로 보고한다.

Abstract ▼ AI-Helper

In 2014, Anthracnose symptoms were observed on fruit of pumpkin in Gangneung, Gangwon in Korea. The typical symptoms on fruit surfaces were circular lesions, brown, shriveled with salmon-colored spore masses on the spots. A fungal isolate was obtained from symptomatic on fruit and cultured on potato dextrose agar at 25℃. The color of the upper surface of the colony varied from white to gray with occurrence of salmon-colored conidial masses and was red to violet on the underside. The causal fungus of anthracnose isolated from the diseased fruits was identified as Colletotrichum fioriniae based on mycological characteristics and sequences of the internal transcribed spacer, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, chitin synthase-1 gene, histone H3, actin gene, beta-tubulin gene region. Pathogenicity tests of the isolate were performed on pumpkin fruit by both wound and non-wound inoculation with conidial suspension (1×106 conidia/ml) and incubated at 25℃. Lesions were observed on both wounded and non-wounded fruit of pumpkin after 7 days inoculation in only C. fioriniae. The pathogen was re-isolated from the lesions of inoculated fruits. To our knowledge, this is the first report of anthracnose on fruit of pumpkin caused by C. fioriniae in Korea.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Symptoms of anthracnose on fruit of pumpkin caused by Colletotrichum fioriniae. (A) Naturally occurred symptom. (B) Closeup of infected fruit surface. (C) Symptoms on an artificially inoculated fruit.
표 Table 1. Comparison of mycological characteristic of present fungus isolated from fruit of pumpkin
그림 Fig. 2. Morphological characteristics of Colletotrichum fioriniae isolated from fruit of pumpkin. (A) Upper surface of colony incubated on potato dextrose agar (PDA). (B) Underside surface on PDA. (C) Conidia. (D, E) Appressoria. Scale bars=20 μm (C), 10 μm (D, E).
그림 Fig. 3. Phylogenetic tree inferred from maximum likelihood analysis derived from sequence of combined multi-locus gene (ITS, GAPDH, CHS-1, HIS3, ACT, and TUB2) of Colletotrichum fioriniae and those of other Colletotrichum spp. The numbers above the nodes are supporting percentages by 1,000 bootstrap replicates.

AI 본문요약
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문제 정의

fioriniae에 의한 호박 과실 탄저병은 아직까지 보고된 바 없다. 따라서 본 연구는 국내에서 처음으로 C. fioriniae에 의한 호박 과실 탄저병의 발생을 보고하고자 한다.
또한, 병원성이 확인되었고 접종시험에서 동일한 균이 반복적으로 분리되었다. 따라서, 이러한 결과를 바탕으로 C. fioriniae에 의한 호박 과실에 발생하는 탄저병의 발생을 국내 처음으로 보고한다.

제안 방법

Ltd.(Seoul, Korea)에 의뢰하였고, SeqMan(DNASTAR, Madison, WI, USA)과 CLUSTRAL W을 이용하여 정렬하였다. 분석된 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) BLAST search를 통하여 상동성을 비교 결과, ACT 영역에서 C.
PCR를 수행하기 위해 internal transcribed spacers and intervening 5.8S rDNA(ITS), partial glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), partial chitin synthase-1 gene(CHS-1), partial histone H3(HIS3), partial actin gene(ACT), partial β-tubulin gene(TUB2) 영역을 증폭하였다.
KT728897, MT978180, KT728900, MT978181, KT728898, KT728899). 계통수를 작성하기 위해 분석된 염기서열의 ITS, GAPDH, CHS-1, HIS3, ACT, TUB2 각각의 영역을 연결하여, MEGA 7을 이용하여 maximum likelihood 방법으로 작성 하였고, 1,000회 bootstrap을 수행하였다. Reference sequence 로는 C.
대표균주를 potato dextrose broth 배지에서 25ºC에서 5일간 180 rpm으로 배양한 후, 균체를 걸러 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 genomic DNA를 획득하였다.
1A, B). 병든 과실로부터 원인균을 규명하기 위해 순수 분리를 하여 균주를 획득하였다. 병원균의 균학적 특성, 병원성 검정, 염기서열 분석을 통해 호박 과실 탄저병의 원인균을 규명하였다.
병든 과실로부터 원인균을 규명하기 위해 순수 분리를 하여 균주를 획득하였다. 병원균의 균학적 특성, 병원성 검정, 염기서열 분석을 통해 호박 과실 탄저병의 원인균을 규명하였다.
0×10⁶ conidia/ml로 조정하여 현탁액을 제조하였다. 병원성 검정을 위하여 신선한 호박 과실을 70% 에탄올과 1% NaOCl을 이용하여 표면 살균하였고, 멸균수를 이용하여 2회 씻은 후 건조하여 사용하였다. 접종 방법은 멸균된 needle을 이용하여 상처를 유도한 방법과 상처를 내지 않은 방법을 이용하였으며, 병원균 포자 현탁액을 각각의 처리구에 10 µl씩 pipetting하였고, 무처리구에는 멸균수를 이용하여 같은 방법으로 접종하여 고습도 습실상(95% relative humidity, 25℃)에서 발병을 유도하였다.
분리된 대표균주를 PDA 배지에 치상하여 25ºC에서 10일 동안 배양 후, 형성된 포자를 수확하여 멸균수를 이용하여 1.0×106 conidia/ml로 조정하여 현탁액을 제조하였다.
접종 방법은 멸균된 needle을 이용하여 상처를 유도한 방법과 상처를 내지 않은 방법을 이용하였으며, 병원균 포자 현탁액을 각각의 처리구에 10 µl씩 pipetting하였고, 무처리구에는 멸균수를 이용하여 같은 방법으로 접종하여 고습도 습실상(95% relative humidity, 25℃)에서 발병을 유도하였다.
병원균의 균학적 특성. 탄저병 증상을 보이는 호박 과실로 부터 분리된 대표균주를 균학적 및 형태학적 특징을 관찰하기 위해서 PDA 배지에 25^oC에서 10일간 배양하였다. PDA 배지상에서의 균총은 하얀색에서 회백색을 띠었고, 오렌지색의 분생포자층을 형성하였다.
계통학적 유연관계 분석. 호박 과실로부터 분리된 대표 균주의 형태적 특성을 바탕으로 명확한 종 동정을 위해 염기서열 분석을 수행하였다. 대표균주를 potato dextrose broth 배지에서 25ºC에서 5일간 180 rpm으로 배양한 후, 균체를 걸러 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 genomic DNA를 획득하였다.

대상 데이터

ITS 영역은 ITS 1/ITS 4(White 등, 1990), GAPDH 영역은 GDF/ GDR(Templeton 등, 1992), CHS-1 영역은 CHS-354R/CHS-79F(Carbone과 Kohn, 1999), HIS3 영역은 CYLH3F/CYLH3R(Crous 등, 2004), ACT 영역은 ACT-512F/ACT-783R(Carbone과 Kohn, 1999), TUB2 영역은 T1/Bt2b(O’Donnell과 Cigelnik, 1997; Glass and Donaldson, 1995) 프라이머를 사용하였다.
계통수를 작성하기 위해 분석된 염기서열의 ITS, GAPDH, CHS-1, HIS3, ACT, TUB2 각각의 영역을 연결하여, MEGA 7을 이용하여 maximum likelihood 방법으로 작성 하였고, 1,000회 bootstrap을 수행하였다. Reference sequence 로는 C. acutatum의 종 복합체인 C. scovillei, C. nymphaeae, C. simmondsii, C. lupine, C. melonis, C. fioriniae, C. acutatum, C. acerbum, C. salicis, C. godetiae, C. pyricola 균주와 outgroup으로는 C. truncatum, C. gloeosporioides을 사용하였다. 계통수 분석 결과, 대표균주 KACC47696은 C.
fioriniae 균주와 100%일치하였다(KY695261, MN895544, MN974140, JQ949284, AB744086). 대표 균주는 NCBI GenBank에 등록하였다(accession nos. KT728897, MT978180, KT728900, MT978181, KT728898, KT728899). 계통수를 작성하기 위해 분석된 염기서열의 ITS, GAPDH, CHS-1, HIS3, ACT, TUB2 각각의 영역을 연결하여, MEGA 7을 이용하여 maximum likelihood 방법으로 작성 하였고, 1,000회 bootstrap을 수행하였다.

이론/모형

호박 과실에 발달된 탄저병의 분생포자층을 멸균된 백금이를 이용하여 1 loop 취한 후, streptomycin(100 µg/ml)이 함유된 potato dextrose agar(PDA) 배지에 획선평판법(streaking plate) 방법을 이용하여 단포자를 분리하였다.

성능/효과

gloeosporioides을 사용하였다. 계통수 분석 결과, 대표균주 KACC47696은 C. acutatum의 종 복합체 clade에 속하였으며, C. fioriniae(CBS127600)와 묶여 다른 종들과 명확하게 구분되었다(Fig. 3.)
원인균을 규명하기 위하여 순수 분리 후 균학적 특성 및 ITS, GAPDH, CHS-1, HIS3, ACT, TUB2 염기서열 분석결과 Colletotrichum fioriniae로 동정하였다. 또한, 병원성이 확인되었고 접종시험에서 동일한 균이 반복적으로 분리되었다. 따라서, 이러한 결과를 바탕으로 C.
(Seoul, Korea)에 의뢰하였고, SeqMan(DNASTAR, Madison, WI, USA)과 CLUSTRAL W을 이용하여 정렬하였다. 분석된 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) BLAST search를 통하여 상동성을 비교 결과, ACT 영역에서 C. fioriniae 균주와 99% 이상 일치하였고(LC516662), 나머지 영역에서는 C. fioriniae 균주와 100%일치하였다(KY695261, MN895544, MN974140, JQ949284, AB744086). 대표 균주는 NCBI GenBank에 등록하였다(accession nos.
병든 호박 과실에 분홍색의 분생포자층이 동심원으로 나타나 점차 확대되어 과실이 무르는 증상을 나타내었다. 원인균을 규명하기 위하여 순수 분리 후 균학적 특성 및 ITS, GAPDH, CHS-1, HIS3, ACT, TUB2 염기서열 분석결과 Colletotrichum fioriniae로 동정하였다. 또한, 병원성이 확인되었고 접종시험에서 동일한 균이 반복적으로 분리되었다.
2014년 강원도 강릉시 사천면 시설하우스에서 재배중인 호박 과실에 탄저병 증상이 처음으로 관찰되었다. 호박 과실에 발병한 탄저병은 기존에 보고된 C. orbiculare에 의한 탄저병과 차이가 있었으며, 과실에 분홍색의 분생포자층이 동심원을 그리면서 진전됨에 따라 병반이 확대되어 결국 과실이 무르는 증상이 나타났다(Fig. 1A, B). 병든 과실로부터 원인균을 규명하기 위해 순수 분리를 하여 균주를 획득하였다.

참고문헌 (15)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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