[논문]솔잎 부탄올 분획의 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효과

김준형; 김나영; 권강무; 황인현; 김대근

doi:10.22889/kjp.2021.52.2.105

솔잎 부탄올 분획의 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효과
Antioxidant Activities of n-Butanol Fraction of Pinus densiflora Siebold & Zucc. Needle in Caenorhabditis elegans. 원문보기

생약학회지, v.52 no.2, 2021년, pp.105 - 111

김준형 (우석대학교 식품생명공학과) , 김나영 (우석대학교 약학과) , 권강무 (우석대학교 약학과) , 황인현 (우석대학교 약학과) , 김대근 (우석대학교 약학과)

Abstract ▼ AI-Helper

To investigate the antioxidant activities of Pinus densiflora needle (Pinaceae), which is widely used as a traditional medicine in Korea, Caenorhabditis elegans model system was used. The n-butanol fraction of P. densiflora needle methanol extract showed the most potent DPPH radical scavenging and superoxide quenching activities in a dose-dependent manner. The n-butanol fraction was measured for the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase, and oxidative stress tolerance by using C. elegans with reactive oxygen species (ROS) level. In addition, to see that the regulation of the stress response gene is responsible for the increased stress tolerance of C. elegans treated by the butanol extract, SOD-3 expression was measured using a transgenic strain. As a result, the P. densiflora needle n-butanol fraction increased SOD and catalase activities, and decreased ROS accumulation, dose-dependently. Furthermore, the n-butanol fraction-treated CF1553 worm showed higher SOD-3::GFP intensity than the control.

주제어

표/그림 (7)

$Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from the Pinus densiflora needle.$ 그림 Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from the Pinus densiflora needle.
$Fig. 3. Effects of Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O2- and the SOD activity was estimated spectrophotometric through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of three independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 by one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 3. Effects of Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O2- and the SOD activity was estimated spectrophotometric through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H₂O₂, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of three independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 by one-way ANOVA.
$Fig. 2. Riboflavin-originated superoxide quenching activities of the methanol extract, and its fractions from the Pinus densi-flora needle.$ 그림 Fig. 2. Riboflavin-originated superoxide quenching activities of the methanol extract, and its fractions from the Pinus densi-flora needle.
$Fig. 4. Effects of Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by the one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 4. Effects of Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by the one-way ANOVA.
$Fig. 5. Effects of Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.$ 그림 Fig. 5. Effects of Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.
$Fig. 6. Effect of Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of Beta vulgaris methanol extract. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 25 to 30 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05 and **p<0.01 by one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 6. Effect of Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of Beta vulgaris methanol extract. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 25 to 30 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05 and **p<0.01 by one-way ANOVA.
$Table I. Effects of the Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the oxidative stress tolerance of C. elegans$ 표 Table I. Effects of the Pinus densiflora needle n-butanol fraction on the oxidative stress tolerance of C. elegans

AI 본문요약
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제안 방법

Oxidative Stress 저항성 증가 효능 − 솔잎 n-butanol 분획물의 선충의 산화적 스트레스 조건하에서 선충의 생존율에 미치는 영향을 확인하였다
추출 − 솔잎 600g을 건조하여 얻은 시료를 methanol로 진탕하면서 50 ℃에서 5시간씩 3회 온침 추출하였다. 그 추출액을 수욕상에서 감압 농축하여 methanol엑스 약 170.4g을 얻었으며, 이 methanol엑스를 증류수로 현탁 시키고 동량의 n-hexane(10.38g), methylene chloride(4.02g), ethyl acetate (7.26 g) 및 n-butanol(21.6 g)의 순으로 순차적으로 용매 분획하여 각각의 분획물을 얻었다.
형질 전환 선충 내 SOD-3의 발현 증가 효능 − 선충 내에서 솔잎 n-butanol 분획물 투여에 의한 oxidative stress에 저항하는 단백질의 증가 여부를 확인하기 위해서 SOD발현 유전자의 증가 여부를 확인하였다

대상 데이터

실험재료 − 실험에 사용한 솔잎은 2019년 3월에 전북 완주군에서 채집 후 김대근 교수가 검증한 후에 음건 세절하여 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WS-19-007).

데이터처리

그룹간의 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 통해서 분석하였고 선충의 연속적인 생존도 는 Log-rank test 분석 방법을 이용하였다
통계 분석 − 통계 자료의 값은 평균값 ± 표준오차(mean ± S.E.M.)로 표시 하였다

성능/효과

SOD-3을 포함한 형질전환 선충 CF1553을 사용하여 실험한 결과 CF1553 형질전환 선충에 솔잎 n-butanol 분획물 250, 500 μg/mL 처리 군이 처리되지 않은 선충에 비해 높은 SOD-3::GFP 발현율 (6.4%, 13.4%, *p<0.05, **p<0.01)을 보여주었다(Fig
솔잎 n-butanol 분획물의 항산화제로서의 가치가 있는지를 확인하기 위해 in vitro 실험인 DPPH free radical 및 superoxide 소거능을 확인한 결과에서 농도의존적으로 항산화 효능을 나타냈으며, 예쁜꼬마선충을 이용한 in vitro 항산화 실험에서는 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것을 확인하였다. 또한, 선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 oxidative stress 조건하에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이와 관련하여 항산화 효소인 SOD 발현 유전자에 GFP로 transgenic mutant CF1553을 이용한 oxidative stress 저항성 단백질 발현 실험에서는 oxidative stress에 저항성이 있는 SOD-3::GFP의 발현량 증가됨을 확인하였다.
솔잎 n-butanol 분획물의 항산화제로서의 가치가 있는지를 확인하기 위해 in vitro 실험인 DPPH free radical 및 superoxide 소거능을 확인한 결과에서 농도의존적으로 항산화 효능을 나타냈으며, 예쁜꼬마선충을 이용한 in vitro 항산화 실험에서는 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것을 확인하였다. 또한, 선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 oxidative stress 조건하에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다.
또한, 선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 oxidative stress 조건하에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이와 관련하여 항산화 효소인 SOD 발현 유전자에 GFP로 transgenic mutant CF1553을 이용한 oxidative stress 저항성 단백질 발현 실험에서는 oxidative stress에 저항성이 있는 SOD-3::GFP의 발현량 증가됨을 확인하였다. 본 결과는 솔잎 n-butanol 분획물은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 자원으로서의 가치가 충분히 있을 것으로 사료된다.

후속연구

이와 관련하여 항산화 효소인 SOD 발현 유전자에 GFP로 transgenic mutant CF1553을 이용한 oxidative stress 저항성 단백질 발현 실험에서는 oxidative stress에 저항성이 있는 SOD-3::GFP의 발현량 증가됨을 확인하였다. 본 결과는 솔잎 n-butanol 분획물은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 자원으로서의 가치가 충분히 있을 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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