[논문]선박평형수처리장치 성능 평가를 위한 해양 바이러스 생사판별 방법 개발

현봉길; 우주은; 장풍국; 장민철; 이우진; 배미경; 신경순

doi:10.5762/kais.2021.22.1.431

선박평형수처리장치 성능 평가를 위한 해양 바이러스 생사판별 방법 개발
Development of Marine Virus-like Particles Live/Dead Determination Method for the Performance Evaluation of Ballast Water Treatment System 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.22 no.1, 2021년, pp.431 - 438

현봉길 (한국해양과학기술원 선박평형수연구센터) , 우주은 (한국해양과학기술원 선박평형수연구센터) , 장풍국 (한국해양과학기술원 선박평형수연구센터) , 장민철 (한국해양과학기술원 선박평형수연구센터) , 이우진 (한국해양과학기술원 선박평형수연구센터) , 배미경 (한국해양과학기술원 선박평형수연구센터) , 신경순 (한국해양과학기술원 선박평형수연구센터)

초록
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본 연구는 향후 보다 강화될 것으로 예측되어지는 USCG Phase II 형식승인시험을 대비하기 위해 SYBR Green I과 SYBR Gold의 염색 효율을 비교한 후 염색 효율이 높은 시약을 실제 선박평형수처리장치(electrolysis type, UV + electrolysis type)를 통과한 처리수에 적용해서 보았다. 시료의 부피가 0.5 mL ~ 2 mL, 염색 시약(Stock solution)을 100배 및 200배 희석한 조건에서 염색된 바이러스가 가장 선명하게 관찰되었다. SYBR Green I과 SYBR Gold의 염색효율은 장목한 해수조건의 실험구에서 유의한 차이를 보이지 않았지만, SYBR Gold의 노란색에 비해 SYBR Green I으로 염색된 시료에서 발현하는 녹색 형광이 보다 선명해서 관찰이 용이한 것으로 확인되었다. 선박평형수처리장치(electrolysis type, UV + electrolysis type)를 통과하지 않은 실험수 및 대조수에서의 해양 바이러스 현존량은 약 109~1010 VLP 100 mL-1 으로 확인된 반면, 처리수에서는 살아 있는 바이러스가 관찰되지 않았다. 실험수 결과를 보면, SYBR Green I은 해수, 기수, 담수 조건에서 효과적으로 염색이 되는 것으로 확인되었다. 다양한 선박평형수처리기술에 따른 추가적인 검증 및 염색 방법 개발이 필요하지만, SYBR Green I 염색법은 USCG Phase II 미국형식승인시험 바이러스 생산판별에 좋은 대안이 될 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

To prepare more stringent regulations for USCG Phase II ballast water management, this study investigated the staining efficiency of SYBR Green I(SGI) and SYBR Gold(SG) on the virus-like particle (VLP). A dye with high staining efficiency was applied to the treated water that was passed through the ballast water treatment system (BWTS). VLP staining was observed most clearly under the 100-fold and 200-fold dilution of the stock solution when the volume of filtered samples was 0.5 mL to 2 mL. The staining efficiency of SGI and SG did not show a significant difference. On the other hand, the green fluorescence of viruses in the sample stained with SGI was more pronounced than in the samples stained with SG (expressed yellow fluorescence), making it easier to observe. The abundance of VLP in the test water and control water treatments that did not pass through the two types of BWTS (electrolysis type, UV + electrolysis type) was approximately 109 - 1010 VLP 100 mL-1. In contrast, no stained VLP was observed in the treated water treatments. Moreover, SGI was confirmed to be effectively stained under various salinity conditions, including seawater, brackish water, and freshwater. Further verification tests and development of staining methods under various BWTS are required, but the SGI staining method is believed to be a good alternative to the VLP live/dead determination of the USCG Phase II type approval test.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. Comparison of discharge standard.
표 Table 2. Experimental preparation.
표 Table 3. Staining Procedure.
그림 Fig. 1. Ballast water treatment system schematic diagram, showing ballasting and de-ballasting modes.
표 Table 4. Minimum water quality parameters according to the ETV protocol (USCG Phase I).
그림 Fig. 2. Photographs of stained viruses according to the concentration of SYBR Green I and sampling filtration volume.
그림 Fig. 3. Comparison of virus staining efficiency between SYBR Green I and SYBR Gold.
표 Table 5. Heatmap showing the relative convenience of observation using epifluorescence microscope according to the concentration of SYBR Green I and sampling filtration volume.
그림 Fig. 4. Viral abundance in each experimental treatment passed through by 2 type of BWTS under sea water, brackish water, and fresh water conditions. The brown, orange, green bars represent the Test Water (TW), Discharge Control Water (DC), Discharge Treated Water (DT).

AI 본문요약
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문제 정의

로 보고되었다. 본 연구에서는 시작실험 시 실험수와 5일간의 보관기간 후 종료실험 시 대조수 및 처리수를 이용해서 SGI 염색법이 USCG Phase II 바이러스 시험 방법으로 적용 가능한지 확인해 보았다. 전기분해 방식의 BWTS 실험은 해수에서 2회 진행이 되었으며, 시작 실험 시 실험수내 바이러스의 개체 수는 모두 2.
염색 효율을 비교하였다. 염색 효율이 높은 시약을 BWTS(Electrolysis type, UV+Electrolysis type) 를 통과한 처리수에 적용해서 해수, 담수, 기수 조건하에서 USCG Phase II 시험 적용 가능성을 확인해 보고자 하였다. BWTS를 활용한 실험은 현재의 USCG Phase I 형식 승인 시험 기준에 준해서 실험수를 조성하였다.

제안 방법

2개의 염색(SYBR Green I, SYBR Gold)용액(stock solution)을 이용해서 working solution(50∼400배 희석)을 만든 후 시료 당 0.1 mL를 주입하였으며, 염색된 바이러스의 빠른 형광 유실을 방지하기 위해 10%(wt/vol) p-phenylenediamine을 1:1 glycerol:PBS 용액을 시료 당 30μL 주입하였다. 모든 염색 절차는 Patal et al.
진행하였다. 각 회차 시험은 500톤 시험수 탱크에서 대조수 탱크와 처리수 탱크로 시험수를 보내는 시작시험(Ballasting)과 대조수 탱크와 처리수 탱크 내 물을 배출하는 종료시험(de-ballasting)으로 나누어서 진행하였다[Fig. 1]. 시작 시험 시 시험수는 USCG Phase I 기준 준수를 위해 첨가물(starch, glucose, silica) 및 농축된 자연생물종 일정량을 주입하였다[Table 4].
[9]은 바이러스 계수 시 SGI 염색 시약을 SG로 대체할 수 있으며, 위 두 시약은 동일한 농도로 사용 가능하다고 보고하였다. 그래서 본 연구에서는 먼저 SGI 염색 시약에 대해서 시료 부피에 따른 염색 시약의 농도를 확인한 후 같은 농도로 SG와 염색 효율 비교 실험을 진행하였다. SGI 염색 시 적정한 여과 시료 양 및 염색 시약 농도를 결정하기 위해 Table 5와 같은 실험 구를 설정한 후 실험을 진행하였다.
본 연구에서는 SGI와 SG 염색방법 개발을 위해 먼저 적정 시료 여과 부피 및 염색약 농도를 확인한 후 두 염색 방법의 염색 효율을 비교하였다. 염색 효율이 높은 시약을 BWTS(Electrolysis type, UV+Electrolysis type) 를 통과한 처리수에 적용해서 해수, 담수, 기수 조건하에서 USCG Phase II 시험 적용 가능성을 확인해 보고자 하였다.
장목만 해수를 이용해서 4개의 희석구간(×1, ×10, ×20, ×50)에서 SGI 와 SG 염색 효율 비교 실험을 진행하였다. 희석을 진행하지 않은 실험구에서 해양 바이러스의 평균 개체수를 보면, SGI가 8.
한국해양과학기술원 남해연구소 선박평형수처리장치 정부형식승인 육상시험설비를 이용해서 전기분해방법은 2회, UV+전기분해방식은 해수, 기수, 담수 각각 2회 시험을 진행하였다. 각 회차 시험은 500톤 시험수 탱크에서 대조수 탱크와 처리수 탱크로 시험수를 보내는 시작시험(Ballasting)과 대조수 탱크와 처리수 탱크 내 물을 배출하는 종료시험(de-ballasting)으로 나누어서 진행하였다[Fig.
해양 바이러스 현존량은 부영양화 정도 및 해역 환경 등에 따라 달라지기 때문에 적정 시료 여과 양 및 염색 시약 농도를 확인하기 위해서 5개의 여과 시료 부피(0.1 mL, 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, 2.0 mL)와 4개의 염색 시약 농도(50, 100, 200, 400배 희석)를 설정해서 바이러스 염색 유무 정도 및 계수 가능 여부를 확인했다.
시작 시험 시 시험수는 USCG Phase I 기준 준수를 위해 첨가물(starch, glucose, silica) 및 농축된 자연생물종 일정량을 주입하였다[Table 4]. 해양바이러스 시료는 시작 시험 시 시험수, 종료 시험 시 대조수 및 처리 수를 시험이 진행되는 동안 연속적으로(continuous) 샘플링 하였다.

이론/모형

염색 효율이 높은 시약을 BWTS(Electrolysis type, UV+Electrolysis type) 를 통과한 처리수에 적용해서 해수, 담수, 기수 조건하에서 USCG Phase II 시험 적용 가능성을 확인해 보고자 하였다. BWTS를 활용한 실험은 현재의 USCG Phase I 형식 승인 시험 기준에 준해서 실험수를 조성하였다.
또한 선행 연구에서도 두 염색 시약의 염색효율은 유의한 차이를 보이지 않는다고 보고되었다 [10]. SGI로 염색된 바이러스에서 발현되는 녹색 형광이 노란색을 띄는 SG로 염색된 바이러스 보다 밝게 발현된다는 특성과 몇몇 선행 연구에서 SG로 염색된 노란색 보다 SGI로 염색된 밝은 녹색이 관찰하기가 용이 했다는 선행 연구결과를 고려해서, 선박평형수처리장치를 활용한 실증 실험에서는 SGI 염색법을 사용해서 평가를 수행했다[9]. 또한 염색된 바이러스의 형광 유실 정도를 확인해 본 결과, 단독으로 SGI 와 SG를 사용할 경우 형광 유실이 매우 빠른 시간 내에 발생하지만, slow-fade diamond antifade mountant를 사용할 경우 오랜 시간 (약 30∼ 60분) 형광의 유실 없이 안정적으로 사용이 가능했다.
1]. 시작 시험 시 시험수는 USCG Phase I 기준 준수를 위해 첨가물(starch, glucose, silica) 및 농축된 자연생물종 일정량을 주입하였다[Table 4]. 해양바이러스 시료는 시작 시험 시 시험수, 종료 시험 시 대조수 및 처리 수를 시험이 진행되는 동안 연속적으로(continuous) 샘플링 하였다.

성능/효과

한다. SGI 염색법은 염색이 간단해서 다른 염색 방법 (e.g., Yo-Pro)에 비해 상대적으로 시료 전처리 시간이 짧으며, 염색된 바이러스가 발현하는 형광도 안정적(30 분 이상)으로 유지 될 뿐만 아니라 크기가 매우 작은 바이러스가 충분히 계수 가능할 정도로 밝은 녹색 형광을 발현하였다. 또한 SGI가 해수, 기수, 담수 조건 및 전기분해 시 발생하는 화학물질(NaOCl)이 함유된 처리수 조건에서도 염색이 가능한 것을 확인할 수 있었다.
2b, 2c], 이는 계수된 개체수가 적어서 결과의 신뢰성을 확보하기 어렵다고 판단되었을 뿐만 아니라 생물에 흡수되지 않은 잉여의 염색시약이 배경(Background)을 밝게 해서 바이러스를 계수하기가 어려웠다. 계절에 따른 변화(수온 및 생물량 변화)와 해역마다의 유효한 시료 여과 부피가 다를 것으로 판단되지만, 본 연구 해역인 장목만과 유사한 환경인 경우 바이러스 계수에 용이한 부피는 0.5 mL ∼ 2.0 mL이며, SGI 염색시약 농도는 100 ∼ 200배 인 것으로 확인되었다[Table 5].
, Yo-Pro)에 비해 상대적으로 시료 전처리 시간이 짧으며, 염색된 바이러스가 발현하는 형광도 안정적(30 분 이상)으로 유지 될 뿐만 아니라 크기가 매우 작은 바이러스가 충분히 계수 가능할 정도로 밝은 녹색 형광을 발현하였다. 또한 SGI가 해수, 기수, 담수 조건 및 전기분해 시 발생하는 화학물질(NaOCl)이 함유된 처리수 조건에서도 염색이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 현재의 선박평형수처리장치 형식승인시험 생물 분석 시간(6시간)을 고려할 경우, SGI 염색법은 USCG Phase II 시험 시 바이러스 생사판별에 좋은 대안이 될 수 있다고 판단된다.
SGI로 염색된 바이러스에서 발현되는 녹색 형광이 노란색을 띄는 SG로 염색된 바이러스 보다 밝게 발현된다는 특성과 몇몇 선행 연구에서 SG로 염색된 노란색 보다 SGI로 염색된 밝은 녹색이 관찰하기가 용이 했다는 선행 연구결과를 고려해서, 선박평형수처리장치를 활용한 실증 실험에서는 SGI 염색법을 사용해서 평가를 수행했다[9]. 또한 염색된 바이러스의 형광 유실 정도를 확인해 본 결과, 단독으로 SGI 와 SG를 사용할 경우 형광 유실이 매우 빠른 시간 내에 발생하지만, slow-fade diamond antifade mountant를 사용할 경우 오랜 시간 (약 30∼ 60분) 형광의 유실 없이 안정적으로 사용이 가능했다.
종료 실험 시 처리수에서는 전기분해방식과 마찬가지로 염색된 바이러스가 관찰되지 않았다. 본 연구 결과에서 처리수내에 염색된 바이러스의 개체 수가 확인되지 않았지만, 몇몇 처리수 시료에서 염색된 종속영양박테리아가 관찰되었고, 본 연구 전 소규모모의실험연구에서도 다양한 생물 사멸 조건(UV, 전기분해 포함)에 노출시킨 처리수내 해양 바이러스가 염색된 결과를 고려하였을 경우, UV와 전기분해방식을 통해 생성된 화학물질(NaOCl)은 SGI의 염색 효율에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 전세계 BWTS 시장에서 현재까지 승인받은 BWTS의 약 90%가 UV 와 전기분해 장치를 사용하고 해수, 기수, 담수 조건에서 모두 적용이 가능하다는 사실을 고려하면, SGI 염색 방법은 USCG Phase II 선박평형수처리장치 형식승인시험 바이러스 생사판별에 적용 가능할 것으로 판단된다.
SGI 염색 시 적정한 여과 시료 양 및 염색 시약 농도를 결정하기 위해 Table 5와 같은 실험 구를 설정한 후 실험을 진행하였다. 시료 0.1 mL ~ 2 mL 를 넣고 SGI 시약 농도 구배에 따라 바이러스의 염색 유무를 확인한 결과, SGI stock solution이 100배와 200 배 희석된 조건에서는 바이러스 관찰이 용이한 반면[Fig. 2d, 2e], 400배 희석된 조건에서는 바이러스가 상대적으로 약하게 염색이 되어서 계수하는데 다소 어려움이 있었다[Fig. 2f]. 시료 0.
본 연구에서는 시작실험 시 실험수와 5일간의 보관기간 후 종료실험 시 대조수 및 처리수를 이용해서 SGI 염색법이 USCG Phase II 바이러스 시험 방법으로 적용 가능한지 확인해 보았다. 전기분해 방식의 BWTS 실험은 해수에서 2회 진행이 되었으며, 시작 실험 시 실험수내 바이러스의 개체 수는 모두 2.1×10⁹ VLP 100 mL^-1이며, 종료 실험 시 대조수에서는 각각 1.5×10⁹ VLP 100 mL-1과 9.6×109 VLP 100 mL^-1으로 확인되었다[Fig. 4]. 5일 후 처리 수에서는 염색된 바이러스가 관찰되지 않았다.
본 연구 결과에서 처리수내에 염색된 바이러스의 개체 수가 확인되지 않았지만, 몇몇 처리수 시료에서 염색된 종속영양박테리아가 관찰되었고, 본 연구 전 소규모모의실험연구에서도 다양한 생물 사멸 조건(UV, 전기분해 포함)에 노출시킨 처리수내 해양 바이러스가 염색된 결과를 고려하였을 경우, UV와 전기분해방식을 통해 생성된 화학물질(NaOCl)은 SGI의 염색 효율에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 전세계 BWTS 시장에서 현재까지 승인받은 BWTS의 약 90%가 UV 와 전기분해 장치를 사용하고 해수, 기수, 담수 조건에서 모두 적용이 가능하다는 사실을 고려하면, SGI 염색 방법은 USCG Phase II 선박평형수처리장치 형식승인시험 바이러스 생사판별에 적용 가능할 것으로 판단된다. 하지만 선박평형수처리장치의 종류(오존, UV, Heating, NADCC 등), 처리수내 환경 조건(수온, 염분, pH, 용존산소, 유기물농도 등) 및 처리 후 경과 시간 등 여러가지 인자가 바이러스 생사판별 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 추가적인 검증 실험이 필요한 것으로 판단된다.
3]. 하지만 10배 희석한 실험구에서는 SGI가 2.9×108 VLP 100 mL^-1으로 2.2×10⁸ VLP 100 mL-1 인 SG 보다 높았으며, 20배 및 50배 실험구에서는 두 염색 방법 간의 뚜렷한 차이를 확인할 수 없었다. 일반적으로 박테리아나 바이러스와 같은 크기가 매우 작은 미생물 계수 시 같은 자릿수 내에서의 변동은 차이가 크다고 판단하지 않기 때문에, SGI와 SG의 염색 효율은 비슷한 것으로 판단된다.
5일 후 처리 수에서는 염색된 바이러스가 관찰되지 않았다. 해수, 기수, 담수 각각 2회 시험을 진행한 UV+전기분해방식에서도 실험수는 6.6×10⁹ VLP 100 mL^-1∼ 1.3×1010 VLP 100 mL^-1의 범위를 보였고, 종료 실험 시 대조 수에서는 4.5×10⁹ VLP 100 mL^-1∼ 1.1×10¹⁰ VLP 100 mL-1의 범위를 보였다. 종료 실험 시 처리수에서는 전기분해방식과 마찬가지로 염색된 바이러스가 관찰되지 않았다.
희석을 진행하지 않은 실험구에서 해양 바이러스의 평균 개체수를 보면, SGI가 8.3×10⁸ VLP 100 mL-1 으로 9.2×10⁸ VLP 100 mL^-1인 SG보다 다소 낮게 나타났다 [Fig. 3]. 하지만 10배 희석한 실험구에서는 SGI가 2.

후속연구

또한 이로 인해 여과하는 시료의 양을 증가시키면 여과 시간 증가 및 여과지내 생물이 과다 중첩으로 인한 분석오차가 발생할 수도 있다. 따라서 USCG Phase II 바이러스 분야 잠정 기준이 보다 완화되어 적용되지 않는 다고 가정할 경우, 시료를 먼저 전처리(Pre-filter)하여 크기가 큰 생물을 제거해서 많은 시료를 여과할 수 있는 방법 등 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.
전세계 BWTS 시장에서 현재까지 승인받은 BWTS의 약 90%가 UV 와 전기분해 장치를 사용하고 해수, 기수, 담수 조건에서 모두 적용이 가능하다는 사실을 고려하면, SGI 염색 방법은 USCG Phase II 선박평형수처리장치 형식승인시험 바이러스 생사판별에 적용 가능할 것으로 판단된다. 하지만 선박평형수처리장치의 종류(오존, UV, Heating, NADCC 등), 처리수내 환경 조건(수온, 염분, pH, 용존산소, 유기물농도 등) 및 처리 후 경과 시간 등 여러가지 인자가 바이러스 생사판별 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 추가적인 검증 실험이 필요한 것으로 판단된다.

참고문헌 (10)

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원문보기 상세보기
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A. Shibata, Y. Goto, H. Saito, T. Kikuchi, T. Toda, S. Taguchi, "Comparison of SYBR Green I and SYBR Gold stains for enumerating bacteria and viruses by epifluorescence microscopy", Aquatic Microbial Ecology, Vol. 43, No. 3, pp. 221-231, 2006. DOI: https://dx.doi.org/10.3354/ame043223

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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