[논문]Clostridium difficile에 대한 항균 한약재 탐색 연구

성은학; 임수경; 이명종; 김호준

doi:10.18325/jkmr.2021.31.1.47

Clostridium difficile에 대한 항균 한약재 탐색 연구
A Study of Antimicrobial Activity of Herbal Extracts on Clostridium difficile 원문보기

Journal of Korean Medicine Rehabilitation : JKMR = 한방재활의학과학회지, v.31 no.1, 2021년, pp.47 - 57

성은학 (동국대학교 한의과대학 한방재활의학과교실) , 임수경 (동국대학교 한의과대학 한방재활의학과교실) , 이명종 (동국대학교 한의과대학 한방재활의학과교실) , 김호준 (동국대학교 한의과대학 한방재활의학과교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives This study was conducted to confirm the possibility of Clostridium difficile infection (CDI) treatment through natural herbal medicines. Methods After screening a total of 77 herbal medicines through the paper disc agar diffusion method, we selected the herbal medicines that showed a effectiveness compared to the positive control vancomycin. Afterwards, drugs that showed inhibitory effects compared to C. difficile without inhibition of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus plantarum, known as beneficial bacteria, were selected and minimal inhibitory concentration (MIC) was confirmed by applying the Broth microdilution method. Results The Coptidis Rhizoma, well known for its antimicrobial effect, was found to have antimicrobial effects on C. difficile, but also had inhibitory effects on the beneficial bacterium B. bifidum. 30% ethanol extraction Crataegi fructus, Corni fructus and Mume fructus had antimicrobial effects on C. difficile without inhibiting the beneficial bacteria B. bifidum and L. plantarum. The MIC values of 30% ethanol extraction Crataegi fructus, Corni fructus and Mume fructus were found to be 10 mg/mL, 20 mg/mL and 5 mg/mL, respectively. Conclusions Crataegi fructus, Corni fructus and Mume fructus were identified as candidate medicines for C. difficile. Further researchs will need to be done in vivo, and to find an optimal extraction method accompanied by economic evaluation.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

difficile의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다¹⁾. 본 연구에서는 C. difficile을 억제하는 한편, pro- biotics인 B. bifidum 및 L. plantarum을 억제하지 않은 약물을 찾는 것을 목표로 하였으며 더불어 상재균 중 하나인 Bacteroides fragilis에 미치는 영향을 알아보고자 하였다^{26, 27)}.
이에 천연 한약재를 통한 CDI 치료의 가능성을 확인하고자 본 연구를 시행하였다.

제안 방법

PCR에 사용한 kit는 AccuPower PCR PreMix kit (K-2016; Bioneer, Daejeon, Korea)로 제조사의 지침에 따라 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel 에 분리하여 100 V에서 3분, 50 V에서 2분 전기영동 한 후 UV illumination (LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)을 사용하여 밴드를 확인하였다.
RCM agar plate에서 배양된 C. difficile, Bacteroides fragilis와 MRS agar plate에서 배양된 L. plantarum, B. bifidum colony 1개를 각각의 배양액 5 mL에 접종한 후 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 각 미생물 배양액 2 mL 을 원심분리하고 상층액은 제거한 후 분리한 균주의 pellet에서 QIAamp fast DNA stool mini kit (51604; QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 genomic DNA를 추출하였다.
bifidum colony 1개를 각각의 배양액 5 mL에 접종한 후 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 각 미생물 배양액 2 mL 을 원심분리하고 상층액은 제거한 후 분리한 균주의 pellet에서 QIAamp fast DNA stool mini kit (51604; QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 genomic DNA를 추출하였다.
bifidum에 대하여생육저지환 ++ (12~16 mm)의 억제 효과가 확인되었다. 따라서 최종 후보 약물로 산사, 산수유, 오매를 선정하여 MIC 측정을 시행하였으며, 각각의 MIC는 10 mg/mL, 20 mg/mL, 5 mg/mL로 확인되었다.
생육저지환이 + (8~12 mm) 이상으로 C. difficile 대비 항균 효과가 확인된 25종의 약물을 대상으로 하여 상재균인 Bacteroides fragilis 및 유익균인 B. bifidum, L. plantarum 관련 항균시험을 시행하였다. Bacteroides fragilis에 항균력을 보인 약물로 감국, 건강, 광곽향, 금은화 등 19종이 확인되었으며, B.
약물추출용액을 만들기 위하여 20 mg의 약물 추출물을 18 μL dimethyl sulfoxide (DMSO)와 42 μL phosphate buffered saline (PBS) 를 추가하여 용해시켰다. 약물을 녹인 용매에 대한 영향을 알아보기 위한 대조군으로 30% DMSO를 사용하였다.
difficile 대비 항균 효과를 보일 것으로 예상되는 후보 약물 77종을 선정하였다(Table Ⅱ). 양성대조군으로 선정된 vancomycin의 C. difficile 대비 항균시험 시행 후 생육저지환(clear zone)이 22 mm로 20 mm를 초과한 0.63 mg/mL을 적정 농도로 설정하였다 (Table Ⅲ). Paper disc agar diffusion method를 통한 C.
04 mg/mL 농도까지 희석한 후 100 μL씩 분주하였다. 이후 24시간 배양한 후 C. difficile의 증식에 미치는 영향을 650 nm에서 ELISA reader을 이용하여 측정하였다.
최종 후보 약물의 MIC 측정을 위해 Broth microdilution method를 응용하였다²²⁾. 먼저 C.
최종 후보로 산사, 산수유, 오매를 선정하여 MIC test를 시행하였다. 시험 결과, 각각의 MIC는 산사는 10 mg/mL, 산수유는 20 mg/mL, 오매는 5 mg/mL로 확인되었다 (Table Ⅵ).
plantarum 에 대하여 생육저지환 +++ (16~20 mm)의 억제 효과가 확인되어 최종 후보에서 제외하였다. 황련은 95% 에탄올 추출물과 증류수 추출물 모두에서 유익균 중 B. bifi- dum에 대하여 생육저지환 +++ (16~20 mm)의 억제 효과가 확인되었으나, 각각의 균주에 대한 억제효과가 vancomycin과 유사한 형태를 보였으며, 95% 에탄올 추출물과 증류수 추출물에 따른 C. difficile 억제 효과에 차이가 보여 산사, 산수유, 오매와 더불어 30% 에탄올 추출물을 제조하여 항균시험을 시행하였다. 30% 에탄올 추출물로 시험을 진행한 결과 산사, 산수유, 오매가 C.

대상 데이터

77종의 생약 추출물은 한국식물추출물은행(Cheongju, Korea)에서 분양받았다. 식물 추출물의 항균성은 일반적으로 에탄올 추출물이 증류수 추출물보다 증식억제 효과가 높다는 점을 참고하여 95.
C. difficile 관련 항균력이 생육저지환 +++ (16~20 mm) 이상으로 확인된 산사, 산수유, 오매, 통초, 황련이 후보물질로 선정되었다. 통초의 경우 유익균인 B.
동국대학교 일산한방병원에서 구입한 산사, 산수유, 오매, 황련 각 4 g을 분쇄하여 10배량의 30% 에탄올을 첨가한 후 60℃ water bath에서 sonication하였다. 이후 3, 000 rpm에서 1시간가량 원심분리하는 과정을 3회 반복한 후 상층액을 회수하고, 40℃에서 농축하여 3일간 동결건조시켰다.
본 연구를 위하여 C. difficile 대비 항균 효과를 보일 것으로 예상되는 후보 약물 77종을 선정하였다(Table Ⅱ). 양성대조군으로 선정된 vancomycin의 C.
difficile KCTC 5009, Bacteroides fragilis KCTC 3688, 쎌바이오텍(Kimpo, Korea)에서 분양받은 Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum 을 이용하였다. 생육배지로 C. difficile, Bacteroides fra- gilise reinforced clostridial medium agar (RCM agar; BD Difco 218081)을, B. bifidume MRS-cysteine (MRS supplemented with cysteine 0.5 g/L) agar (1.5%)을, L. plantarume MRS agar (1.5%)을 이용하여 배양하였다.
실험에 사용된 균주는 생물자원센터(Jeongeup, Korea) 에서 분양받은 C. difficile KCTC 5009, Bacteroides fragilis KCTC 3688, 쎌바이오텍(Kimpo, Korea)에서 분양받은 Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum 을 이용하였다. 생육배지로 C.
difficile 대비 생육저지환 + (8~12 mm) 이상의 항균 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 이들 중 산사, 산수유, 오매, 통초, 황련이 C. difficile 대비 생육저지환 +++ (16~20 mm) 이상으로 타 약물 대비 강력한 억제 효과를 보여 후보로 선정되었다. 통초의 경우 95% 에탄올 추출물과 증류수추출물 모두에서 probiotics인 B.
0% 에탄올로 추출한 약물을 우선 구입하되 증류수로 추출한 약물이 분양 가능한 경우 함께 구비하였다^17-19). 후보 한약재로 선정된 산사, 산수유, 오매, 황련은 동국대학교 일산 한방병원에서 구입 후 사용하였다.

이론/모형

PCRe template genomic DNA 1 μL (50 ng), pri- mer는 forward와 reverse 각각 1 μL (10 pmole), distilled water 17 μL를 섞어 reaction volume 20 μL로 수행하였다. PCR에 사용한 kit는 AccuPower PCR PreMix kit (K-2016; Bioneer, Daejeon, Korea)로 제조사의 지침에 따라 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 1.
Vancomycin 및 한약재의 항균 활성은 paper disc agar diffusion method을 이용하여 확인하였다. Vancomycin 의 경우 CDI에 metronidazole과 함께 가장 많이 사용되는 항생제로 양성대조군으로 설정하였다²⁰⁾.

성능/효과

1. 77종 한약재의 C. difficile 대비 효과를 탐색한 결과 감국, 건강, 결명자, 광곽향, 금은화, 대복피, 대황, 맥문동, 목단피, 백선피, 복분자, 산사, 산수유, 세신, 소엽, 여정실, 연교, 오매, 오수유, 우슬, 정공등, 지실, 통초, 현삼, 황련 등 25종의 약물이 생육 저지 환을 형성하여 C. difficile 대비 항균 효과를 보였다.
2. C. difficile 대비 항균력은 전반적으로 증류수 추출물보다 에탄올 추출물에서 증식억제 효과가 높았다.
3. 산사, 산수유, 오매, 통초, 황련이 C. difficile 대비생육저지환 +++ (16~20 mm) 이상으로 vancomycin (0.63 mg/mL)의 ++++ (larger than 20 mm)과 비교하여 준수한 억제 효과를 보였다.
difficile 억제 효과에 차이가 보여 산사, 산수유, 오매와 더불어 30% 에탄올 추출물을 제조하여 항균시험을 시행하였다. 30% 에탄올 추출물로 시험을 진행한 결과 산사, 산수유, 오매가 C. difficile 및 Bacteroides fragilis에 대하여 생육저지환 +++ (16~20 mm) 이상의 억제 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 황련은 C.
4. 통초의 경우 유익균인 B. bifidum 및 L. plantarum 대비 생육저지환 +++ (16~20 mm)으로 억제 효과가 확인되어 후보에서 제외하였다.
5. 황련의 경우 유익균인 B. bifidum에 대하여 생육 저 지환 ++ (12~16 mm)의 억제 효과가 확인되어 후보에서 제외하였다.
6. 30% 에탄올 추출 산사, 산수유, 오매는 유익균 B. bifidum, L. plantarum에 대한 억제 없이 C. difficile 대비 항균 효과를 보였다.
7. 30% 에탄올 추출 산사, 산수유, 오매의 C. difficile 대비 MIC는 각각 10 mg/mL, 20 mg/mL, 5 mg/mL 인 것으로 확인하였다.
8. 본 연구 결과 C. difficile 대비 항균 효과를 가진 산사, 산수유, 오매를 포함한 소화기계 관련 처방으로 桂薑養胃湯이 확인되었다.
plantarum 관련 항균시험을 시행하였다. Bacteroides fragilis에 항균력을 보인 약물로 감국, 건강, 광곽향, 금은화 등 19종이 확인되었으며, B. bifidum에 항균력을 보인 약물로는 목단피, 세신, 소엽, 오매 등 6종이 확인되었고, L. plantarum에 항균력을 보인 약물은 통초 1종으로 확인되었다.
63 mg/mL을 적정 농도로 설정하였다 (Table Ⅲ). Paper disc agar diffusion method를 통한 C. difficile 대비 항균시험 결과, 감국, 건강, 결명자, 광곽향, 금은화, 대복피, 대황, 맥문동, 목단피, 백선피, 복분자, 산사, 산수유, 세신, 소엽, 여정실, 연교, 오매, 오수유, 우슬, 정공등, 지실, 통초, 현삼, 황련 등 25종의 약물이 + (8~12 mm) 이상의 생육저지환을 형성하여 C. difficile 대비 항균 효과가 있는 것으로 확인되었다(Table Ⅳ, Fig. 1).
대황, 목단피, 통초, 황련은 95% 에탄올 추출과 증류수 추출 두 가지 방법으로 얻어졌는데 대황의 경우 C. difficile 관련 항균 효과가 생육저지환 + (8~12 mm)로 동일하였으나, Bacteroides fragilis 관련 항균 효과가 증류수 추출물에서는 확인되지 않은 반면 95% 에탄올 추출물에서는 생육저지환이 ++ (12~16 mm)로 확인되었다. 목단피의 경우에도 95% 에탄올 추출물과 증류수추출물에서 C.
difficile 관련 항균 효과가 생육저지환 + (8~12 mm)로 동일하였으나, Bacteroides fragilis 관련 항균 효과가 증류수 추출물에서는 확인되지 않은 반면 95% 에탄올 추출물에서는 생육저지환이 ++ (12~16 mm)로 확인되었다. 목단피의 경우에도 95% 에탄올 추출물과 증류수추출물에서 C. difficile 관련 항균 효과가 생육저지환 + (8~12 mm)로 동일하였으나 B. bifidum과 관련하여 증류수 추출물에서는 항균 효과가 확인되지 않은 반면 95% 에탄올 추출물에서는 + (8~12 mm)로 확인되었다. 통초 및 황련의 경우 상재균 Bacteroides fragilis 및 유익균 B.
본 연구에서 산사, 산수유, 오매는 CDI 표준 치료 항생제인 vancomycin이 유익균 B. bifidum에 항균작용을 가지는 것과 비교하여 유익균 B. bifidum 및 L. planta- rum에 대한 억제 없이 C. difficile 대비 억제효과를 가지는 것으로 확인되었다. 하지만 vancomycin과 동일하게 상재균인 Bacteroides fragilis 관련 억제 효과를 가지는 것이 관찰되었다.
산사, 산수유, 오매, 황련을 30% 에탄올 추출하여 동일한 시험을 반복한 결과, 산사, 산수유, 오매는 C. difficile 대비 생육저지환 +++ (16~20 mm) 이상의 우수한 항균력을 보인 반면, 황련은 생육저지환 ++ (12~16 mm) 으로 비교적 약한 항균력을 보였으며, 유익균인 B. bifid um 대비 생육저지환 ++ (12~16 mm)의 항균력을 가지는 것으로 확인되어 최종 후보에서 제외하였다(Table Ⅴ, Fig. 3).
시험 결과, 각각의 MIC는 산사는 10 mg/mL, 산수유는 20 mg/mL, 오매는 5 mg/mL로 확인되었다 (Table Ⅵ).
coli, Klebsiella pneumoniae 등의 균주와 관련하여 그 효과가 보고된 바 있다^38-40). 위와 같이 C. difficile에 효과를 보였던 약물인 산사, 산수유, 오매는 한의학적으로 止瀉 혹은 抗菌 작용을 가지는 약물들로 확인되었다.
이번 연구에서 77종의 후보 약물 중 25종이 C. difficile 대비 생육저지환 + (8~12 mm) 이상의 항균 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 이들 중 산사, 산수유, 오매, 통초, 황련이 C.
이와 관련하여 2011년에 혐기성 그람양성 박테리아에 대항하는 fidax- omicin이 미국 식품의약국(Food and Drug Administration) 의 승인을 받아 사용되기 시작하였다. 치료율은 90%로 vancomycin과 유사하였으며 재발률이 15%로 vancomy- cin이 25%인 것과 비교하여 비교적 낮았으나, 앞서 언급한 BI/NAP1/027 균주에게서는 재발률이 38%로 확인되었으며, 비용이 vancomycin보다 비싸다는 단점이 존재하여 여전히 사용이 제한되고 있다⁷⁾.
bifidum과 관련하여 증류수 추출물에서는 항균 효과가 확인되지 않은 반면 95% 에탄올 추출물에서는 + (8~12 mm)로 확인되었다. 통초 및 황련의 경우 상재균 Bacteroides fragilis 및 유익균 B. bifidum, L. plantarum 대비 항균 효과가 95% 에탄올 추출물 및 증류수 추출물에서 동일하였으나, C. difficile 대비 항균 효과가 95% 에탄올 추출물이 증류수 추출물에 비해 더 높은 것으로 확인되었다(Table Ⅳ, Fig. 2).
difficile 대비 억제효과를 가지는 것으로 확인되었다. 하지만 vancomycin과 동일하게 상재균인 Bacteroides fragilis 관련 억제 효과를 가지는 것이 관찰되었다. 장내 미생물이 어떠한 기전으로 C.
황련은 중국에서 식물성 항균물질로 각광받고 있는 대표적인 淸熱약물로써³⁰⁾, berber- ine, jatrorrhizine, palmatine, coptisine 등 항균 효과를 가진 alkaloids를 포함하고 있으며 Streptococcus aga- lactiae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium 등의 균주를 억제하는 것으로 알려져 있다^{31, 32)}. 하지만 본연구에서는 C. difficile 억제 효과가 산사, 산수유, 오매와 비교하여 상대적으로 낮았으며, 양성대조군인 van- comyicn과 동일한 패턴으로 유익균인 B. bifidum에 대해서 억제 효과가 확인되어 C. difficile 항균 약물로써 우위를 점하기는 어려운 것으로 판단되었다.
difficile 및 Bacteroides fragilis에 대하여 생육저지환 +++ (16~20 mm) 이상의 억제 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 황련은 C. difficile 및 Bacteroides fragilis에대하여 생육저지환 ++ (12~16 mm)로 상대적으로 낮은 억제 효과를 보였으며, 유익균인 B. bifidum에 대하여생육저지환 ++ (12~16 mm)의 억제 효과가 확인되었다. 따라서 최종 후보 약물로 산사, 산수유, 오매를 선정하여 MIC 측정을 시행하였으며, 각각의 MIC는 10 mg/mL, 20 mg/mL, 5 mg/mL로 확인되었다.

후속연구

difficile 에 직접 억제 효과를 보이는 것만으로 CDI에 효과가 있다고 확신하기는 어렵다. 따라서 추후 연구는 생체투여 시에 나타나는 효과에 대한 연구가 추가되어야 할 것이다. 마지막으로 본 연구에서 증류수, 에탄올 등 추출 용매의 종류 및 용매 농도에 따른 항균 효과의 차이가 관찰되었기 때문에 경제성 평가를 동반한 최적의 추출방식을 찾는 연구가 시행되어야 할 것이다.
따라서 추후 연구는 생체투여 시에 나타나는 효과에 대한 연구가 추가되어야 할 것이다. 마지막으로 본 연구에서 증류수, 에탄올 등 추출 용매의 종류 및 용매 농도에 따른 항균 효과의 차이가 관찰되었기 때문에 경제성 평가를 동반한 최적의 추출방식을 찾는 연구가 시행되어야 할 것이다.
. 본 연구결과 C. difficile 관련하여 항균 효과가 있다고 밝혀진 산사, 산수유, 오매를 포함한 소화기계 관련 처방으로 胃腸諸疾을 主治하는 桂薑養胃湯이 확인되었으며⁴³⁾ 추후 CDI 관련 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이상의 결과로 보아 산사, 산수유, 오매가 유익균 B. bifidum, L. plantarum에 대한 억제 없이 C. difficile에 항균 효과를 보인다는 것을 확인하였으며 추가적 연구를 통해 C. difficile 치료 후보 물질로써 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

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Korean Traditional Knowledge Portal [Internet]. [cited 2020 Oct 27]. Available from: https://www.koreantk.com/ktkp2014/prescription/prescription-view.view?preCdP0019860.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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