[논문]귀리 Ethyl acetate 분획물의 예쁜 꼬마선충 내의 항산화 효과

권강무; 김준형; 양재헌; 기별희; 황인현; 김대근

doi:10.22889/kjp.2021.52.4.251

귀리 Ethyl acetate 분획물의 예쁜 꼬마선충 내의 항산화 효과
Antioxidant Activity of Ethyl acetate Fraction of Oat in Caenorhabditis elegans 원문보기

생약학회지, v.52 no.4, 2021년, pp.251 - 256

권강무 (우석대학교 약학과) , 김준형 (우석대학교 식품생명공학과) , 양재헌 (아이나라) , 기별희 (아이나라) , 황인현 (우석대학교 약학과) , 김대근 (우석대학교 약학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Oat, the seeds of Avena sativa L. (Gramineae), is an important dietary staple for people in many countries. Previous studies reported that A. sativa had various pharmacological effects such as anti-inflammatory, antitumor, neurotonic, and antispasmodic activities. In this study, Caenorhabditis elegans model system was used to investigate the antioxidant activity of methanol extract of oat. The ethyl acetate soluble fraction of the oat methanol extract showed the best DPPH radical scavenging activity. The ethyl acetate fraction was measured for the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase, and oxidative stress tolerance by using C. elegans along with reactive oxygen species (ROS) level. In addition, to confirm that the regulation of the stress response gene is responsible for the increased stress tolerance of C. elegans treated by the ethyl acetate fraction, SOD-3 expression was measured using GFP-expressing transgenic worm. As a result, the ethyl acetate fraction increased SOD and catalase activities, and decreased ROS accumulation in a dose-dependent manner. In addition, the ethyl acetate fraction-treated CF1553 worm showed higher SOD-3::GFP intensity compared to the control.

주제어

표/그림 (6)

$Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from the A. sativa seeds. MC: methylene chloride, EA: ethyl acetate.$ 그림 Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from the A. sativa seeds. MC: methylene chloride, EA: ethyl acetate.
$Fig. 2. Effects of ethyl acetate fraction of A. sativa seeds on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O2- and the SOD activity was estimated spectrophotometrically through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H2O2, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of thre e independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at * p<0.05, ** p<0.01 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 2. Effects of ethyl acetate fraction of A. sativa seeds on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O₂- and the SOD activity was estimated spectrophotometrically through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H₂O₂, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of thre e independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at * p<0.05, ** p<0.01 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.
$Fig. 3. Effects of ethyl acetate fraction of A. sativa seeds on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at ***p<0.001 by the one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 3. Effects of ethyl acetate fraction of A. sativa seeds on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at ***p<0.001 by the one-way ANOVA.
$Fig. 4. Effects of ethyl acetate fractions of A. sativa seeds on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.$ 그림 Fig. 4. Effects of ethyl acetate fractions of A. sativa seeds on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.
$Table I. Effects of ethyl acetate fraction of A. sativa seeds on the oxidative stress tolerance of C. elegans$ 표 Table I. Effects of ethyl acetate fraction of A. sativa seeds on the oxidative stress tolerance of C. elegans
$Fig. 5. Effect of ethyl acetate fraction of A. sativa seeds on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of ethyl acetate fraction. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 30 to 50 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05 and ** p<0.01 by oneway ANOVA.$ 그림 Fig. 5. Effect of ethyl acetate fraction of A. sativa seeds on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of ethyl acetate fraction. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 30 to 50 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05 and ** p<0.01 by oneway ANOVA.

AI 본문요약
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제안 방법

추출 및 분획 − 분쇄한 귀리 600g을 methanol로 진탕하면서 3시간씩 50°C에서 각각 2회 추출하였다. 그 추출액을수욕상에서 감압농축하여 귀리 methanol 엑스 약 27.4 g을얻었으며, 이 methanol 엑스를 증류수로 현탁시켜 methylene chloride(13.3 g), ethyl acetate(0.5 g) 및 n-butanol(2.8 g) 의순으로 용매 분획하여 각각의 분획물을 얻었다.
추출 및 분획 − 분쇄한 귀리 600g을 methanol로 진탕하면서 3시간씩 50°C에서 각각 2회 추출하였다
형질 전환 선충 내 SOD-3의 발현 증가 효능 − 귀리 ethyl acetate 분획의 선충 내에서 산화적 스트레스에 저항하기 위한 단백질의 증가 여부를 확인하기 위해서 SOD 발현 유전자의 증가 여부를 확인 하였다

대상 데이터

실험재료 − 실험에 사용한 귀리는 시중에서 구입하여 김대근 교수가 검증한 후에 세말로 분쇄하여 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WS -21-003).

데이터처리

그룹간의 통계적 유의성 검정은 Student’s t-test를 통해서 분석하였고 선충의 연속적인 생존도 는 Log-rank test 분석 방법을 이용하였다
성체가 된 후 4일째에 사용하였으며, 선충은 sodium azide(4%)로 마취시켰고 GFP 발현은 형광 실체 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 발현강도를 정량, 분석하기 위해 현미경을 이용한 사진 촬영과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며, 모든 실험은 3회 반복하였다.
통계 분석 − 통계 자료의 값은 평균값 ± 표준오차(mean ±S.E.M.)로 표시 하였다

성능/효과

SOD-3을 포함한 형질 전환 선충 CF1553을 사용하여 실험한 결과 CF1553 형질전환 선충에 귈 ethyl acetate 분획 500 μg/mL 처리군이 처리되지 않은 선충에 비해 높은 SOD-3::GFP 발현율(21.2%, *p<0.05)을 보여 주었다(Fig
귀리 ethyl acetate 분획은 DPPH free radical 소거 활성을 농도 의존적으로 보여주었으며, 예쁜꼬마선충을 이용한 항산화 실험에서도 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것을 확인하였다. 선충 세포 내의 활성 산소종의 발생을 농도의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 산화적 스트레스 조건하에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다.
산화적 스트레스 저항성 증가 효능 − 귀리 ethyl acetate 분획을 juglone으로 산화적 스트레스를 유도한 선충의 생존율에 미치는 영향 평가실험에서 분획을 처리하지 않은 대조군 선충의 최고 생존시간은 24시간이었으나, ethyl acetate 분획 500 µg/mL 농도에서는 생존시간을 30시간으로 증가시켰다
귀리 ethyl acetate 분획은 DPPH free radical 소거 활성을 농도 의존적으로 보여주었으며, 예쁜꼬마선충을 이용한 항산화 실험에서도 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것을 확인하였다. 선충 세포 내의 활성 산소종의 발생을 농도의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 산화적 스트레스 조건하에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이와 관련하여 형질전환된 mutant인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 산화적 스트레스 저항성 단백질 발현 실험에서 산화적 스트레스에 저항성이 있는 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다.
선충 세포 내의 활성 산소종의 발생을 농도의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 산화적 스트레스 조건하에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이와 관련하여 형질전환된 mutant인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 산화적 스트레스 저항성 단백질 발현 실험에서 산화적 스트레스에 저항성이 있는 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 귀리 ethyl acetate 분획은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 자원으로서의 가치가 있을 것으로 사료된다.

후속연구

이와 관련하여 형질전환된 mutant인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 산화적 스트레스 저항성 단백질 발현 실험에서 산화적 스트레스에 저항성이 있는 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 귀리 ethyl acetate 분획은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 자원으로서의 가치가 있을 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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