[논문]Taxus chinensis 유래 파클리탁셀 정제를 위한 초음파를 이용한 마이셀 추출

박지민; 김진현

doi:10.9713/kcer.2021.59.1.106

Taxus chinensis 유래 파클리탁셀 정제를 위한 초음파를 이용한 마이셀 추출
Ultrasound-Assisted Micellar Extraction for Paclitaxel Purification from Taxus chinensis 원문보기

Korean chemical engineering research = 화학공학, v.59 no.1, 2021년, pp.106 - 111

초록
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본 연구에서는 식물세포 Taxus chinensis로부터 항암물질 파클리탁셀을 효율적으로 정제하기 위하여, 초음파 기반 마이셀 추출 공정을 개발하였다. 전통적 마이셀 공정(대조군)에서의 많은 추출 단계 및 긴 상 분리 시간 문제를 획기적으로 개선하였다. 초음파 파워 180 W, 초음파 조사 1.5 시간에서 가장 높은 파클리탁셀 수율(~96%, 2회 추출)을 얻었으며, 이는 대조군의 수율에 비해 24.7% 증가하였다. 또한 분배 계수(K)는 초음파 파워 180 W, 초음파 조사 1.5 시간에서 최대치(24.0)를 보였다. 파클리탁셀 순도에는 큰 차이가 없었으며, 초기 파클리탁셀의 순도(6.81%)가 정제 후 22%까지 증가하였다. 역 추출(back extraction)의 상 분리 시간은 대조군 대비 각각 40.7-56.2%(초음파 파워 80 W), 46.3-67.6%( 초음파 파워 180 W), 51.9-67.6%(초음파 파워 250 W) 감소하였다. 초음파 파워(80-250 W)와 초음파 조사 시간(0.5-2.5 시간)이 증가할수록 상 분리 시간이 감소하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, an ultrasound-assisted micellar extraction process was developed to efficiently purify the anticancer substance paclitaxel from the plant cell Taxus chinensis. The problem of many extraction steps and long phase separation time in the traditional micellar process could be dramatically improved. The highest paclitaxel yield (~96%, extracted twice) was obtained at 180 W of ultrasonic power and 1.5 h of ultrasonic irradiation time, which was 24.7% higher than that of the traditional method. In addition, the partition coefficient (K) showed a maximum value (24.0) at 180 W of ultrasonic power and 1.5 h of irradiation time. There was no significant difference in the purity of paclitaxel, and the purity of initial paclitaxel (6.81%) increased to 22.0% after purification. Compared to the traditional method, the phase separation time of the back extraction decreased by 40.7-56.2% (ultrasonic power 80 W), 46.3-67.6% (ultrasonic power 180 W), and 51.9-67.6% (ultrasonic power 250 W), respectively. The phase separation time decreased as the ultrasonic power (80-250 W) and irradiation time (0.5-2.5 h) increased.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Schematic diagram of forward extraction (A) and back extraction in the micellar extraction process.
그림 Fig. 2. Effect of ultrasound on the yield of paclitaxel at different ultrasonic irradiation times (0.5 h, 1.5 h, and 2.5 h): (A); Ultrasonic power 80 W, (B); Ultrasonic power 180 W, and (C); Ultrasonic power 250 W.
표 Table 1. Partition coefficient (K) of paclitaxel at different ultrasonic powers and irradiation times
그림 Fig. 3. Effect of ultrasound on the purity of paclitaxel at different ultrasonic irradiation times (0.5 h, 1.5 h, and 2.5 h): (A); Ultrasonic power 80 W, (B); Ultrasonic power 180 W, (C); Ultrasonic power 250 W, and (D); Average purity.
그림 Fig. 4. Effect of ultrasound on the back extraction time at differ-ent ultrasonic irradiation times (0.5 h, 1.5 h, and 2.5 h): (A); Ultrasonic power 80 W, (B); Ultrasonic power 180 W, and (C); Ultrasonic power 250 W.

AI 본문요약
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문제 정의

하지만 초음파를 이용한 마이셀 추출에 대한 연구는 여전히 부족한 실정이며, 더욱이 초음파를 이용한 파클리탁셀의 마이셀 추출에 대한 연구는 전 무한실정이다. 따라서 본 연구에서는 바이오매스 유래 파클리탁셀의 전처리를 위하여 계면활성제를 이용한 마이셀 공정에서 초음파의 영향에 대해 자세히 조사하였다. 이를 통해 기존 마이셀 공정, 특히 역 추출(back extraction) 단계에서의 많은 추출 횟수와 긴 상 분리 시간 문제를 획기적으로 개선하고자 하였다.
본 연구에서는 식물 세포 Taxus chinensis로부터 파클리탁셀을 효율적으로 정제하기 위하여, 초음파를 이용한 마이셀 추출로 다단계 추출과 긴 상 분리 시간 문제를 획기적으로 개선하였다. 초음파파워 180 W, 초음파 조사 시간 1.
따라서 본 연구에서는 바이오매스 유래 파클리탁셀의 전처리를 위하여 계면활성제를 이용한 마이셀 공정에서 초음파의 영향에 대해 자세히 조사하였다. 이를 통해 기존 마이셀 공정, 특히 역 추출(back extraction) 단계에서의 많은 추출 횟수와 긴 상 분리 시간 문제를 획기적으로 개선하고자 하였다. 이러한 연구결과는 바이오매스 유래 파클리탁셀 정제에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

제안 방법

본 연구는 기존 연구결과[8, 11, 13]의 최적의 조건에서 수행하였다. 계면활성제는 CPC, CPC 농도는 5%, 유기 용매는 MtBE/ Hexane 혼합 용액, 혼합 비율은 1/1(v/v), 초기 파클리탁셀의 농도는 16.4 mg/mL로 각각 정하였다.
메탄올 추출액을 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 감압 하에 농축(원액의 30%)하고 메틸렌 클로라이드를 첨가(농축액의 25%)하여 상온에서 30분 동안 교반 후 정체 시켜 상 분리를 유도하였다. 극성불순물이 포함된 상층의 메탄올층을 제거한 후, 하층인 메틸렌 클로라이드 층은 회수하여 농축기를 이용하여 감압상태에서농축/건조하였다[13]. 건조된 시료의 순도는 6.
반복하여 추출하였다. 메탄올 추출액을 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 감압 하에 농축(원액의 30%)하고 메틸렌 클로라이드를 첨가(농축액의 25%)하여 상온에서 30분 동안 교반 후 정체 시켜 상 분리를 유도하였다. 극성불순물이 포함된 상층의 메탄올층을 제거한 후, 하층인 메틸렌 클로라이드 층은 회수하여 농축기를 이용하여 감압상태에서농축/건조하였다[13].
배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여 먼저 데칸더 원심분리기(>4, 500g) (Westfalia, CA 150 Clarifying Decanter)를 이용하여 1차 회수하였으며, 입자가 작은 식물세포 조각(debris) 회수를 위하여 고속 원심분리기(>10, 000g) (α-Lavel, BTRX 205GD-35 CDEFP)를 이용하여 2차 회수하였다. 회수한 식물 세포와 세포 조각을 합하여 바이오매스라 하였다.
따라서 식물세포인 바이오매스로부터 유기용매 추출액을 건조하여 상 분리에 적합한 유기용매에 녹인 후 마이셀 형성에 적합한 계면활성제를 첨가하고 교반한 후 정체 시키면 물에 녹지 않는 파클리탁셀이 마이셀 내부의 소수성 그룹에 감싸여 수용액 상으로 이동하고 파클리탁셀을 제외한 여러가지 불순물들(특히 pigments, liquid 성분들)은 유기용매 상에 그대로 존재하게 되어 파클리탁셀과 불순물을 효율적으로 분리하게 된다. 본 실험에서는 초음파가 마이셀 공정(특히 역 추출)에 미치는 영향(파클리탁셀 수율, 순도, 상 분리 시간)을 조사하였다. 본 연구는 기존 연구결과[8, 11, 13]의 최적의 조건에서 수행하였다.
본 연구에서 제안한 전처리 공정은 계면활성제를 이용한 마이셀 형성과 상 분리에 의하여 불순물을 제거하는 새로운 개념의 전 처리 공정이다(Fig. 1). 마이셀은 친수성 그룹(hydrophilic group) 과소수성 그룹(hydrophobic group)으로 구성되어 있어 마이셀 내부로는 물에 녹지 않는 파클리탁셀을 소수성 그룹이 감싸게 되고 외부는 친수성 그룹이 되어 수용액에 용해될 수 있게 된다.
일정 시간 교반 후 정체시켜 마이셀 형성과 상 분리(phase separation)를유도하였다. 상 분리가 일어나면 마이셀이 형성되어 있는 하층 (bottom phase)인 CPC 용액 층을 회수하였으며 동일한 조건으로 2 회 반복 추출을 수행하였다. 역 추출(back extraction): 2회 반복 추출을 통하여 회수한 CPC 용액에 다시 MtBE를 넣어 상 분리하고 하층인 CPC 용액으로부터 마이셀을 분해시켜 상층(top phase)인 MtBE 층으로 파클리탁셀을 회수하였으며 동일한 조건으로 2회 반복 추출을 수행하였다.
식물세포 배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1:1(w/v)로 하여 상온(room temperature)에서 30분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4회 반복하여 추출하였다. 메탄올 추출액을 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 감압 하에 농축(원액의 30%)하고 메틸렌 클로라이드를 첨가(농축액의 25%)하여 상온에서 30분 동안 교반 후 정체 시켜 상 분리를 유도하였다.
상 분리가 일어나면 마이셀이 형성되어 있는 하층 (bottom phase)인 CPC 용액 층을 회수하였으며 동일한 조건으로 2 회 반복 추출을 수행하였다. 역 추출(back extraction): 2회 반복 추출을 통하여 회수한 CPC 용액에 다시 MtBE를 넣어 상 분리하고 하층인 CPC 용액으로부터 마이셀을 분해시켜 상층(top phase)인 MtBE 층으로 파클리탁셀을 회수하였으며 동일한 조건으로 2회 반복 추출을 수행하였다. 초음파 파워에 따른 영향을 조사하기 위하여 초음파 조사 시간(0.
초음파 파워는 파클리탁셀의 분해와 조업 효율을 고려하여 300 W 미만으로 선정하였다[15]. 역 추출에서 파클리탁셀이 포함된 상층 (MtBE 층)을 회수하여 농축하고 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 24시간 건조시킨 후 HPLC로 분석하였다. 마이셀 추출공정의 개략도를 Fig.
81%)을 유기 용매인 MtBE (methyl-t-butyl-ether)에 녹인 후 계면활성제인 CPC (N-cetylpyridinium chloride) 용액과 헥산을 넣고 교반하였다. 일정 시간 교반 후 정체시켜 마이셀 형성과 상 분리(phase separation)를유도하였다. 상 분리가 일어나면 마이셀이 형성되어 있는 하층 (bottom phase)인 CPC 용액 층을 회수하였으며 동일한 조건으로 2 회 반복 추출을 수행하였다.
역 추출(back extraction): 2회 반복 추출을 통하여 회수한 CPC 용액에 다시 MtBE를 넣어 상 분리하고 하층인 CPC 용액으로부터 마이셀을 분해시켜 상층(top phase)인 MtBE 층으로 파클리탁셀을 회수하였으며 동일한 조건으로 2회 반복 추출을 수행하였다. 초음파 파워에 따른 영향을 조사하기 위하여 초음파 조사 시간(0.5, 1.5, 2.5 시간)를 달리하여 40 kHz ultrasonic bath(UC-10, Jeiotech, Korea)에서 초음파 파워(80 W, 180 W, 250 W) 변화에 따른 파클리탁셀 수율, 순도 및 상 분리 시간을 조사하였다. 초음파 파워는 파클리탁셀의 분해와 조업 효율을 고려하여 300 W 미만으로 선정하였다[15].
파클리탁셀 함량 분석을 위해 HPLC 시스템(SCL-10AVP, Shimadzu, Japan)과 Capcell Pak C₁₈ 컬럼(250 mm × 4.6 mm; Shiseido, Japan) 을 사용하였다. 이동상은 아세토나이트릴과 증류수 혼합 용액(65/ 35~35/65, v/v, gradient mode)을 유속 1.

대상 데이터

시료 주입양은 20 μL이며 227 nm에서 UV 검출기에 의해 검출하였다[20]. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 ㈜삼양바이오팜 제품(파클리탁셀 순도: 98.7%)을 사용하였다.
본 실험에 사용된 식물 세포 배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)을 이용하여 배양하였다[20]. 배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여 먼저 데칸더 원심분리기(>4, 500g) (Westfalia, CA 150 Clarifying Decanter)를 이용하여 1차 회수하였으며, 입자가 작은 식물세포 조각(debris) 회수를 위하여 고속 원심분리기(>10, 000g) (α-Lavel, BTRX 205GD-35 CDEFP)를 이용하여 2차 회수하였다.
회수한 식물 세포와 세포 조각을 합하여 바이오매스라 하였다. 본 연구에 사용된 바이오매스는 (주)삼양 바이오팜으로부터 제공받았다.
81%이었다. 제조된 시료를 마이셀 공정에 이용하였다.
5 시간)를 달리하여 40 kHz ultrasonic bath(UC-10, Jeiotech, Korea)에서 초음파 파워(80 W, 180 W, 250 W) 변화에 따른 파클리탁셀 수율, 순도 및 상 분리 시간을 조사하였다. 초음파 파워는 파클리탁셀의 분해와 조업 효율을 고려하여 300 W 미만으로 선정하였다[15]. 역 추출에서 파클리탁셀이 포함된 상층 (MtBE 층)을 회수하여 농축하고 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 24시간 건조시킨 후 HPLC로 분석하였다.

성능/효과

이 과정 중 특히 전처리 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 따라서 전처리 공정을 통하여 시료의 순도를 가능한 높여 주어야 최종 정제, 특히 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용한 정제에서의 비용을 줄일 수 있다.
즉, 캐비테이션 버블의 붕괴 (collapse)로 발생하는 추출 용액에서의 고속 마이크로젯(high- speed microjets), 강렬한 국소 가열(intense localized heating), 고압 충격파(high-pressure shock waves)가 물질 전달을 촉진하기 때문이다. 또한 초음파 조사 시간 2.5 시간에서는 1.5 시간에 비해 수율이 비슷하거나 오히려 조금 감소하는 경향을 보였다. 이는 높은 초음파 파워에 장시간 노출에 따른 파클리탁셀의 분해(degradation) 때문으로 판단된다[17].
0%)의 파클리탁셀을 짧은 상 분리 시간으로 고수율(96%)로 얻을 수 있었다. 또한 초음파-마이셀 공정 전후 시료의 HPLC 크로마토그램을 비교한 결과, 마이셀 공정에서 전 추출(forward extraction)에서 비극성 불순물, 역 추출(back extraction)에서 극성 불순물을 각각 제거하는데 효과적이었다. 마이셀 추출은 화학 및 생화학 산업에서 기존 액-액 추출 시스템을 사용하여 공정을 수행할 수 있기 때문에 대규모 작업에 매력적인 분리 방법이다.
5 시간에서 각각 21, 21, 18%(80 W), 21, 22, 19%(180 W), 19, 20, 17%(250 W)이었다. 전반적으로 평균 순도 20% 전후로 큰 차이가 없었지만 강한 초음파 파워(250 W)에서 장시간(2.5 시간) 조사할 경우 파클리탁셀 순도가 조금 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 수율의 경우와 마찬가지로 높은 초음파 파워에 장시간 노출에 따른 파클리탁셀의 분해(degradation) 때문으로 판단된다[18].
2(C))이었다. 초음파 파워 180 W, 초음파 조사 시간 1.5 시간에서 가장 높은 파클리탁셀 수율(96%, 1회/2회 누적)을얻어 단 2회 추출로 대부분의 파클리탁셀 회수가 가능하였다. 유사한 수율을 얻기 위해 기존 마이셀 공정에서는 4회 이상의 추출이 요구되는 것에 비해 추출 횟수를 상당히 줄일 수 있었다[13].
대조군의 경우 1회 추출과 2회 추출에서의 누적 파클리탁셀 수율은 각각 69%과 77% 이었으며, 이는 기존 문헌에서의 수율(65-75%)과 유사함을 알 수 있었다[8]. 초음파가 도입된 추출의 경우 누적 파클리탁셀 수율(1회 추출/2회 추출)은 초음파 조사 0.5, 1.5, 2.5 시간에서 초음파 파워 80 W의 경우 각각 77%/82%, 81%/91%, 79%/88% (Fig. 2(A)), 초음파 파워 180 W의 경우 각각 83%/90%, 85%/96%, 84%/95% (Fig.
초음파파워 180 W, 초음파 조사 시간 1.5 시간에서 가장 높은 파클리탁셀 수율(96%, 1회/2회 누적)을 얻었으며, 이는 대조군의 수율에 비해 24.7% 증가하였다. 다른 초음파 파워에서도 초음파 조사 시간 1.
최적의 조건 하에서 액/액 추출로부터 얻은 시료(파클리탁셀 순도: 6.81%)를 마이셀 공정으로 전 처리할 경우 높은 순도(22.0%)의 파클리탁셀을 짧은 상 분리 시간으로 고수율(96%)로 얻을 수 있었다. 또한 초음파-마이셀 공정 전후 시료의 HPLC 크로마토그램을 비교한 결과, 마이셀 공정에서 전 추출(forward extraction)에서 비극성 불순물, 역 추출(back extraction)에서 극성 불순물을 각각 제거하는데 효과적이었다.

후속연구

이를 통해 기존 마이셀 공정, 특히 역 추출(back extraction) 단계에서의 많은 추출 횟수와 긴 상 분리 시간 문제를 획기적으로 개선하고자 하였다. 이러한 연구결과는 바이오매스 유래 파클리탁셀 정제에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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