선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 저자는 실비산의 이와 같은 효능이 비만 치료에 효과가 있을 것으로 생각하여 이 연구를 시작하게 되었다. 저자는 실비산의 항산화와 지방축적 억제에 미치는 영향과 비만을 유도한 생쥐의 지질 축적에 대한 연구를 하였으며 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Pancreatic lipase 활성 억제는 Kim 등11)의 방법을 응용하여 측정하였다. Enzyme buffer (10 mM 3-(N-Morpholino) propanesulfonic acid, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, pH 6.
- 다음으로 실비산의 3T3-L1 지방세포에 미치는 영향, 세포 독성 유무, pancreatic lipase 활성 저해, lipolysis 글리세롤 배출량, 혈청 지질인자 및 지질 과산화물 등을 측정하였다.
- 먼저 실비산의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH 와 ABTS 라디칼 소거 활성 효과와 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정하였다. DPPH assay는 짧은 시간 내에 항산화 효과를 측정할 수 있는 방법으로 천연물로부터 항산화 물질을 탐색하는데 많이 이용되고 있다24).
- 실비산의 항산화 효능을 알아보기 위해 ABTS free radical 소거능을 측정하였다8). 7 mM ABTS 용액과 2.
- 실험군은 일반사료(조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 항생제 무첨가; 삼양사)를 급여한 정상군(normal), 60% high fat diet (HFD; Diet 12492; Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA)를 급여하고 증류수를 투여한 대조군(control), 60% HFD를 급여하고 SSW를 200 mg/kg 투여한 약물군 Silbi-san water extract administration group (SSWG), 60% HFD를 급여하고 SSE를 200 mg/kg 투여한 약물군 Silbi-san 30% ethanol extract administration group (SSEG)으로 총 4군으로 각 군당 난괴법으로 10마리씩 배속시켰다. 고지방 식이군에게 매일 약물을 증류수에 녹여 일정한 시각에 7일간 존데(zonde)를 이용하여 경구투여하였다(Table II).
- 지질대사 과정에서의 실비산의 작용을 살펴보기 위해 혈청 지질 인자를 측정하였다. 혈청 내 triglyceride 함량은 대조군 50.
- 따라서 lipase 활성의 저해는 체내 지방흡수를 억제시켜 지방을 대변으로 배출한다35). 체내지방의 흡수와 분해에 관한 효과를 검증하기 위해 pancreatic lipase 활성 억제 실험과 Ex vivo lipolysis 글리세롤 배출량을 측정하였다. Pancreatic lipase 활성 저해 효과를 검증한 결과, 두 실비산의 농도에 따른 pancreatic lipase 활성 억제는 SSE 가 SSW에 비해 농도 의존적으로 우수하였다(Fig.
대상 데이터
- 5 주령의 수컷 C57BL/6 mouse (오리엔트바이오, 성남, 한국)를 공급받아 물과 항생제를 첨가하지 않은 고형사료(삼양사, 서울, 한국)를 충분히 공급하고, 1주일동안 실험실 환경에 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다. 관례적인 체계로 온도는 22±2℃, 습도는 50±5%, 12시간 명암주기(light:dark cycle)로 조절한 동물 사육실에서 사육하였고 사육실의 관리와 동물실험에 대해 윤리적, 과학적으로 타당성을 검토하고 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인(승인번호: DHU2019-098)을 받았다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS) 및 high-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), penicillin/streptomycin (P/S), trypsin 이상 시약은 Hyclone사(Logan, UT, USA)에서 제품을 구입하였다. Isopropyl alcohol은 Junsei Chemical 사(Tokyo, Japan)에서 구입하였으며, formaldehyde solution은 Duksan Pure Chemicals (안산, 한국)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 기기는 열탕추출기(DWT-1800T; 대웅바이오, 화성, 한국), rotary vacuum evaporator (Buchi B-480; Flawil, Switzerland), deep-freezer (Sanyo Co., Osaka, Japan), 동결건조기(FD5508; 일신, 동두천, 한국), 냉장고속원심분리기(Mega17R, 한일과학, 김포, 한국), vortex mixer 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 실비산의 구성 한약재는 『東醫寶鑑』6)에 의거하여 옹기한약국(대구, 한국)에서 구입한 것을 생약규격집에 맞추어 약전규격에 합격한 것만을 사용하였다(Table I). 실비산 159.
- 지방세포 3T3-L1 세포주는 American type culture collection (ATCC; Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 세포는 37℃, 5% CO2 배양기(HERA Cell 150; Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL, USA)에서 10% BCS, 1% P/S를 포함한 DMEM 배지를 처리하여 8일간 배양하였으며 배양시킨 후 배양액을 분화유도 배양액(10% FBS, 1 mg/mL insulin, 0.1 mg/mL Dex, 11.1 mg/mL IBMX)으로 바꾸고 2일간 배양하였다. 2일 후 분화유도 배양액(10% FBS, 1 mg/mL insulin)으로 교환하고 2일간 배양시킨 뒤 insulin을 첨가하지 않은 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 배양하였다.
데이터처리
- 모든 수치는 mean±standard error of the mean으로 표시하였으며, SPSS program for windows version 22 (IBM Co., Armonk, NY, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance로 검정한 후 각 자료의 통계적 유의성은 Dunnett's multiple comparison test로 검증하였고, 대조군과 투여군 사이에 p-value<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 3T3-L1 세포를 96 well plate에 2×106 cells/mL 세포를 분주하여 안정화시킨 후 실비산 추출물을 각 농도(100, 250, 500, 1000, 2000 μg/mL)별로 처리하여 MTT분석법을 이용하였다. 실비산 추출물을 처리하여 24시간 배양하였으며 배지를 제거하고 MTT시약을 처리하고 4시간 반응시킨 뒤 DMSO 200 μL를 가하였다.
- 3T3-L1 세포에서 실비산 추출물이 지방축적에 대한 영향을 확인하기 위하여 Oil red O 염색법을 수행하였다. 세포 분화 중에 실비산 추출물을 각각의 농도(100μg/mL)별로 2일 주기로 한 번씩 배지를 교환하며 처리하였다.
- 3T3-L1세포에 100-2,000 μg/mL 농도의 SSW와 SSE 를 각각 처리하고 MTT 염색법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 대조군과 비교하였을 시 전 실험농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.
- 실비산의 free radical 소거능 측정을 위해 DPPH free radical 소거법을 이용하였다7). 0.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법9)을 이용하여 측정하였다. 각 실비산 10 μL (100 μL/mL)과 distlled water 790 μL 및 Folin-Ciocalteau’s phenol reagent 50 μL를 혼합하여 실온에서 1분간 반응시킨다.
- 총 플라보노이드 함량은 Lister 등10)의 방법을 이용하여 측정하였다. 추출한 실비산 100 μL (11.
- 체내에 불포화지방산과 활성산소종이 결합하면서 일어나는 지질 과산화는 산화적 스트레스의 지표로 쓰이는데 이 과정에서 생성되는 malondialdehyde (MDA)를 측정함으로써 지질 과산화를 간접적으로 평가할 수 있다. 혈청 지질과산화(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)는 Mihara와 Uchiyama의 방법을 사용하여 측정 하였다13). 흡광도는 UV 분광광도계로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 1. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하여 실비산의 농도 의존적 소거능 증가를 확인하였다.
- 2. SSE가 SSW보다 실비산의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 더 높게 나타났다.
- 3. 실비산 처리군이 대조군에 비해서 3T3-L1 세포에서 지방축적의 정도가 감소하였고 3T3-L1 세포의 전 실험농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.
- 5. Pancreatic lipase 활성 억제는 SSE가 SSW에 비해 농도 의존적으로 우수하였다.
- 7. 혈청 중성지방 함량은 대조군에 비해 감소했으나 유의성이 없었고, 혈청 총콜레스테롤 함량과 혈청 LDL-cholesterol 함량은 대조군에 비해 SSEG에서 유의적으로 감소하였으며 혈청 HDL-cholesterol 함량은 대조군에 비해 SSWG, SSEG에서 유의하게 증가했다.
- 8. 실비산 투여는 혈청 지질 과산화물을 감소시켰고, 특히 SSEG에서 유의하게 감소했다.
- Pancreatic lipase 활성 저해 효과를 검증하기 위해 SSW 과 SSE의 처치 후 비교 분석한 결과 SSW과 SSE의 농도에 따른 pancreatic lipase 활성 억제는 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 5).
- 체내지방의 흡수와 분해에 관한 효과를 검증하기 위해 pancreatic lipase 활성 억제 실험과 Ex vivo lipolysis 글리세롤 배출량을 측정하였다. Pancreatic lipase 활성 저해 효과를 검증한 결과, 두 실비산의 농도에 따른 pancreatic lipase 활성 억제는 SSE 가 SSW에 비해 농도 의존적으로 우수하였다(Fig. 5).
- SSW과 SSE의 지방분해효과를 fat pad를 이용하여 ex vivo lipolysis 실험을 통해 확인한 결과 지방분해가 1 μg/mL의 농도에서 유의하게 촉진되었다(Fig. 6A). 1 μg/mL의 농도에서의 글리세롤 배출량(mg/dL/hr) 은 Control 11.39±0.16에 비해 Isoproterenol 26.32±0.02, SSW 16.81±0.11, SSE 18.01±0.08로 유의하게 감소되었다(Fig. 6B).
- 분화된 3T3-L1 지방세포에 실비산을 처리한 Oil red O 염색에서 SSW와 SSE를 처리한 군에서는 대조군에 비해서 지방축적의 정도가 감소한 것으로 관찰되었으며 SSE가 SSW보다 지방축적 억제 효능이 더 효과적인 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 실비산의 총 폴리페놀 및 플라보노이드를 측정한 결과, 총 폴리페놀 함량은 SSW 22.69±0.16 mg/g, SSE 24.22±0.08 mg/g으로 나타났으며, 총 플라보노이드 함량은 SSW 4.68±0.17 mg/g, SSE 5.16±0.08 mg/g으로 나타났다 (Table III).
- 실험에 사용된 실비산의 항산화 활성을 확인하기 위해 ABTS 소거능을 측정한 결과, 농도 의존적으로 ABTS 소거능이 증가하였다. ABTS 소거능을 IC50값으로 나타내었을 때 SSW 287.
- 실험에 사용된 실비산의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 농도 의존적으로 DPPH 소거능이 증가하였다. DPPH 소거능을 IC50값으로 나타내었을 때 SSW 252.
- 이상의 결과에서 실비산 추출물은 DPPH 라디칼 소거 활성, ABTS 라디칼 소거 활성이 우수한 것으로 관찰되었고, 일정량 이상의 폴리페놀 및 플라보노이드를 함유하고 있어 항산화 효과가 있다고 생각한다. 또한 세포 독성이 없으며, 3T3-L1 세포에서 지방축적을 억제하는 효능, Pancreatic lipase 활성 저해 효과, 글리세롤 배출 촉진작용이 있었다.
- 5). 지방분해효과를 fat pad를 이용한 ex vivo lipolysis 실험을 통해 확인한 결과 지방이 분해된 글리세롤 배출량이 1 μg/mL의 농도에서 유의성 있게 촉진되는 것을 확인하였다(Fig. 6).
후속연구
- 이상의 결과를 볼 때 실비산은 항산화 효능과 지방축적 억제 효과가 있어서 향후 추가적인 연구를 통해 비만을 예방하고 치료하는데 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 또한 세포 독성이 없으며, 3T3-L1 세포에서 지방축적을 억제하는 효능, Pancreatic lipase 활성 저해 효과, 글리세롤 배출 촉진작용이 있었다. 혈청 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-cholesterol, 지질 과산화물을 감소시켰고, HDL-cholesterol을 증가시키는 효과와 체지방의 축적을 억제하고 배설을 촉진하는 효과가 있었으므로 향후 비만 치료 연구에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.