[논문]Kastle-Meyer(KM) test의 위양성 반응과 시약 적용 방법에 관한 연구

김채린; 김창용; 김민영; 유제설

doi:10.15207/jkcs.2020.11.10.139

Kastle-Meyer(KM) test의 위양성 반응과 시약 적용 방법에 관한 연구
A study on the false-positive reaction of Kastle-Meyer(KM) test and the application of KM reagent 원문보기

한국융합학회논문지 = Journal of the Korea Convergence Society, v.11 no.10, 2020년, pp.139 - 146

김채린 (순천향대학교 법과학대학원) , 김창용 (순천향대학교 법과학대학원) , 김민영 (순천향대학교 법과학대학원) , 유제설 (순천향대학교 법과학대학원)

초록
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Kastle-Meyer (KM) test는 현장에서 잠재혈흔을 확인하는 예비검사 방법으로, 다른 방법에 비해 감도가 뛰어난 반면, 혈액이 존재하지 않는 곳에서도 위양성 반응이 나타날 수 있다. 본 연구에서는 이러한 KM test의 위양성 반응의 문제를 해결하기 위해 새로운 적용 방법을 제시하고자 하였다. 새로운 KM test 적용 방법의 효과와 위양성의 식별 가능성을 확인하기 위해 기존의 두 가지 KM test 적용 방법과 반응 시간 및 양상을 비교하였다. 실험 결과, 실험에 사용된 KM test 적용 방법 간의 감도에는 유의한 차이가 없었으며, 희석비율이 5000:1 이하인 혈액에서는 즉시 양성반응이 나타나 위양성과 구분하기 용이했다. 하지만 혈액의 희석비율이 높아질수록 양성 반응의 발현 시간이 늦어지면서 위양성과 구분하기 어려웠고, 새로운 KM test 적용 방법은 반응의 양상을 통해 이를 보완할 수 있었다. 따라서 본 연구는 KM test가 현장에서 보다 정확하게 사용될 수 있도록 새로운 적용 방법을 제시하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Kastle-Meyer (KM) test is one of presumptive tests used to detect latent blood in crime scenes. While this method is more sensitive than others, false positive reaction can be shown where blood does not exist. In this study, we tried to suggest a new application method to solve this problem. Reaction time and aspect of reaction of this new method was compared with two conventional methods in order to identify the effectiveness and identifiability. As a result, there was no statistically significant difference in sensitivity between the methods. In addition, in case of blood with a dilution ratio of 5000:1 or less, positive reaction showed immediately, making it easy to distinguish the reaction from false positive reaction. However, it became difficult to distinguish them with the reaction time as the dilution ratio increased, and this phenomenon could be supplemented observing aspect of the reaction when using the new method. Therefore, this study suggested a new method for KM test that can be used more accurately in the field.

주제어

표/그림 (8)

표 Table 1. Comparison of methods 2.2.1, 2.2.2, and 2.2.3
그림 Fig. 1. Appearance of positive reaction when applying the reagent with method II.2.1, after deposition of blood diluted at a rate of 1:10000 on a white cotton T-shirt. (a) Before reagent application, (b) 30 seconds after reagent application, (c) 3 minutes after reagent application.
그림 Fig. 2. Appearance of positive reaction when applying the reagent with methods 2.2.1, 2.2.2, and 2.2.3. (a) 3 minutes after applying the reagent with method 2.2.1. on blood diluted at a rate of 1:10000 on a white cotton T-shirt, (b) applying the reagent with method 2.2.2. on cotton swab which was used to wipe blood diluted at a rate of 1:10000 on a slide glass, (c) applying the reagent with method 2.2.3. on cotton swab which was used to wipe blood diluted at a rate of 1:10000 on a slide glass.
그림 Fig. 3. Appearance of false-positive reaction when applying the reagent with methods 2.2.1, 2.2.2, and 2.2.3. (a) 5 minutes after applying the reagent with method 2.2.1. on a blank sample (white cotton T-shirt), (b) applying the reagent with method 2.2.2. on cotton swab which was used to wipe a blank sample on a slide glass, (c) applying the reagent with method 2.2.3. on cotton swab which was used to wipe a blank sample on a slide glass.
그림 Fig. 4. The time at which false-positive reaction began appearing when applying the reagent on blank samples.
그림 Fig. 5. The time at which positive reaction began appearing when applying the reagent on diluted blood samples with method 2.2.1.
그림 Fig. 6. The time at which positive reaction began appearing when applying the reagent on diluted blood samples with method 2.2.2.
그림 Fig. 7. The time at which positive reaction began appearing when applying the reagent on diluted blood samples with method 2.2.3.

AI 본문요약
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문제 정의

3)을 사용하면 양성반응과 위양성 반응을 확실하게 구분할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 이 방법을 기존에 알려진 KM 시약을 적용하는 방법인 분무법 (방법 2.2.1), 검체를 닦아낸 면봉에 시약을 떨어뜨리는 방법 (방법 2.2.2)과 각각 비교하여 이 방법의 이용 가능성을 검토하였다.
본 연구에서는 KM 시약을 검체에 적용하는 방법을 바꾸어 양성 반응과 위양성 반응을 구별할 수 있는 새로운 방법을 소개할 것이다. 또한, 기존에 알려진 두 가지 KM 시약을 적용하는 방법과 본 연구에서 제시하는 새로운 방법의 민감도 및 위양성의 양상을 비교함으로써 그 효과성을 입증하고자 한다.
본 연구에서는 KM 시약을 검체에 적용하는 방법을 바꾸어 양성 반응과 위양성 반응을 구별할 수 있는 새로운 방법을 소개할 것이다. 또한, 기존에 알려진 두 가지 KM 시약을 적용하는 방법과 본 연구에서 제시하는 새로운 방법의 민감도 및 위양성의 양상을 비교함으로써 그 효과성을 입증하고자 한다.
본 연구에서는 선행연구를 통해 오래된 검체에서도 검사가 가능하며, 다른 혈흔 예비검사 방법에 비해 감도가 높고, 다른 예비검사 방법을 사용한 뒤에도 사용할 수 있다는 장점이 있는 KM test[9-13]의 위양성 판별과 관련된 문제를 해결하고자 하였다. 결론적으로, 본 연구에서 새롭게 소개하는 적용 방법을 사용했을 때, 기존에 이용되어오던 두 방법에 비해 민감도는 떨어지지 않으면서 양성과 위양성 간에 양상 차이가 확연했다.
Kastle-Meyer(KM) test는 다른 예비검사 기법들에 비하여 높은 감도와 특이성을 가져 추천되는 단일 검사 기법이지만 공기 중 산소에 의해 시약이 산화되어 나타나는 위양성이 다른 예비검사 시약에 비해 쉽게 일어난다. 본 연구에서는 이러한 위양성의 위험을 줄이는 방법을 소개하고 이 새로운 방법의 효과성을 확인하고자 하였다.
현장에서는 예비검사(presumptive test)를 통해 잠재혈흔이 존재하는지 확인한다. 대부분의 경우, 이러한 예비검사에는 heme에 의해 촉매 되는 산화-환원 반응을 이용하는 peroxidase reagent가 사용된다[6,7].

제안 방법

2.2.1에서 만든 저장용액에 멸균 면봉을 담가 완전히 적신 후에 3% 과산화수소 3 방울을 떨어뜨려 혈액을 채취할 면봉을 제조하였다. 이 면봉으로 검체를 닦아서 혈액을 채취한 후 반응 여부를 확인하고, 색이 나타나는 데 까지 걸리는 시간을 측정하였다.
공시료에 방법 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3으로 각각 시약을 적용했을 때 나온 위양성 반응 양상을 비교하였다.
다음으로 각 혈액 희석 비율별 반응 시간을 비교하였다. 세 가지 방법 모두 혈액의 희석비율이 증가함에 따라 양성 반응이 나타나는 시간이 점진적으로 증가하였다.
먼저 양성과 위양성 반응 간의 양상을 비교하였다. 방법 2.
방법 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3을 이용하여 전혈 및 8 단계 비율로 희석한 혈액에 각각 적용했을 때의 반응 여부 및 시간을 기록하고 비교하였다.
저장용액이 완성되면, 저장용액 20 mL와 에탄올 80 mL를 완전히 섞어준 뒤, 3% 과산화수소 5 방울을 떨어뜨려 작업용액을 제조하였다. 완성된 작업용액을 분무기에 넣고 검체에서 약 30 ~ 45 cm 떨어진 곳으로부터 분무하였고, 반응 여부를 확인한 후에 색이 나타나는 데까지 걸리는 시간을 측정하였다.
1에서 만든 저장용액에 멸균 면봉을 담가 완전히 적신 후에 3% 과산화수소 3 방울을 떨어뜨려 혈액을 채취할 면봉을 제조하였다. 이 면봉으로 검체를 닦아서 혈액을 채취한 후 반응 여부를 확인하고, 색이 나타나는 데 까지 걸리는 시간을 측정하였다.
증류수에 적신 멸균 면봉으로 검체를 닦아서 혈액을 채취한 후, 에탄올 3 방울과 DCB101 3 방울을 순서대로 떨어뜨렸다. 이후에 3% 과산화수소 3 방울을 떨어뜨려서 반응 여부를 확인하였고, 색이 나타나는 데까지 걸리는 시간을 측정하였다.
의 phenolphthalein redux reagent - DCB101의 “technical information”을 참고하여 진행하였다[15]. 증류수에 적신 멸균 면봉으로 검체를 닦아서 혈액을 채취한 후, 에탄올 3 방울과 DCB101 3 방울을 순서대로 떨어뜨렸다. 이후에 3% 과산화수소 3 방울을 떨어뜨려서 반응 여부를 확인하였고, 색이 나타나는 데까지 걸리는 시간을 측정하였다.
”을 참고하여 진행하였다[6]. 페놀프탈레인 2 g과 수산화칼륨 20 g, 증류수 100 mL, zinc powder 20 g을 섞은 용액이 무색이 될 때까지 환류 장치로 환류시켜 저장용액을 제조하였다. 저장용액이 완성되면, 저장용액 20 mL와 에탄올 80 mL를 완전히 섞어준 뒤, 3% 과산화수소 5 방울을 떨어뜨려 작업용액을 제조하였다.
혈액은 IRB 승인을 받아 모집공고를 내어 만 25 세의 남성을 공여자로 선별한 뒤 채취하였으며, 채혈 후 바로 EDTA tube에 넣어 냉장보관 하였고 채혈 시점으로부터 한 달 이내의 것만을 사용하였다. 희석 혈액은 혈액과 탈이온수를 1:100, 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10000, 1:20000, 1:30000, 1:40000 비율로 희석하여 제조하였다. 시료는 각 비율로 희석한 혈액과 전혈을 검체에 10 µL씩 떨어뜨려 준비하였으며, 공시료는 증류수만을 검체에 떨어뜨려 준비하였다.

대상 데이터

KM 저장용액 완제품은 phenolphthalein redux reagent – DCB101 (Sirchie®, USA)을 사용하였다.
검체로는 흰색 면 100% 티셔츠와 슬라이드글라스를 사용하였다. Transfer medium을 결정하기 위한 예비실험에서, filter paper (CHMLAB, Spain)을 사용하였을 때 위양성이 면봉에 비하여 매우 빠르게 나타났기 때문에 transfer medium으로 멸균면봉 (Poongsung, Korea)을 사용하였다. 카메라 본체는 EOS 100D (Canon, Japan)를 사용하였고, 렌즈는 18-55 mm f/3.
검체로는 흰색 면 100% 티셔츠와 슬라이드글라스를 사용하였다. Transfer medium을 결정하기 위한 예비실험에서, filter paper (CHMLAB, Spain)을 사용하였을 때 위양성이 면봉에 비하여 매우 빠르게 나타났기 때문에 transfer medium으로 멸균면봉 (Poongsung, Korea)을 사용하였다.
KM 저장용액 완제품은 phenolphthalein redux reagent – DCB101 (Sirchie^®, USA)을 사용하였다. 에탄올, 3% 과산화수소수는 Daejung (Korea) 제품을 사용하였다.
Transfer medium을 결정하기 위한 예비실험에서, filter paper (CHMLAB, Spain)을 사용하였을 때 위양성이 면봉에 비하여 매우 빠르게 나타났기 때문에 transfer medium으로 멸균면봉 (Poongsung, Korea)을 사용하였다. 카메라 본체는 EOS 100D (Canon, Japan)를 사용하였고, 렌즈는 18-55 mm f/3.5-5.6 EF-S zoom lens (Canon, Japan)를 사용하였다.
혈액은 IRB 승인을 받아 모집공고를 내어 만 25 세의 남성을 공여자로 선별한 뒤 채취하였으며, 채혈 후 바로 EDTA tube에 넣어 냉장보관 하였고 채혈 시점으로부터 한 달 이내의 것만을 사용하였다. 희석 혈액은 혈액과 탈이온수를 1:100, 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10000, 1:20000, 1:30000, 1:40000 비율로 희석하여 제조하였다.

이론/모형

본 방법을 이용한 실험은 Sirchie®의 phenolphthalein redux reagent - DCB101의 “technical information”을 참고하여 진행하였다[15].

성능/효과

1:10000 비율로 희석한 혈액에 시약을 적용했을 때도 대부분 반응이 즉시 나타났다. 1:20000 비율로 희석한 혈흔에 시약을 적용했을 때는, 10 개의 검체 중 4 개의 검체에서 4 분 이내에 양성 반응이 나타났으며, 나머지 6 개의 검체에서는 시약 적용 후 4 분 이상의 시간이 지나고 나서 양성 반응이 나타났다. 1:30000, 1:40000 비율로 희석된 혈액에서는 대부분 시약 적용 후 4 분 이상의 시간이 지나고 나서 양성 반응이 나타났다.
하지만 대체로 혈액의 희석 비율이 높아질수록 양성 반응이 나타나는 시간이 느려졌다. 1:30000, 1:40000 비율로 희석된 혈액에서는 시약 적용 후 4 분 이상의 시간이 지나고 나서 양성 반응이 나타났다.
희석 비율과 반응 시간이 정비례하지 않았고, 같은 비율로 희석한 동일한 양의 혈액을 도포한 검체들 간에도 반응 시간이 일정하지 않았기 때문에 양성 반응 발현 시간에서는 규칙성을 찾아내기 어려웠다. 각 실험 결과를 Fig. 3의 공시료 실험 결과와 비교해 보면, 방법 2.2.1을 사용했을 때 1:20000 이상의 비율로 희석한 혈액에서는 평균 위양성 반응 발현 시간보다 긴 시간이 지나 반응이 나타난다는 것을 알 수 있다. 방법 2.
본 연구에서는 선행연구를 통해 오래된 검체에서도 검사가 가능하며, 다른 혈흔 예비검사 방법에 비해 감도가 높고, 다른 예비검사 방법을 사용한 뒤에도 사용할 수 있다는 장점이 있는 KM test[9-13]의 위양성 판별과 관련된 문제를 해결하고자 하였다. 결론적으로, 본 연구에서 새롭게 소개하는 적용 방법을 사용했을 때, 기존에 이용되어오던 두 방법에 비해 민감도는 떨어지지 않으면서 양성과 위양성 간에 양상 차이가 확연했다. 또한, 본 연구에서 새로이 제시한 방법을 사용했을 때, 시약을 적용하고 10 분 이상의 시간이 지난 뒤에야 위양성 반응이 관찰되었다.
결론적으로, 본 연구에서 새롭게 소개하는 적용 방법을 사용했을 때, 기존에 이용되어오던 두 방법에 비해 민감도는 떨어지지 않으면서 양성과 위양성 간에 양상 차이가 확연했다. 또한, 본 연구에서 새로이 제시한 방법을 사용했을 때, 시약을 적용하고 10 분 이상의 시간이 지난 뒤에야 위양성 반응이 관찰되었다. 이는 다른 방법에 비해 양성과 위양성 간의 시간 차이가 확실한 것이므로 이 방법을 이용한다면 양성과 위양성 반응을 용이하게 구분할 수 있음을 의미한다.
이는 시험 결과에 대한 주관적인 해석이 필요하며 이 해석 결과가 수사요원에 따라 달라질 수 있다는 것을 의미하기 때문이다. 또한, 현재 법과학 분야에서 사용되고 있는 모든 혈흔 예비시약의 감도는 DNA 검사의 감도에 비해 현저히 낮다는 점에 비추어 볼 때, 시험 결과가 음성 또는 위양성 반응으로 판단되더라도 DNA가 검출될 가능성은 여전히 존재할 수 있다. 따라서 혈액예비검사 결과가 음성이더라도 혈액이 존재할 가능성이 논리적으로 예상된다면 DNA 검사를 하는 것이 바람직하다.
1을 사용했을 때 1:20000 이상의 비율로 희석한 혈액에서는 평균 위양성 반응 발현 시간보다 긴 시간이 지나 반응이 나타난다는 것을 알 수 있다. 방법 2.2.2를 사용했을 때는 1:30000 이상의 비율로 희석한 혈액에서 평균 위양성 반응 발현 시간보다 긴 시간이 지나 반응이 나타났다. 방법 2.
다음으로 각 혈액 희석 비율별 반응 시간을 비교하였다. 세 가지 방법 모두 혈액의 희석비율이 증가함에 따라 양성 반응이 나타나는 시간이 점진적으로 증가하였다. 희석 비율과 반응 시간이 정비례하지 않았고, 같은 비율로 희석한 동일한 양의 혈액을 도포한 검체들 간에도 반응 시간이 일정하지 않았기 때문에 양성 반응 발현 시간에서는 규칙성을 찾아내기 어려웠다.
예비실험을 통해 시약으로 미리 적셔둔 면봉을 사용하여 검체를 닦아내는 방법 (방법 2.2.3)을 사용하면 양성반응과 위양성 반응을 확실하게 구분할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 이 방법을 기존에 알려진 KM 시약을 적용하는 방법인 분무법 (방법 2.

후속연구

이렇듯 다른 혈흔 시약을 이용했을 때보다 KM test를 이용했을 때 위양성 반응이 현저히 빠르게 나타나는 이유는 시약 자체의 활성화 에너지가 매우 낮기 때문일 것으로 생각된다. 그러나 이러한 반응 현상의 정확한 화학적 메커니즘에 관하여는 밝혀진 바가 없으므로 이에 관한 후속 연구가 필요할 것으로 보인다.
이는 다른 방법에 비해 양성과 위양성 간의 시간 차이가 확실한 것이므로 이 방법을 이용한다면 양성과 위양성 반응을 용이하게 구분할 수 있음을 의미한다. 따라서 새로운 방법을 현장에서 사용한다면 잠재 혈흔의 유무를 보다 명확하게 구분할 수 있을 것이며, 육안상 혈흔으로 의심되는 물질이 진짜 혈흔이 맞는지도 확인할 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Kastle-Meyer (KM) test란?	Kastle-Meyer (KM) test는 현장에서 잠재혈흔을 확인하는 예비검사 방법으로, 다른 방법에 비해 감도가 뛰어난 반면, 혈액이 존재하지 않는 곳에서도 위양성 반응이 나타날 수 있다. 본 연구에서는 이러한 KM test의 위양성 반응의 문제를 해결하기 위해 새로운 적용 방법을 제시하고자 하였다.
	Kastle-Meyer (KM) test의 장점은?	Kastle-Meyer (KM) test는 현장에서 잠재혈흔을 확인하는 예비검사 방법으로, 다른 방법에 비해 감도가 뛰어난 반면, 혈액이 존재하지 않는 곳에서도 위양성 반응이 나타날 수 있다. 본 연구에서는 이러한 KM test의 위양성 반응의 문제를 해결하기 위해 새로운 적용 방법을 제시하고자 하였다.
	잠재혈흔을 확인하기 위한 예비검사는 어떤 반응을 이용하는가?	현장에서는 예비검사(presumptive test)를 통해 잠재혈흔이 존재하는지 확인한다. 대부분의 경우, 이러한 예비검사에는 heme에 의해 촉매 되는 산화-환원 반응을 이용하는 peroxidase reagent가 사용된다[6,7]. 적혈구속 헤모글로빈의 주성분인 heme에 존재하는 철에 의해 시약이 산화하여 변색되는 원리를 이용하는 것이다[7,8].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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