[논문]미백성 Tyrsoinase 저해물질 생산 비병원성 야생효모 Saccharomyces cerevisiae WJSL0191와 Papiliotrema laurentii ON30의 균학적 특성과 Tyrosinase 저해물질의 생산

김지윤; 이종수

doi:10.4489/kjm.20200028

미백성 Tyrsoinase 저해물질 생산 비병원성 야생효모 Saccharomyces cerevisiae WJSL0191와 Papiliotrema laurentii ON30의 균학적 특성과 Tyrosinase 저해물질의 생산
Microbiological Characteristics of Whitening Tyrosinase Inhibitor-producing Wild Yeasts, Saccharomyces cerevisiae WJSL0191 and Papiliotrema laurentii ON30 and Production 원문보기

한국균학회지 = The Korean journal of mycology, v.48 no.3, 2020년, pp.285 - 296

김지윤 (배재대학교 바이오의약학부) , 이종수 (배재대학교 바이오의약학부)

초록
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본 연구는 야생효모로부터 미백성 tyrosinase 저해 물질을 생산하여 기능성 화장품 생산에 응용할 목적으로 실시되었다. 이를위해 대전광역시 3대 하천과 충남 금산의 향신료 재배지의 주변 토양들과 부식물 등에서 분리한 비병원성 효모들의 tyrosinase 저해활성을 측정하여 우수 균주들을 선발하여 이들의 균학적 특성과 tyrosinase 저해제 생산 조건을 조사하였다. 먼저 대전시 하천에서 분리한 야생효모들 중에서는 S. cerevisiae WJSL0191의 무세포추출물이 가장높은 33.2%의 tyrosinase 저해활성을 보였고 금산 향신료 재배지에서 분리한 효모중에서는 P. laurentii ON30가 27.3%로 가장 높은 활성을 보여 이들 두효모들을 우수균주들로 최종 선발하였다. 선발균주 모두 자낭포자를 형성하였으나 의균사를 형성하지 않았고 YPD 배지와 비타민을 첨가하지 않은 YPD 배지에서 잘 생육하였다. 특히S. cerevisiae WJSL0191은 20% 포도당을 함유한 YPD 배지와 15% NaC을 함유한 YPD 배지에서 잘 생육하는 내당성과 호염성을 보였다. S. cerevisiae WJSL0191과 P. laurentii ON30의 주름생성 억제에 관련된 elastase 저해 활성은 각각 26.2, 18.6%를 보였고 노화 억제관련 SOD유사활성은 각각 10.2%와 3.7%로 나타내었다. S. cerevisiae WJSL0191의 tyrosinase 저해물질의 최적 생산 조건은 30℃에서 72시간동안 YPD 배지에서 배양하였을 때 최고 96.1%의 저해활성을 보였고, P. laurentii ON30은 YPD 배지로 20℃에서 24시간 배양하였을 때 30.4%의 최고 저해활성을나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The goal of this study and potent whitening tyrosinase inhibitor-producing wild yeasts and further optimiz production of tyrosinase. Among non-pathogenic wild yeasts obtained from soils in Daejeon city and spice field of Geumsan in Chungcheongnam-do, Korea, we selected Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae) WJSL0191 and Papiliotrema laurentii (P. laurentii) ON30 show 33.2% and 27.3% respectively. These selected strains formed and not pseudomycelium. S. cerevisiae WJSL0191 was sugar-tolerant as well as halophilic in 20% glucose-containing yeast (YPD) medium and 15% NaCl-containing YPD medium. S. cerevisiae WJSL0191 and P. laurentii ON30 showed 26.2% and 18.6% anti-wrinkle elastase inhibitory activities, respectively. aximal production of tyrosinase inhibitors obtained when S. cerevisiae WJSL0191 was cultured at 30 for 72h in YPD medium and P. laurentii ON30 was incubated at 20℃ for 24hr.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. Tyrosinase inhibitory activities of non-pathogenic wild yeasts obtained from main riverside soils of Daejeon city, Korea.
표 Table 2. Tyrosinase inhibitory activities of non-pathogenic, wild yeasts obtained from spices feld of Geumsan in Chungcheongnam-do, Korea.
표 Table 3. Microbiological characteristics and anti-aging enzyme activities of the selected tyrosinase inhibitor - producing wild yeasts.
그림 Fig. 1. Phylogenetic tree of the tyrosinase inhibitor – producing wild yeasts, based on the nucleotide sequences of large subunit 26S ribosomal DNA D1/D2 region. The tree was generated by the neighbor-joining method, using MrGA 7. (A) Saccharomyces cerevisiae WJSL0191, (B) Papiliotrema laurentii ON 30. (bold type font; selected yeast)
그림 Fig. 2. Effect of cultural temperature on the tyrosinase inhibitory activities of Saccharomyces cerevisiae WJSL0191(▨) and Papiliotrema laurentii ON30 ( ▭ ).
그림 Fig. 3. Effect of cultural time on the tyrosinase inhibitory activities of Saccharomyces cerevisiae WJSL0191(▨) and Papiliotrema laurentii ON30 (▭).

AI 본문요약
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문제 정의

필자 등은 전보[15]에서 야생화에서 분리한 야생효모들 중 미백활성을 가진 tyrosinase 저해물질을 생산하는 야생효모들을 선발하였으나 활성이 비교적 낮았고 배지조성과 배양방법 등 대량생산을 위한 조건에서 비경제적인 문제점 등이 있었다. 따라서 본 연구에서는 이들의 단점을 보안할 수 있는 새로운 미백성 tyrosinase 저해활성이 우수한 야생효모들을 선별하여 이들을 기능성 화장품 산업에 응용하기 위하여 실시되었다.
본 연구는 야생효모로부터 미백성 tyrosinase 저해 물질을 생산하여 기능성 화장품 생산에 응용할 목적으로 실시되었다. 이를 위해 대전광역시 3대 하천과 충남 금산의 향신료 재배지의 주변 토양들과 부식물 등에서 분리한 비병원성 효모들의 tyrosinase 저해활성을 측정하여 우수 균주들을 선발하여 이들의 균학적 특성과 tyrosinase 저해제 생산 조건을 조사하였다.

제안 방법

Collagenase저해활성; 야생효모 무세포 추출물 시료 50 μL에 4 mM CaCl2를 함유한 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 7.5) 125 μL와 collagenase (0.5 mg·mL) 125 μL를 혼합 후 37℃에 20분 동안 반응 후 6% 구연산용액 200 μL로반응을정지시키고 ethyl acetate 700 μL를 첨가하였다.
Elastase 저해활성; 야생효모 무세포 추출물 시료 50 μL에 0.2 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.0) 150 μL, 4 mM N-Succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide 50 μL 혼합 후 ELISA reader를 이용하여 37℃에서 5분간 반응시킨후 elastase (0.2 unit·mL) 50 μL을첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 410 nm에서 흡광도를 측정하여 아래와 같은 식으로 elastase 저해활성을 계산하였다[19].
SOD 유사 활성; 야생효모 무세포 추출물 285 μL와 24 mM pyrogallol 15 μL를 혼합 후 ELISA reader를 이용하여 420 nm에서 10분 동안 흡광도를 측정한 후 아래와 같은 식으로 SOD 유사활성을 계산하였다.
Tyrosinase 저해활성은 위와 같이 제조한 야생효모 무세포 추출물시료 50 μL에 0.1 M potassium phosphate 완충용액(pH 6.8) 100 μL와 1.5 mM L-tyrosine 50 μL를 혼합 후 37℃에서 ELISA reader를 이용하여 5분간 반응시킨 후 tyrosinase 40U을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 다음 470 nm에서 흡광도를 측정하여 아래와 같은 식으로 tyrosinase 저해활성을 계산하였다[15].
Tyrsoinase 저해물질 생산 우수 야생효모들의 주름생성 억제와 피부 노화관련 생리활성으로 elastase와 collagenase 저해 활성들과 항산화활성, SOD 유사 활성 등을 측정하였다(Table 3).
균학적 특성 위와 같이 Tyrosinase 저해물질 생산 우수 균주로 선발한 야생효모 S. cerevisiae WJSL 0191와 P. laurentii ON30 균주들의 분석된 염기서열을 NCBI에 BLAST하여 유사도를 확인한후, 이를 바탕으로 분자 계통수를 작성하였다. 이때 bootstrap분석은 2,000회 반복으로 수행되었고 MEGA-X [26]를 이용하여 neighbor-joining계통수를 완성하였으며 outgroup균주들로는 각각 Hanseniaspora opuntiae와Trimella monformis들을 사용하였다.
대전광역시 3대 주요하천들과 충남 금산의 향신료 재배지들의 토양과 식물체 부식물 등에서 분리, 동정한 야생효모 중 비병원성 효모들의 미백성 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다.
이를 위해 먼저 대전 주요 하천과 충남 금산의 향신료 재배지역의 토양과 부식물 등에서 분리한 비병원성 야생효모들 중 미백성 tyrosinase 저해활성이 우수한 2종류의 야생효모들을 선별하여 이들의 균학적 특성과 피부노화관련 elastase와 collagenase 저해활성등을 측정하였다. 또한, tyrosinase 저해물질 생산 최적 조건을 조사하였다.
선발균주들의 미생물학적 특성으로 형태학적, 배양학적 특성 등은 일반 미생물 실험방법과 현미경 등을 이용하여 조사하였고[22,23] 당 자화성과 발효성은 yeast nitrogen base를 이용하여 측정하였다.
본 연구는 야생효모로부터 미백성 tyrosinase 저해 물질을 생산하여 기능성 화장품 생산에 응용할 목적으로 실시되었다. 이를 위해 대전광역시 3대 하천과 충남 금산의 향신료 재배지의 주변 토양들과 부식물 등에서 분리한 비병원성 효모들의 tyrosinase 저해활성을 측정하여 우수 균주들을 선발하여 이들의 균학적 특성과 tyrosinase 저해제 생산 조건을 조사하였다. 먼저 대전시 하천에서 분리한 야생효모들 중에서는 S.
이를 위해 먼저 대전 주요 하천과 충남 금산의 향신료 재배지역의 토양과 부식물 등에서 분리한 비병원성 야생효모들 중 미백성 tyrosinase 저해활성이 우수한 2종류의 야생효모들을 선별하여 이들의 균학적 특성과 피부노화관련 elastase와 collagenase 저해활성등을 측정하였다. 또한, tyrosinase 저해물질 생산 최적 조건을 조사하였다.
항산화 활성; 야생효모 무세포 추출물 60 μL에 DPPH(α-dipenyl-β-picrylhydrazyl) 240 μL 혼합한 후 ELISA reader를 이용하여 525 nm에서 10분 동안 흡광도를 측정한 후아래와 같은식으로 DPPH 활성을 계산하였다.

대상 데이터

Tyrosinase 저해활성 측정에는 Sigma사(St. Louis, Mo, USA)의 tyrosinase 와 ELISA reader를 사용하였고, 피부 노화 관련 효소활성 실험에는 elastase (돼지 췌장으로부터 생산), collagenase (Clostridium histolyticum으로부터 생산) 등을 사용하였다. 기타, 효소활성 측정과 완충용액 제조 등에는 분석용 특급 시약들을 사용하였다.
Louis, Mo, USA)의 tyrosinase 와 ELISA reader를 사용하였고, 피부 노화 관련 효소활성 실험에는 elastase (돼지 췌장으로부터 생산), collagenase (Clostridium histolyticum으로부터 생산) 등을 사용하였다. 기타, 효소활성 측정과 완충용액 제조 등에는 분석용 특급 시약들을 사용하였다.
대조구는 55 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.2) 285 μL와 pyrogallol 15 μL를 혼합한 것으로하였다[21].
대조구는 99.5% EtOH 60 μL에 DPPH 240 μL를 혼합한 것으로 하였다(20).
3%의 저해활성을 보였으나 나머지 야생효모들은 대부분 15% 미만이거나 활성이 없었다. 따라서 tyrosinase 저해활성이 가장 높은 S. cerevisiae WJSL 0191을 우수 균주로 선발하였다.
7%를 보였다. 따라서 우수균주로 최종 P. laurentii ON30을 선발하였다.
미백성 tyrosinase 저해 물질 생산 우수 효모 선발을 위한 야생효모들은 배재대학교 생물공학연구실에서 대전광역시 3대 하천들과 충남 금산의 향신료 재배지역의 토양과 부식물 등에서 분리, 동정한 비병원성 야생효모들을 사용하였다[16].

이론/모형

Phylogenetic tree of the tyrosinase inhibitor – producing wild yeasts, based on the nucleotide sequences of large subunit 26S ribosomal DNA D1/D2 region. The tree was generated by the neighbor-joining method, using MrGA 7. (A) Saccharomyces cerevisiae WJSL0191, (B) Papiliotrema laurentii ON 30.
laurentii ON30 균주들의 분석된 염기서열을 NCBI에 BLAST하여 유사도를 확인한후, 이를 바탕으로 분자 계통수를 작성하였다. 이때 bootstrap분석은 2,000회 반복으로 수행되었고 MEGA-X [26]를 이용하여 neighbor-joining계통수를 완성하였으며 outgroup균주들로는 각각 Hanseniaspora opuntiae와Trimella monformis들을 사용하였다. 이들 두 균주들의 phylogenetic tree는 Fig.

성능/효과

cerevisiae WJSL0191은 20% 포도당을 함유한 YPD 배지와 15% NaC을 함유한 YPD 배지에서 잘 생육하는 내당성과 호염성을 보였다. S. cerevisiae WJSL0191과 P. laurentii ON30의 주름생성 억제에 관련된 elastase 저해 활성은 각각 26.2, 18.6%를 보였고 노화 억제관련 SOD유사활성은 각각 10.2%와 3.7%로 나타내었다. S.
7%로 나타내었다. S. cerevisiae WJSL0191의 tyrosinase 저해물질의 최적 생산 조건은 30℃에서 72시간동안 YPD 배지에서 배양하였을 때 최고 96.1%의 저해활성을 보였고, P. laurentii ON30은 YPD 배지로 20℃에서 24시간 배양하였을 때 30.4%의 최고 저해활성을 나타내었다.
2). Tyrosinase 저해활성은 S. cerevisiae WJSL0191 균주가 30℃에서 배양하였을 때 34.0%로 가장 높았고 20℃에서도 21%를 보인 반면에 P. laurentii ON30는 20℃에서 가장높았고(32.6%), 30℃ 배양에서는 26%를 보였다. 15℃ 배양에서는 각각 11%와 8.
3과 같다. Tyrosinase 저해활성은 배양시간이 길어짐에 따라 증가하여 균 생육이 대수기 말기인 배양 48시간에 약 63.5%를 보였고 균 생육이 정지기에 들어가는 배양 72시간에 tyrosinase 저해활성이 96.1%로 크게 증가하여 최고 저해활성을 보인 후 배양 96시간에 약간 감소하는 경향이었다.
배양온도의 영향; 위와같이 Tyrosinase 저해활성 우수균주로 최종 선발한S. cerevisiae WJSL0191와 P. laurentii ON 30들을 YPD 배지에 접종하여 15℃에서 40℃까지 일정온도에서 24시간 배양한 후 균 생육과 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 두 균 모두 생육은 20℃와 30℃에서 매우 좋았고 특히 S. cerevisiae WJSL0191는 40℃에서도 비교적 생육이 양호하였다(Fig. 2). Tyrosinase 저해활성은 S.
특히S. cerevisiae WJSL0191은 20% 포도당을 함유한 YPD 배지와 15% NaC을 함유한 YPD 배지에서 잘 생육하는 내당성과 호염성을 보였다. S.
laurentii ON30 들의 tyrosinase 저해물질 생산 조건을 비교한 결과 두 균주 모두 tyrosinase 저해물질 생산에 제일 적합한 배지는 YPD 배지이었고 배양온도는 20℃~30℃에서 제일 좋았다. 그러나 P. laurentii ON30 은 최적 배양시간이 24시간으로 매우 짧은 반면에 tyrosinase 저해활성은 30.4%로 낮았고 S. cerevisiae WJSL0191은 tyrosinase 저해활성이 96.1%로 높은 반면에 배양시간이 72시간으로 비교적 길었다.
대전천 주변 토양에서 분리한 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) WJSL0191 균주의 tyrosinase 저해활성이 33.2%로 분리균주중 가장 높았고 S. cerevisiae WJSL0088 균주도 21.3%의 저해활성을 보였으나 나머지 야생효모들은 대부분 15% 미만이거나 활성이 없었다. 따라서 tyrosinase 저해활성이 가장 높은 S.
6%를 보였다. 또한 SOD 유사활성은 S. cerevisiae WJSL0191이 10.2%를 보였을뿐, collagenase 저해활성과 항산화활성들은 없거나 10% 미만의 낮은활성을 보였다.
또한, P. laurentii ON30의 배양시간에 따른 균 생육과 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 배양 12시간 후 대수기중기부터 tyrosinase 저해활성이 20.6%로 급격히 증가한후 배양 24시간에 30.4%로 최고에 달한 후 48시간까지 점점 낮아지는 경향이었다(Fig. 3).
이를 위해 대전광역시 3대 하천과 충남 금산의 향신료 재배지의 주변 토양들과 부식물 등에서 분리한 비병원성 효모들의 tyrosinase 저해활성을 측정하여 우수 균주들을 선발하여 이들의 균학적 특성과 tyrosinase 저해제 생산 조건을 조사하였다. 먼저 대전시 하천에서 분리한 야생효모들 중에서는 S. cerevisiae WJSL0191의 무세포추출물이 가장높은 33.2%의 tyrosinase 저해활성을 보였고 금산 향신료 재배지에서 분리한 효모중에서는 P. laurentii ON30가 27.3%로가장 높은 활성을 보여 이들 두 효모들을 우수균주들로 최종 선발하였다. 선발균주모두 자낭포자를 형성하였으나 의균사를 형성하지 않았고 YPD 배지와 비타민을 첨가하지 않은 YPD 배지에서 잘 생육하였다.
3%로가장 높은 활성을 보여 이들 두 효모들을 우수균주들로 최종 선발하였다. 선발균주모두 자낭포자를 형성하였으나 의균사를 형성하지 않았고 YPD 배지와 비타민을 첨가하지 않은 YPD 배지에서 잘 생육하였다. 특히S.
위와 같이 tyrosinase 저해물질 생산 우수 균주로 선발한 S. cerevisiae WJSL0191과 P. laurentii ON30 들의 tyrosinase 저해물질 생산 조건을 비교한 결과 두 균주 모두 tyrosinase 저해물질 생산에 제일 적합한 배지는 YPD 배지이었고 배양온도는 20℃~30℃에서 제일 좋았다. 그러나 P.
한편, 향신료 재배지 주변 토양에서 분리한 비병원성 야생 효모들의 무세포 추출물들의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 이들 야생효모들 중 양파 재배 토양에서 분리한 Papiliotrema laurentii (P. laurentii) ON 30이 tyrosinase 저해활성이 27.3%로 가장 높았고, 마늘 재배 토양에서 분리한 Meyerozyma guilliermondii M1C-3균주도 19.7%를 보였다. 따라서 우수균주로 최종 P.
주름생성 원인이 되는 elastase에 대한 저해활성은 S. cerevisiae WJSL0191이 26.2%로 비교적 높았고 P. laurentii ON30도 18.6%를 보였다. 또한 SOD 유사활성은 S.
한편, elastase 저해활성이 우수했던 S. cerevisiae WJSL0191 균주의 elastase 저해물질 생산 최적 배양시간의 영향을 조사한 결과 배양 48시간에 30.0%, 72시간에 32.4%를보였다(data not shown).

후속연구

비록, 선발 야생효모S. cerevisiae WJSL 0191의 tyrosinase 저해활성이 Diutina siamensis JR37-5의 30.9%와 Starmerella bombicola 80-J-1의 36.2%들[15]과 비슷하거나 약간 낮은 저해활성이었지만 아래와 같은 생산조건의 최적화 연구를 통해 저해활성을 크게 증진시킬 수 있었고 선발균주가 전통 발효식품 산업에 오랫동안 이용되고 있는 GRAS 균주이기 때문에 이 야생효모 균주를 이용한 고부가가치의 기능성 미용 화장품 소재로서의 산업적응용성이 매우 클 것으로 사료된다.
cerevisiae WJSL0191 균주가P. laurentii ON30보다 비록 배양시간이 48시간 길었지만 tyrosinase 저해활성이 3배 이상 높아 tyrosinase 저해 물질 대량생산을 통한 산업적 응용에 더 적합한것으로 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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