잠재적 사료첨가제로서 Pediococcus acidilactici SRCM102607의 생균제 특성 및 면역활성 효과 Probiotic Properties and Immunomodulator Evaluation of the Potential Feed Additive Pediococcus acidilactici SRCM102607원문보기
본 연구에서는 가축의 면역증강용 생균제 개발을 위하여 Pediococcus acidilactici SRCM102607의 프로바이오틱스 특성 및 면역활성을 조사하였다. 전통발효식품으로부터 유산균을 분리 하였고, 분리 유산균을 대상으로 가축유해 미생물 5종에 대한 항균활성을 측정하였다. 우수한 결과를 나타내는 5종의 유산균을 1차 선별하였고, 이를 대상으로 생균제 소재 활용 가능성을 확인하기 위해 용혈성, 담즙산염분해효소, 항산화 활성 분석을 실시하여 최종적으로 SRCM102607을 선별하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 Pediococcus acidilactici SRCM102607로 명명하였다. SRCM102607의 pH 2 조건에서 내산성은 1.54×105 CFU/ml의 생균수를 보였으며, 0.5% 이상의 oxgall이 포함된 조건에서도 105 CFU/ml 이상의 높은 생균수를 나타내었다. 또한, 선발균주의 산업적으로 활용할 수 있는 가능성을 검토하기 위해 항생제 내성 및 분해 효소능을 측정하였고 다양한 항생제에 대한 내성과 유해 효소를 생성하지 않음을 확인하였고, 최종적으로 면역 증강제로서의 활용 여부를 확인하기 위해 TNF-α 생성능(171.86±4.00 ng/ml)을 확인하였다. 본 연구를 기반으로 SRCM102607은 가축 생균제 소재로 활용 가능성과 면역활성이 뛰어난 유산균으로 생균제 산업에서의 잠재적 적용 가능성을 확인하였다.
본 연구에서는 가축의 면역증강용 생균제 개발을 위하여 Pediococcus acidilactici SRCM102607의 프로바이오틱스 특성 및 면역활성을 조사하였다. 전통발효식품으로부터 유산균을 분리 하였고, 분리 유산균을 대상으로 가축유해 미생물 5종에 대한 항균활성을 측정하였다. 우수한 결과를 나타내는 5종의 유산균을 1차 선별하였고, 이를 대상으로 생균제 소재 활용 가능성을 확인하기 위해 용혈성, 담즙산염 분해효소, 항산화 활성 분석을 실시하여 최종적으로 SRCM102607을 선별하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 Pediococcus acidilactici SRCM102607로 명명하였다. SRCM102607의 pH 2 조건에서 내산성은 1.54×105 CFU/ml의 생균수를 보였으며, 0.5% 이상의 oxgall이 포함된 조건에서도 105 CFU/ml 이상의 높은 생균수를 나타내었다. 또한, 선발균주의 산업적으로 활용할 수 있는 가능성을 검토하기 위해 항생제 내성 및 분해 효소능을 측정하였고 다양한 항생제에 대한 내성과 유해 효소를 생성하지 않음을 확인하였고, 최종적으로 면역 증강제로서의 활용 여부를 확인하기 위해 TNF-α 생성능(171.86±4.00 ng/ml)을 확인하였다. 본 연구를 기반으로 SRCM102607은 가축 생균제 소재로 활용 가능성과 면역활성이 뛰어난 유산균으로 생균제 산업에서의 잠재적 적용 가능성을 확인하였다.
The purpose of this study was to investigate the probiotic characteristics and immune activities of selected lactic acid bacterial (LAB) strains as feed additives in livestock. 301 LAB strains isolated from traditional fermented foods were first assessed for their antibacterial activity potential. O...
The purpose of this study was to investigate the probiotic characteristics and immune activities of selected lactic acid bacterial (LAB) strains as feed additives in livestock. 301 LAB strains isolated from traditional fermented foods were first assessed for their antibacterial activity potential. Of the 301 isolates, five showed antibacterial activity against five livestock pathogens (Esherichia coli KCCM11234, Listeria monocytogens KCTC3710, Salmonella Typhimurium KCTC1926, Staphylococcus aureus KCCM11593, and Shigella flexneri KCTC2517). The probiotic characteristics of the five selected strains were also investigated by antioxidative activity, hemolysis, bile salt hydrolase, acid resistance and bile tolerance. The SRCM102607 strain was found to have superior probiotic properties and was selected for further experimentation. 16S rRNA gene sequencing showed that SRCM102607 is Pediococcus acidilactici, which was labeled as P. acidilactici SRCM102607 (KCCM 12246P). The survival characteristics of P. acidilactici SRCM102607 in artificial gastrointestinal conditions were assessed under exposed acidic (pH 2.0) and bile (0.5% and 1.0%) conditions. P. acidilactici SRCM102607 was also confirmed to have resistance to various antibiotics, including amikacin, gentamicin, vancomycin, and etc. The TNF-α production by P. acidilactici SRCM102607 was 171.86±4.00 ng/ml. These results show that P. acidilactici RCM102607 has excellent potential for use as a probiotic livestock feed additive.
The purpose of this study was to investigate the probiotic characteristics and immune activities of selected lactic acid bacterial (LAB) strains as feed additives in livestock. 301 LAB strains isolated from traditional fermented foods were first assessed for their antibacterial activity potential. Of the 301 isolates, five showed antibacterial activity against five livestock pathogens (Esherichia coli KCCM11234, Listeria monocytogens KCTC3710, Salmonella Typhimurium KCTC1926, Staphylococcus aureus KCCM11593, and Shigella flexneri KCTC2517). The probiotic characteristics of the five selected strains were also investigated by antioxidative activity, hemolysis, bile salt hydrolase, acid resistance and bile tolerance. The SRCM102607 strain was found to have superior probiotic properties and was selected for further experimentation. 16S rRNA gene sequencing showed that SRCM102607 is Pediococcus acidilactici, which was labeled as P. acidilactici SRCM102607 (KCCM 12246P). The survival characteristics of P. acidilactici SRCM102607 in artificial gastrointestinal conditions were assessed under exposed acidic (pH 2.0) and bile (0.5% and 1.0%) conditions. P. acidilactici SRCM102607 was also confirmed to have resistance to various antibiotics, including amikacin, gentamicin, vancomycin, and etc. The TNF-α production by P. acidilactici SRCM102607 was 171.86±4.00 ng/ml. These results show that P. acidilactici RCM102607 has excellent potential for use as a probiotic livestock feed additive.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 항생제 사용이 금지되면서 가축의 고밀도 사육 및 가스발생과 같은 열악한 환경으로 인해 가축의 질병 발병률이 높아지고, 가축질병의 원인체에 대한 예방용 백신이 존재하지만 백신의 효과만으로는 한계가 있어 농가의 피해가 큰 시점에 가축에게 보편적으로 적용할 수 있는 생균제로 다양하게 사용되는 프로바이오틱스 활성 균주를 선별하고, 이의 면역증강 효과를 확인하여 가축 면역증강용 생균제로서의 활용 및 산업화 가능한 대체미생물 소재 발굴을 목표로 연구를 수행하였다.
제안 방법
TNF-α 분비능의 양성대조구 물질로는 lipopolysaccharide (LPS)를 사용하여 측정하였다.
acidilactici SRCM102607 of typical Pediococcus strains based on the 16S rRNA gene sequences. The tree was constructed using neighbor-joining method with the bootstrap values at 1,000 replicates.
각 분리 균주는 MRS (Difco, USA) 액체배지에서 48시간 진탕 배양 후 상등액을 0.45 μm syringe filter (Sartorius, Germany)로 여과하여 6 mm well에 각각 100 μl씩 분주하였다.
각각의 선별 균주를 MRS (Difco, USA) 액체배지에서 48시간 진탕 배양 후 상등액을 시료로 사용하였으며, 상등액 20 μl에 100 mM DPPH (Sigma-Aldrich, USA) 용액 180 μl을 96 well plate에 혼합하여 빛이 차단된 상태로 실온에서 30분간 반응한 후, microplate reader (SPARK, TECAN, Austria)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
aureus는 젖소 유방암 원인균으로 알려져 있다. 또한, 돼지에게 설사를 일으켜 폐사 등의 문제를 일으키는 E. coli와 세균성 이질 원인균으로 알려진 S. flexneri까지 총 5종의 가축 유해 미생물에 대한 항균활성을 추가로 조사하였다. 분리주 대부분은 유해 미생물에 대해 활성을 보유하고 있었으며 SRCM102283, SRCM102607, SRCM103292, SRCM103307, SRCM103456 5종이 가축 유해 미생물에 대해 높은 항균활성을 나타내어(Table 1), 가축 유해 병원균에 대한 억제 효과가 우수함을 확인하였다.
5%(w/v) 포함된 MRS (Difco, USA)에 평판배지 획선 접종하여 37℃에서 72시간 동안 혐기 상태로 배양하였다. 배양 후 담즙산염이 가수분해되어 담즙산의 침전으로 인한 콜로니 주변에 형성되는 불투명한 환의 생성 여부로 담즙산염 분해 효소의 활성을 판단하였다.
45 μm syringe filter (Sartorius, Germany)로 여과하여 6 mm well에 각각 100 μl씩 분주하였다. 분주 후 37℃에서 24시간 배양하여 well 주변에 형성된 억제환의 직경을 측정하여 항균활성을 확인하였다.
선발 균주의 배양상등액은 1% FBS (Gibco, Germany)와 1% antibiotics가 함유된 DMEM (HyClone, USA) 배지를 사용하여 최종농도가 4%가 되도록 희석한 후 세포에 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였으며, 상등액으로 분비된 TNF-α의 양을 OptEIATM ELISA kit (BD Biosciences, USA)을 이용하여 SpectraMax 190 Microplate Reader (Molecular Devices, USA) 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
선별 균주의 용혈성 여부를 조사하기 위해 blood agar base (MB cell, Korea)에 5% sheep blood (MB cell, Korea)를 첨가하여 용혈배지를 제조하였다. 선별 균주를 용혈배지에 획선 접종 후, 37℃에서 48시간 배양하여 집락 주위로 형성되는 환의 형태를 통해 용혈성을 분석하였다. Argyri의 방법[2]에 의해 집락 주변에 녹색 환의 생성은 α-hemolysis, 황색 투명환은 β-hemolysis 그리고 주변에 환이 생성되지 않을 경우 γ-hemolysis로 판단하였다.
선별 균주에 대한 2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) 라디칼 소거활성을 측정하기 위해 Blois의 방법[3]을 응용하여 측정하였다. 각각의 선별 균주를 MRS (Difco, USA) 액체배지에서 48시간 진탕 배양 후 상등액을 시료로 사용하였으며, 상등액 20 μl에 100 mM DPPH (Sigma-Aldrich, USA) 용액 180 μl을 96 well plate에 혼합하여 빛이 차단된 상태로 실온에서 30분간 반응한 후, microplate reader (SPARK, TECAN, Austria)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
선별 균주의 내산성을 확인하기 위해 0.1N HCl (Sigma-aldrich, USA)을 이용하여 배지의 pH를 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 수준으로 조정한 MRS (Difco, USA) 액체배지에 선별 균주의 전배양액을 1%를 접종하여 37℃에서 30분 정치 후 생균수를 측정하였다. 인공 담즙산에 대한 내성 평가는 Oxgall (Neogen, USA)을 각 0, 0.
선별 균주의 용혈성 여부를 조사하기 위해 blood agar base (MB cell, Korea)에 5% sheep blood (MB cell, Korea)를 첨가하여 용혈배지를 제조하였다. 선별 균주를 용혈배지에 획선 접종 후, 37℃에서 48시간 배양하여 집락 주위로 형성되는 환의 형태를 통해 용혈성을 분석하였다.
시료를 5 ml suspension medium (bioMerieux, Marcy-I’Etoile, France)에 현탁 후 5-6 Mcfarland (bioMerieux, Marcy-I’Etoile, France) 탁도로 조정하였다.
유해효소의 억제와 유용효소에 대한 생성은 미생물마다 상이한 특성을 갖기 때문에 SRCM102607의 효소 활성 여부를 확인하기 위해 API ZYM kit를 이용하여 조사하였다. SRCM 102607은 신장에서 가수분해를 돕는 leucine arylamidase, valine arylamidase, cysteine arylamidase와 같은 protease 효소에 대하여 활성을 나타내었다.
0 수준으로 조정한 MRS (Difco, USA) 액체배지에 선별 균주의 전배양액을 1%를 접종하여 37℃에서 30분 정치 후 생균수를 측정하였다. 인공 담즙산에 대한 내성 평가는 Oxgall (Neogen, USA)을 각 0, 0.1, 0.3, 0.5, 1%의 농도로 첨가하여 제조한 MRS (Difco, USA) 액체배지에 선별 균주의 전 배양액 1%를 접종한 후 37℃에서 6시간 배양하여 생균수를 측정하였다.
전통 발효식품으로부터 분리한 유산균 301종을 대상으로 가축 유해 병원성 미생물로 알려진 5종에 대한 항균활성을 well diffusion 방법을 통해 확인하였다. L.
MRS 액체배지(Difco, USA)에 최종 선발 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 전 배양액 1%를 MRS (Difco, USA) 고체배지에 접종하였다. 제조한 배지를 굳힌 뒤 항생제 디스크(BBL Sensi-disc, Becton Dickinson Co, USA)를 배지 위에 올려놓고 37℃에서 24시간 배양하여 디스크 주변에 형성된 환 크기를 측정하였으며, CLSI 가이드라인에 따라 내성과 감수성을 판단하였다. 시험에 사용된 항생제 디스크(Liofilchem, Italy)는 amikacin (30 μg, AK), amoxi-cillin/clavulanic acid (2 μg/1 μg, AMC), ampicillin (10 μg, AMP), cephalexin (30μg, CL), ciprofloxacin (5 μg, CIP), erythromycin (15 μg, E), gentamicin (30 μg, CN), imipenem (10 μg, IMI), kanamycin (30 μg, K), lincomycin (15 μg, MY), netilmicin (30 μg, NET), neomycin (30 μg, N), nitrofurantoin (300 μg, F), nofloxacin (10 μg, NOR), ofloxacin (5 μg, OFX), penicillin G (1 IU, P), penicillin G (2 IU, P), penicillin G (10 IU, P), streptomycin (10 μg, S), tetracycline (30 μg, TE), trimethoprim/sulfamethoxazole (1.
효소활성 측정은 API ZYM kit (bioMeriux, Marcy-I’Etoile, France)를 사용하여 alkaline phosphatase 등 18가지 효소를 대상으로 측정하였다. 최종 선발 균주를 MRS (Difco, USA) 액체배지에서 37℃, 24시간 배양한 후 균체를 회수하고 멸균수로 3회 세척하여 활성 측정을 위한 시료로 사용하였다. 시료를 5 ml suspension medium (bioMerieux, Marcy-I’Etoile, France)에 현탁 후 5-6 Mcfarland (bioMerieux, Marcy-I’Etoile, France) 탁도로 조정하였다.
최종 선발 균주의 면역증강 효과를 확인하기 위해 cytokine 중 하나인 TNF-α의 분비능을 측정하였다.
최종 선발한 SRCM102607의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열(1,515 bp)을 기반으로 NCBI nucleotide BLAST search를 수행하였으며, GenBank에 등록된 표준균주와 염기서열을 비교하였다. 계통분석을 위한 evolutionary distance 추론을 위해 근린결합법(neighbor-joining method)을 사용하였으며, bootstrap 분석을 1,000회 반복수행하여 계통수의 신뢰도를 확보하였다.
최종 선별 균주의 분자학적 동정 및 계통수 작성을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 서열 증폭을 위해 universal primer인 785F (5’-GGATTAGATACCCTGGTA-3’)와 907R (5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’) primer를 사용하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 서열의 유사도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 서열을 얻었다.
선발 균주의 배양상등액은 1% FBS (Gibco, Germany)와 1% antibiotics가 함유된 DMEM (HyClone, USA) 배지를 사용하여 최종농도가 4%가 되도록 희석한 후 세포에 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였으며, 상등액으로 분비된 TNF-α의 양을 OptEIATM ELISA kit (BD Biosciences, USA)을 이용하여 SpectraMax 190 Microplate Reader (Molecular Devices, USA) 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 recombinant mouse TNF를 사용하였으며 농도는 15.6 pg/ml에서 1,000 pg/ml까지 assay diluent (PBS with 10% FBS)로 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다. TNF-α 분비능의 양성대조구 물질로는 lipopolysaccharide (LPS)를 사용하여 측정하였다.
시료를 5 ml suspension medium (bioMerieux, Marcy-I’Etoile, France)에 현탁 후 5-6 Mcfarland (bioMerieux, Marcy-I’Etoile, France) 탁도로 조정하였다. 현탁액을 ZYM 스트랩의 각각 큐플에 65 ul씩 분주하여 37℃에서 4시간 배양하였으며, 활성 증가와 기질의 용해를 위해 ZYM A와 B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 떨어뜨려 5분간 반응시켜 색깔의 변화를 관찰하여 효소 활성을 조사하였다.
가축 생균제에 적용 가능한 유산균을 분리하기 위해 전라북도 소재 전통 발효식품 총 110여 종을 수집하였다. 확보된 시료는 단계 희석을 통해 콜로니의 형태에 따라 301종의 분리주를 1차 확보하였으며, 분리주는 -80℃에 동결 보관 후 프로바이오틱스 및 면역활성 특성 분석을 위해 사용하였다.
효소활성 측정은 API ZYM kit (bioMeriux, Marcy-I’Etoile, France)를 사용하여 alkaline phosphatase 등 18가지 효소를 대상으로 측정하였다.
대상 데이터
7 (TIB-71)을 구입하여 사용하였다. RAW264.7 세포는 10% fetal bovin serum (FBS, Gibco, Germany)과 1% 항세균 및 항진균 물질(Anti-Anti 100X, Gibco, Germany)이 포함된 DMEM (HyClone, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 계대배양은 세포가 plate에 85% 정도 밀집되었을 때 진행하였고, 3,000 rpm에서 3분간 원심분리 후 현탁하여 사용하였다.
가축 생균제에 적용 가능한 유산균을 분리하기 위해 전라북도 소재 전통 발효식품 총 110여 종을 수집하였다. 확보된 시료는 단계 희석을 통해 콜로니의 형태에 따라 301종의 분리주를 1차 확보하였으며, 분리주는 -80℃에 동결 보관 후 프로바이오틱스 및 면역활성 특성 분석을 위해 사용하였다.
본 연구에 사용된 시료는 전라북도에서 제조 및 판매되고 있는 발효식품 총 110종(김치 20종, 고추장 20종, 된장 15종, 청국장 15종, 장아찌류 10종, 막걸리 30종)을 수집하여 분리원으로 사용하였다. 각 시료 1 g을 9 ml의 0.
각각의 현탁액은 Lactobacilli MRS (Difco, USA) 평판배지에 100 μl 도말하여 37℃에서 48시간 배양하고, 배지 상에 형성된 집락의 형태학적 특징에 따라 순수 분리하였다. 분리주는 20% glycerol (Merck, Germany)와 5% skim milk (Difco, USA)를 혼합 후 -80℃ 초저온냉동고에 보관하여 본 연구에 사용하였다.
서열 증폭을 위해 universal primer인 785F (5’-GGATTAGATACCCTGGTA-3’)와 907R (5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’) primer를 사용하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 서열의 유사도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 서열을 얻었다.
선별 균주의 가축병원성 균주에 대한 항균활성을 확인하기 위한 Esherichia coli KCCM11234, Listeria monocytogens KCTC 3710, Salmonella Typhimurium KCTC1926, Shigella flexneri KCTC2517 및 Staphylococcus aureus KCCM11593 균주 5종은 한국미생물자원센터(KCTC, Korean Culture Type Collection, Korea)와 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center for Microorganisms, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 각 지시 균주를 37℃에서 24시간 배양 후 흡광도를 측정하여 배양액을 일정한 농도(OD660, 0.
선별 균주의 담즙산염 분해효소(BSH, bile salt hydrolase) 활성은 Taranto 등의 방법[33]에 따라 수행하였다. 소디움인 taurodeoxycholic acid (TDCA), glycoldeoxy-cholic acid (GDCA)가 0.5%(w/v) 포함된 MRS (Difco, USA)에 평판배지 획선 접종하여 37℃에서 72시간 동안 혐기 상태로 배양하였다. 배양 후 담즙산염이 가수분해되어 담즙산의 침전으로 인한 콜로니 주변에 형성되는 불투명한 환의 생성 여부로 담즙산염 분해 효소의 활성을 판단하였다.
최종 선별 균주의 면역증강 효과의 확인은 American Type Culture Collection (ATCC, USA)으로 부터 mouse macrophage RAW264.7 (TIB-71)을 구입하여 사용하였다. RAW264.
데이터처리
서열 증폭을 위해 universal primer인 785F (5’-GGATTAGATACCCTGGTA-3’)와 907R (5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’) primer를 사용하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 서열의 유사도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 서열을 얻었다. 또한, 서열 간 상호 비교를 위해 Clustal W 2.0 program (EMBL-EBI, Hinxton, Cambridgeshire, UK)을 사용하였으며, Mega 7.0 프로그램을 사용하여 염기서열 간 계통도를 작성하였다. 계통도는 근린결합법(neighbor joining method)[25]을 이용하였으며, 1,000회 반복을 통한 bootstrapping을 진행하여 계통도의 신뢰성을 확보하였다.
실험결과는 3회 이상 반복하여 결과를 도출하였으며, 통계분석은 SPSS for Window (ver. 12.0, SPSS Inc., USA)을 사용하였다. 일원배치 분산분석(ANOVA)으로 평균과 표준편차를 분석하였고, 사후검정을 위해 Duncan’s multiple rage test (p<0.
일원배치 분산분석(ANOVA)으로 평균과 표준편차를 분석하였고, 사후검정을 위해 Duncan’s multiple rage test (p<0.05)를 실시하였다[11].
이론/모형
선별 균주의 가축병원성 균주에 대한 항균활성을 확인하기 위한 Esherichia coli KCCM11234, Listeria monocytogens KCTC 3710, Salmonella Typhimurium KCTC1926, Shigella flexneri KCTC2517 및 Staphylococcus aureus KCCM11593 균주 5종은 한국미생물자원센터(KCTC, Korean Culture Type Collection, Korea)와 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center for Microorganisms, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 각 지시 균주를 37℃에서 24시간 배양 후 흡광도를 측정하여 배양액을 일정한 농도(OD660, 0.4)로 조정하고 well diffusion 법[19]에 따라 0.8% soft agar plate를 제조하여 항균활성을 측정하였다. 각 분리 균주는 MRS (Difco, USA) 액체배지에서 48시간 진탕 배양 후 상등액을 0.
0 프로그램을 사용하여 염기서열 간 계통도를 작성하였다. 계통도는 근린결합법(neighbor joining method)[25]을 이용하였으며, 1,000회 반복을 통한 bootstrapping을 진행하여 계통도의 신뢰성을 확보하였다.
최종 선발한 SRCM102607의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열(1,515 bp)을 기반으로 NCBI nucleotide BLAST search를 수행하였으며, GenBank에 등록된 표준균주와 염기서열을 비교하였다. 계통분석을 위한 evolutionary distance 추론을 위해 근린결합법(neighbor-joining method)을 사용하였으며, bootstrap 분석을 1,000회 반복수행하여 계통수의 신뢰도를 확보하였다. 그 결과 SRCM102607 균주는 P.
선별 균주의 담즙산염 분해효소(BSH, bile salt hydrolase) 활성은 Taranto 등의 방법[33]에 따라 수행하였다. 소디움인 taurodeoxycholic acid (TDCA), glycoldeoxy-cholic acid (GDCA)가 0.
항생제 감수성 여부는 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standard)의 디스크 확산법으로 확인하였다. MRS 액체배지(Difco, USA)에 최종 선발 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 전 배양액 1%를 MRS (Difco, USA) 고체배지에 접종하였다.
성능/효과
5종의 선별 균주들의 용혈성을 측정한 결과는 Table 1과 같으며, 선별 균주 5종 중 SRCM 102607을 제외한 4균주는 α-hemolysis로 나타났으나, SRCM 102607는 γ-hemolysis로 나타나 미생물제제로 사용하기에는 적합함을 확인하였다.
가축에게 주로 사용되는 항생제는 테트라사이클린계(tetracyclin), 페니실린계(ampicillin) 및 설파계(trimethoprim/sulfamethoxazole)등이 있으며, 유산균 중 Pediococcus 속은 vancomycin과 gentamicin에 대한 내성을 가지는 고유한 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다[35]. SRCM102607을 대상으로 22종의 항생제에 대한 항생제 감수성을 조사한 결과 페니실린 계열인 ampicillin, penicillin G등 9종의 항생물질에 대하여 생육이 저해되었으나, aminoglycosides 계열인 gentamicin, streptomycin, neomycin, amikacin, 및 kanamycin과 다이하드로 엽산염 환원효소(DHFR, dihydrofolate reductase)를 억제하는 trimethoprim/sulfamethoxazole 그리고 펩타이드 전이를 저해하여 세균의 용균 현상을 유발하는 amoxicillin+clavulanic acid 등 13종에 대한 항생제에 대해서는 내성을 지니고 있음을 확인하였다(Table 2). de Oliveira Vieira 등의 연구[8]에 의하면 프로바이오틱스 특성을 가지는 P.
SRCM102607의 내산성 조사 결과 초기 접종균수와 비교하였을 때 pH 3.0까지는 생존률에 대한 산의 영향이 크지 않았으며, 특히 pH 2.0에서도 1.54×105 CFU/ml의 생균수를 나타내었다(Fig. 2).
SRCM102607의 면역활성 결과는 Fig. 3과 같이 171.86±4.00 ng/ml의 TNF-α 생성량을 나타내었고, 양성 대조구인 LPS (lipopolysaccharide)는 192.93±5.64 ng/ml, 오직 배지만 사용한 음성 대조구는 8.00±0.23 ng/ml의 생성량을 보였다.
계통분석을 위한 evolutionary distance 추론을 위해 근린결합법(neighbor-joining method)을 사용하였으며, bootstrap 분석을 1,000회 반복수행하여 계통수의 신뢰도를 확보하였다. 그 결과 SRCM102607 균주는 P. acidilactici DSM 20284 균주와 99.62%의 상동성을 보여(Fig. 1) P. acidilactici SRCM102607로 명명하였으며, 한국미생물보존센터 (KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 P. acidilactici KCCM 12246P로 기탁하였다.
하지만 장내 유산균 중 담즙산 분해효소(BSH)를 갖는 경우 소장에서의 콜레스테롤 흡수를 저하시키며, 탈포합된 담즙산의 경우 지질 용해도가 낮아 지질의 혈중 이행을 저하시킨다고 보고되고 있다[18]. 따라서, 선별 균주를 대상으로 측정한 결과 SRCM102607과 SRCM 103292가 담즙산과 결합한 형태인 글리코콜산에 대한 분해활성을 갖는 것으로 확인되었으며, 앞선 실험결과를 토대로 항균활성, 항산화 활성, 용혈성 및 bile salt hydrolase 활성이 가장 우수한 SRCM102607을 최종 균주로 선정하였다.
따라서, 선별한 5종의 균주를 대상으로 항산화 활성을 측정한 결과(Table 1) P. acidilactici SRCM102607이 39.81±0.23%로 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었으며, 강 등[14]에 의해 보고된 P. acidilactici KL-6 균주의 최대활성인 17%보다도 우수하여 가축의 산화스트레스 개선 생균제로서의 활용 가능성을 확인하였다.
또한 유당불내증을 완화시킬 수 있는 βgalactosidase 활성도 보유하고 있었으며, 발암에 관련된 βglucuronidase는 나타나지 않아 안전성 또한 우수함을 확인하였다.
flexneri까지 총 5종의 가축 유해 미생물에 대한 항균활성을 추가로 조사하였다. 분리주 대부분은 유해 미생물에 대해 활성을 보유하고 있었으며 SRCM102283, SRCM102607, SRCM103292, SRCM103307, SRCM103456 5종이 가축 유해 미생물에 대해 높은 항균활성을 나타내어(Table 1), 가축 유해 병원균에 대한 억제 효과가 우수함을 확인하였다.
후속연구
따라서, SRCM102607의 뛰어난 TNF-α 생성량을 기초 자료로, 다른면역 조절 인자에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되며, 나아가 직접 동물에게 적용하였을 때 나타나는 효과에 대한 연구를 추가로 진행한다면 면역 증진용 생균제로써도 축산업에 적용 충분한 활용 가능성이 있음을 확인하였다.
0 ng/ml으로 SRCM102607의 TNF-α 생성량이 높았다. 하지만 KFT18은 일정한 fraction만을 가지고 측정한 결과였으나 SRCM102607은 균주상등액만으로 측정하였기 때문에 향후 해당물질의 분리 정제를 진행하여 측정한다면 결과 수치는 더 높게 나타날 것으로 추측된다. 또한, 본 실험과 동일하게 미생물 배양 상등액으로 측정한 Kim 등의 연구[15]에서는 여러 Lactobacillus 속의 TNF-α 생성량은 KCTC 3149가 29.
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