2020년 8월 충청남도 음성지역에서 노지에서 재배중인 질경이 143 개체 가운데 약 20개체의 잎으로부터 고리형태의 괴사증상을 포함한 바이러스 유사증상이 나타나는 것을 발견하였다. 다양한 바이러스 증상을 나타내는 8개체로부터 impatiens necrotic spot virus (INSV), 토마토반점위조바이러스(tomato spotted wilt virus) 및 cucumber mosaic virus가 검출되었으며, 질경이모자이크바이러스(plantago asiatica mosaic virus)는 검출되지 않았다. 질경이로부터 분리한 'INSV-plantain kr1' 분리주(MW114834)의 L 분절 유전체 전체 염기서열을 GenBank에 등록된 6개의 다른 INSV와 비교하였을 때 중국에서 보고한 'Phalaenopsis' 분리주(GQ336991)와 가장 높은 상동성을 보였다. 'INSV-plantain kr1' (MT051395)과 'INSV-plantain kr5(MT051707)' 두개의 분리주의 N 유전자는 중국에서 보고한 'YSMi-SH' 분리주(FN400773)과 가장 높은 상동성을 보였으며, 'INSV-plantain kr1'과 'INSV-plantain kr5' 분리주의 NSs 유전자는 각각 'Pepe' 분리주(LC384872)와 'J' 분리주(AB109100)와 가장 높은 상동성을 보였다. 'INSV-plantain kr1' 분리주의 L 분절 유전체에 대하여 MEGA X 프로그램을 사용하여 다른 INSV 분리주와의 계통학적 연관성을 살펴본 결과, 우리나라에서 보고한 'Pepe' 분리주(LC384870), 중국에서 보고한 'HDL' 분리주(GU112505), 'Phalaenopsis' 분리주(GQ336991) 및 이탈리아에서 보고한 분리주(DQ425094)와 하나의 그룹으로 분류되었다. 질경이는 종자에 의해서 번식하기 때문에 INSV에 감염된 질경이가 해외에서 유입되었다기보다는 국내에서 감염되었을 가능성이 높다. 그렇지만 GenBank에 등록된 INSV 분리주에 대한 염기서열 정보가 많지 않기 때문에 질경이에서 분리한 INSV의 유래를 찾을 수는 없었다. 이 연구는 우리나라에서 질경이(P. asiatica)에 발생한 INSV에 관한 최초의 보고이다.
2020년 8월 충청남도 음성지역에서 노지에서 재배중인 질경이 143 개체 가운데 약 20개체의 잎으로부터 고리형태의 괴사증상을 포함한 바이러스 유사증상이 나타나는 것을 발견하였다. 다양한 바이러스 증상을 나타내는 8개체로부터 impatiens necrotic spot virus (INSV), 토마토반점위조바이러스(tomato spotted wilt virus) 및 cucumber mosaic virus가 검출되었으며, 질경이모자이크바이러스(plantago asiatica mosaic virus)는 검출되지 않았다. 질경이로부터 분리한 'INSV-plantain kr1' 분리주(MW114834)의 L 분절 유전체 전체 염기서열을 GenBank에 등록된 6개의 다른 INSV와 비교하였을 때 중국에서 보고한 'Phalaenopsis' 분리주(GQ336991)와 가장 높은 상동성을 보였다. 'INSV-plantain kr1' (MT051395)과 'INSV-plantain kr5(MT051707)' 두개의 분리주의 N 유전자는 중국에서 보고한 'YSMi-SH' 분리주(FN400773)과 가장 높은 상동성을 보였으며, 'INSV-plantain kr1'과 'INSV-plantain kr5' 분리주의 NSs 유전자는 각각 'Pepe' 분리주(LC384872)와 'J' 분리주(AB109100)와 가장 높은 상동성을 보였다. 'INSV-plantain kr1' 분리주의 L 분절 유전체에 대하여 MEGA X 프로그램을 사용하여 다른 INSV 분리주와의 계통학적 연관성을 살펴본 결과, 우리나라에서 보고한 'Pepe' 분리주(LC384870), 중국에서 보고한 'HDL' 분리주(GU112505), 'Phalaenopsis' 분리주(GQ336991) 및 이탈리아에서 보고한 분리주(DQ425094)와 하나의 그룹으로 분류되었다. 질경이는 종자에 의해서 번식하기 때문에 INSV에 감염된 질경이가 해외에서 유입되었다기보다는 국내에서 감염되었을 가능성이 높다. 그렇지만 GenBank에 등록된 INSV 분리주에 대한 염기서열 정보가 많지 않기 때문에 질경이에서 분리한 INSV의 유래를 찾을 수는 없었다. 이 연구는 우리나라에서 질경이(P. asiatica)에 발생한 INSV에 관한 최초의 보고이다.
In August 2020, necrotic ringspots on leaves were observed on 20 from 143 Plantago asiatica plants in open fields in Eumseong, Chungcheongbuk-do. Eight symptomatic Plantago asiatica plants were subjected to investigation on viral infection by reverse transcription and polymerase chain reaction. Impa...
In August 2020, necrotic ringspots on leaves were observed on 20 from 143 Plantago asiatica plants in open fields in Eumseong, Chungcheongbuk-do. Eight symptomatic Plantago asiatica plants were subjected to investigation on viral infection by reverse transcription and polymerase chain reaction. Impatiens necrotic spot virus, tomato spotted wilt virus and cucumber mosaic virus were detected from the symptomatic plants. Two impatiens necrotic spot virus (INSV) isolates ('INSV-plantain kr1' and '-plantain kr5') were sequenced and analyzed by comparing L genomic segment, nucleoprotein (N) gene and non-structural protein S (NSs) gene sequences. The nucleotide sequence of 'INSV-plantain kr1' isolate (MW114834) was most closely related to that of a 'Phalaenopsis' isolate (GQ336991) from China in the L genomic segment. 'INSV-plantain kr1' and '-plantain kr5' isolates shared the highest identities with those from 'Pepe' isolate (LC384872) and 'J' isolate (AB109100) in the NSs gene, respectively, and with that from 'YSMi-SH' isolate (FN400773) in the N gene. Phylogenetic analysis based on L genomic segment grouped the INSV-plantain kr1 isolate together with isolates from Korea (LC384870), China (GU112505, GQ336991), and Italy (DQ425094). This is the first report on INSV in P. asiatica from Korea.
In August 2020, necrotic ringspots on leaves were observed on 20 from 143 Plantago asiatica plants in open fields in Eumseong, Chungcheongbuk-do. Eight symptomatic Plantago asiatica plants were subjected to investigation on viral infection by reverse transcription and polymerase chain reaction. Impatiens necrotic spot virus, tomato spotted wilt virus and cucumber mosaic virus were detected from the symptomatic plants. Two impatiens necrotic spot virus (INSV) isolates ('INSV-plantain kr1' and '-plantain kr5') were sequenced and analyzed by comparing L genomic segment, nucleoprotein (N) gene and non-structural protein S (NSs) gene sequences. The nucleotide sequence of 'INSV-plantain kr1' isolate (MW114834) was most closely related to that of a 'Phalaenopsis' isolate (GQ336991) from China in the L genomic segment. 'INSV-plantain kr1' and '-plantain kr5' isolates shared the highest identities with those from 'Pepe' isolate (LC384872) and 'J' isolate (AB109100) in the NSs gene, respectively, and with that from 'YSMi-SH' isolate (FN400773) in the N gene. Phylogenetic analysis based on L genomic segment grouped the INSV-plantain kr1 isolate together with isolates from Korea (LC384870), China (GU112505, GQ336991), and Italy (DQ425094). This is the first report on INSV in P. asiatica from Korea.
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제안 방법
RT-PCR 후 PCR 산물을 pGEM-T easy 백터에 클로닝하여 Sanger-sequenc- ing 방법으로 염기서열을 결정하였다. INSV는 ‘INSV-plantain kr1’ 분리주의 L 분절 유전체의 전체 염기서열 및 ‘INSV-plantain kr1’ 와 ‘INSV-plantain kr5’ 분리주의 N과 NSs 유전자의 염기서열을 결정하였다. TSWV와 CMV는 ‘TSWV-plantain kr8’ 와 ‘CMV- plantain kr2’ 분리주에 대한 각각 N 유전자와 coat protein 유전자에 대한 염기서열을 결정하였다.
INSV는 ‘INSV-plantain kr1’ 분리주의 L 분절 유전체의 전체 염기서열 및 ‘INSV-plantain kr1’ 와 ‘INSV-plantain kr5’ 분리주의 N과 NSs 유전자의 염기서열을 결정하였다. TSWV와 CMV는 ‘TSWV-plantain kr8’ 와 ‘CMV- plantain kr2’ 분리주에 대한 각각 N 유전자와 coat protein 유전자에 대한 염기서열을 결정하였다. 염기서열이 결정된 유전자들에 대하여 GenBank 데이터베이스(http://www.
이러한 증상을 포함한 바이러스 유사 증상이 실험 포장에서 재배하는 질경이 총 143개체 가운데 20여개체에서 나타났다. 고리 형태의 괴사증상을 일으킨 질경이 개체 모두에서 INSV가 검출되었는데 본 연구에서는 질경이에서 검출한 INSV의 염기서열 분석을 통하여 기존 보고된 분리 주들과의 분자적 유연관계를 비교하였다.
바이러스 유전자 염기서열 및 유연관계 분석. RT-PCR 후 PCR 산물을 pGEM-T easy 백터에 클로닝하여 Sanger-sequenc- ing 방법으로 염기서열을 결정하였다.
바이러스 정밀 검정을 위하여 INSV 분리주의 L 분절 유전체, nucleoprotein (N) 유전자 및 non-structural protein S (NSs) 유전자, cucumber mosaic virus (CMV)와 plantago asiatica mosaic virus (PlAMV)의 coat protein 유전자, TSWV의 N 유전자 특이 진단용 프라이머를 이용하여 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 수행하였다. 핵산 추출은 RNeasy plant mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 9개의 샘플로부터 제조사의 권장 방법대로 식물체 전체 RNA를 추출하였다.
2020년 8월 충청북도 음성군에 위치한 국립원예특작과학원 약용작물 시험포장에서 재배 중인 질경이 잎에서 전형적인 Tospovirus 감염 증상인 원형의 괴사증 상이 관찰되었다. 원형의 괴사 증상을 포함한 다양한 바이러스 증상을 나타내는 질경이 8 개체 및 바이러스 증상을 나타내지 않는 한 개체를 대상으로 바이러스 감염 여부를 확인하였다(Fig. 1).
바이러스 정밀 검정을 위하여 INSV 분리주의 L 분절 유전체, nucleoprotein (N) 유전자 및 non-structural protein S (NSs) 유전자, cucumber mosaic virus (CMV)와 plantago asiatica mosaic virus (PlAMV)의 coat protein 유전자, TSWV의 N 유전자 특이 진단용 프라이머를 이용하여 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 수행하였다. 핵산 추출은 RNeasy plant mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 9개의 샘플로부터 제조사의 권장 방법대로 식물체 전체 RNA를 추출하였다. RT-PCR 반응은 one-step RT-PCR 제품(Genetbio, Nonsan, Korea)을 이용하여 제조사의 권장 방법대로 수행하였다.
대상 데이터
2020년 8월 충청북도 음성 소재 국립원예특작과학원 실험 포장에서 약용작물 실험용으로 재배하는 질경이 잎에 고리 형태의 괴사 증상이 관찰되었다. 이러한 증상을 포함한 바이러스 유사 증상이 실험 포장에서 재배하는 질경이 총 143개체 가운데 20여개체에서 나타났다.
바이러스병 발생조사 및 증상. 2020년 8월 충청북도 음성군에 위치한 국립원예특작과학원 약용작물 시험포장에서 재배 중인 질경이 잎에서 전형적인 Tospovirus 감염 증상인 원형의 괴사증 상이 관찰되었다. 원형의 괴사 증상을 포함한 다양한 바이러스 증상을 나타내는 질경이 8 개체 및 바이러스 증상을 나타내지 않는 한 개체를 대상으로 바이러스 감염 여부를 확인하였다(Fig.
괴사 증상이 관찰되었다. 이러한 증상을 포함한 바이러스 유사 증상이 실험 포장에서 재배하는 질경이 총 143개체 가운데 20여개체에서 나타났다. 고리 형태의 괴사증상을 일으킨 질경이 개체 모두에서 INSV가 검출되었는데 본 연구에서는 질경이에서 검출한 INSV의 염기서열 분석을 통하여 기존 보고된 분리 주들과의 분자적 유연관계를 비교하였다.
데이터처리
다른 분리주들과의 계통학적 연관성을 추정하기 위해서 MEGA X 프로그램을 사용하여 maximum likelihood method로 분석하였다(Kumar 등, 2018). 계통수의 가지에 대한 통계적 유의성은 bootstrap 1,000반복을 수행하는 방법으로 분석하였다.
TSWV와 CMV는 ‘TSWV-plantain kr8’ 와 ‘CMV- plantain kr2’ 분리주에 대한 각각 N 유전자와 coat protein 유전자에 대한 염기서열을 결정하였다. 염기서열이 결정된 유전자들에 대하여 GenBank 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank)에 등록된 다른 분리주들과의 염기서열 상동성을 보기 위하기 위하여, DNAStar 프로그램의 ClustralW 방법으로 정렬하여 비교하였다. 다른 분리주들과의 계통학적 연관성을 추정하기 위해서 MEGA X 프로그램을 사용하여 maximum likelihood method로 분석하였다(Kumar 등, 2018).
이론/모형
핵산 추출은 RNeasy plant mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 9개의 샘플로부터 제조사의 권장 방법대로 식물체 전체 RNA를 추출하였다. RT-PCR 반응은 one-step RT-PCR 제품(Genetbio, Nonsan, Korea)을 이용하여 제조사의 권장 방법대로 수행하였다. RT-PCR에 사용한 바이러스 특이 프라이머의 염기서열은 Table 1과 같다.
바이러스 유전자 염기서열 및 유연관계 분석. RT-PCR 후 PCR 산물을 pGEM-T easy 백터에 클로닝하여 Sanger-sequenc- ing 방법으로 염기서열을 결정하였다. INSV는 ‘INSV-plantain kr1’ 분리주의 L 분절 유전체의 전체 염기서열 및 ‘INSV-plantain kr1’ 와 ‘INSV-plantain kr5’ 분리주의 N과 NSs 유전자의 염기서열을 결정하였다.
gov/genbank)에 등록된 다른 분리주들과의 염기서열 상동성을 보기 위하기 위하여, DNAStar 프로그램의 ClustralW 방법으로 정렬하여 비교하였다. 다른 분리주들과의 계통학적 연관성을 추정하기 위해서 MEGA X 프로그램을 사용하여 maximum likelihood method로 분석하였다(Kumar 등, 2018). 계통수의 가지에 대한 통계적 유의성은 bootstrap 1,000반복을 수행하는 방법으로 분석하였다.
성능/효과
‘INSV-plan- tain kr1’ 분리주의 L 분절 유전체(MW114834)의 전체 염기서열을 대상으로 GenBank에 등록된 다른 INSV 분리주들과의 계통학적 유연관계를 비교한 결과, 한국에서 보고한 ‘Pepe’ 분리주 (LC384870), 중국에서 보고한 ‘HDL’ 분리주(GU112505)와 ‘Pha- laenopsis’ 분리주(GQ336991) 및 이탈리아에서 보고한 분리주 (DQ425094)들과 같은 그룹으로 분류되었으며, 미국에서 보고한 ‘UP01’ 분리주(MH171172) 및 네덜란드에서 보고한 분리주 (NC003625)와는 상대적으로 먼 연관관계를 보였다(Fig. 3A).
‘INSV-plantain kr1’ (MT951395)와 ‘INSV-plantain kr5’ (MW051707) 분리주의 N 유전자에 대하여 GenBank에 등록된 다른 분리 주들과의 계통학적 유연관계를 비교한 결과, 우리나라에서 보고한 ‘Pepe’ 분리주(LC384872) 또는 ‘Hy-2’ 분리주(MG257892) 에 비해 ‘L7075Gr’ 분리주(MN553562), ‘J’ 분리주(AB109100), ‘YSMi-SH’ 분리주(FN400773)들과 연관성이 가까운 것으로 나타났다(Fig. 3B). NSs 유전자 부위에 대한 다른 INSV 분리 주들과의 계통학적 연관성은 ‘INSV-plantain kr1’ 분리주(MW051708) 의 경우 우리나라에서 보고한 ‘Pepe’ 분리주(LC384872) 및 중국에서 보고한 ‘Phalaenopsis’ 분리주(GQ336989)와 연관성이 높으며, ‘INSV-plantain kr5’ 분리주(MW051709)는 일본에서 보고한 ‘J’ 분리주(AB109100)와 유연관계가 높다(Fig.
4A). ‘INSV-plantain kr1’과 ‘INSV-plantain kr5’ 분리주의 GenBank에 등록된 다른 INSV 분리주들과의 N 유전자 부위의 염기서열 상동성은 98.1-99.6% 범위이며, 중국에서 보고한 ‘YSMi-SH’ 분리주 (FN400773)과99.6%로 상동성이 가장 높다(Fig. 4B). 우리나라에서 보고한 ‘Pepe’ 분리주(LC384872) 또는 ‘Hy-2’ 분리주 (MG257892)들과는 각각 99.
‘INSV-plantain-kr1’ 분리주의 L 분절 유전체의 GenBank에등록된 다른 분리주들과의 염기서열 상동성의 범위는 97.9- 98.9%로 중국에서 보고한 ‘Phalaenopsis’ 분리주(GQ336991) 와 98.9%의 가장 높은 상동성을 보였다(Fig. 4A). ‘INSV-plantain kr1’과 ‘INSV-plantain kr5’ 분리주의 GenBank에 등록된 다른 INSV 분리주들과의 N 유전자 부위의 염기서열 상동성은 98.
4B). NSs 유전자 부위에 대한 GenBank에 등록된 다른 INSV 분리주들과의 염기서열 상동성은 97.8-99.5% 범위이며, ‘INSV-plantain kr1’ (MW051708)의 경우 우리나라에서 보고한 ’Pepe’ 분리주(LC384872)와 99.5%, ‘INSV-plantain kr5’ 분리주 (MW051709)는 일본에서 보고한 ‘J’ 분리주(AB109100)와 99.3% 로 가장 높은 상동성을 보였다(Fig. 4C).
따라서 질경이를 감염시킨 INSV는질경이 재배지 주변에 존재하던 전염원에 의해 총채벌레에 의해 전염되었을 것으로 추정된다. 본 연구에서 INSV 질경이 분리 주들의 N유전자 염기서열 비교 분석결과로 보아 중국에서 보고된 ‘YSMi-SH’ 분리주(FN400773)와 상동성이 가장 높으며 우리나라에서 보고한 ‘Hy-2’ 분리주(Kim 등, 2017) 및 ‘Pepe’ 분리주(LC384872)와는 상동성이 상대적으로 낮지만, NSs 유전자는 다른 분리주에 비해 ‘Pepe’ 분리주(LC384892)와 상동 성이 가장 높았다. 그렇지만 GenBank 데이터베이스에 등록된 INSV 유전정보가 많지 않으며 특히 국내에서 가장 최근에 보고되었으며 질경이에서 INSV가 발생한 동일한 음성 지역에서 분리한 ‘Hy-2’ 분리주(MG257892)에 대한 염기서열 정보가 N 유전자 외에는 없어서 질경이에서 분리한 INSV의 유래에 관해서는 추정하기는 어렵다.
2C, E). 위축과 함께 잎이 쭈글쭈글해지는 증상을 나타내는 개체에서는 CMV가 검출되었으며 (Fig. 2D, E), 직경 약 4 mm 크기의 고리 모양의 괴사증상와 더불어 황색반점, 위축 및 쭈글쭈글해지는 증상을 나타내는 개체에서는 TSWV와 CMV가 모두 검출되었다(Fig. 2C, E).
RT-PCR 진단 및 증상. 질경이 증상주 8 개체와 증상이 없는 한 개체에 대하여 표 1에 제시된 TSWV, INSV, CMV 및 PlAMV 특이 프라이머를 이용하여 RT-PCR한 결과, 증상을 나타내는 8 개체 가운데 3개체로부터는 INSV, 3개체로부터는 TSWV, 2개체로부터는 CMV, 이들 가운데 한 개체에서는 TSWV와 CMV가 모두 검출되었다(Fig. 1). 증상을 나타내지 않는 개체로부터는 4종 바이러스 어느 것도 검출되지 않았다(Fig.
참고문헌 (16)
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