[논문]전장유전체 SNP 기반 decision tree를 이용한 누에 품종 판별

박종우; 박정선; 정찬영; 권혁규; 강상국; 김성완; 김남숙; 김기영; 김익수

doi:10.5352/jls.2022.32.12.947

[국내논문] 전장유전체 SNP 기반 decision tree를 이용한 누에 품종 판별
Identification of Domesticated Silkworm Varieties Using a Whole Genome Single Nucleotide Polymorphisms-based Decision Tree 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.12, 2022년, pp.947 - 955

박종우 (국립농업과학원 농업생물부) , 박정선 (전남대학교 응용생물학과) , 정찬영 (국립농업과학원 농업생물부) , 권혁규 (국립농업과학원 농업생물부) , 강상국 (국립농업과학원 농업생물부) , 김성완 (국립농업과학원 농업생물부) , 김남숙 (국립농업과학원 농업생물부) , 김기영 (국립농업과학원 농업생물부) , 김익수 (전남대학교 응용생물학과)

초록
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최근 건강 기능성 식품으로 주목받고 있는 누에가 품종 간 기능성 차이를 나타냄에 따라 품종판별에 대한 필요성이 대두되고 있다. 본 연구에서는 누에의 유전체 내에 존재하는 단일염기가형성(SNP)를 바이오 마커로 이용해 10개의 누에 품종(백황잠, 백옥잠, 대백잠, 대박잠, 대황잠, 골든실크, 항생잠, 주황잠, 금강잠 및 금옥잠)을 판별하기 위하여 전장유전체를 분석하였다. 또한 각 품종 특이적인 SNP를 선발하여 품종을 판별하고자 9개의 SNP를 선발하고 각 품종을 교차 검증 할 수 있는 결정 트리를 작성하여 순차적인 분석을 통한 품종 구분을 실시하였다. 대황잠과 골든실크 그리고 금강잠과 대박잠을 구분하는 각각의 SNP867 및 SNP9183에 대해서는 Restriction fragment length polymorphism을 이용하고, 그 외의 SNP에 대해서는 Tetra-primer Amplification Refractory Mutation System을 이용하여 분석하였다. 그 결과 SNP780부터 SNP9183까지 9개의 SNP를 이용하여 동일 집단을 분리하거나 품종을 선발할 수 있었으며, 해당 영역에 대한 염기서열 분석 결과 대립 유전자가 일치함을 확인하였다. 이러한 결과를 종합해볼 때, 누에 전체 게놈의 SNP와 결정 트리를 이용한 방법은 누에 품종 구분을 위한 판별마커로 이용 가치가 높을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Silkworms, which have recently shown promise as functional health foods, show functional differences between varieties; therefore, the need for variety identification is emerging. In this study, we analyzed the whole silkworm genome to identify 10 unique silkworm varieties (Baekhwang, Baekok, Daebaek, Daebak, Daehwang, Goldensilk, Hansaeng, Joohwang, Kumkang, and Kumok) using single nucleotide polymorphisms (SNP) present in the genome as biomarkers. In addition, nine SNPs were selected to discriminate between varieties by selecting SNPs specific to each variety. We subsequently created a decision tree capable of cross-verifying each variety and classifying the varieties through sequential analysis. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) was used for SNP867 and SNP9183 to differentiate between the varieties of Daehwang and Goldensilk and between Kumkang and Daebak, respectively. A tetra-primer amplification refractory (T-ARMS) mutation was used to analyze the remaining SNPs. As a result, we could isolate the same group or select an individual variety using the nine unique SNPs from SNP780 to SNP9183. Furthermore, nucleotide sequence analysis for the region confirmed that the alleles were identical. In conclusion, our results show that combining SNP analysis of the whole silkworm genome with the decision tree is of high value as a discriminative marker for classifying silkworm varieties.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. Sequence of T-ARMS-PCR primers used for the identification of silkworm varieties
표 Table 2. Sequence of T-ARMS-PCR primers used for the identification of silkworm varieties
표 Table 3. SNP positions and alleles in the whole genome f classification of 10 varieties
그림 Fig. 1. Whole genome SNP based decision tree for the identication of 10 silkworm varieties. The letter in the circle is the SNP number, the letter in the box is varieties, and the letter in the diagonal line is the allele.
그림 Fig. 2. GoldenSilk and DaeHwang specific SNPs verification using tetra-primer ARMS PCR and sequence alignments of the SNP regions. (A) SNP780 analysis to isolate GoldenSilk and DaeHwang into different groups. (B) SNP867 analysis to differentiate between Golden Silk and DaeHwang. The boxes within the sequence alignments are alleles of each SNPs. BO, BaekOk; HS, HanSaeng; KK, KumKang; DB, DaeBak; BH, Baek Hwang; DBK, DaeBaek; GS, GoldenSilk; KO, Kum Ok.; JH, JooHwang; DH, DaeHwang. Genotyping was performed on 10 individuals per varieties.
그림 Fig. 3. DaeBak specific SNPs verification using PCR-RFLP and sequence alignments of the SNP regions. To distingquish the DaeBak, SNP1169 was amplified by PCR and compared by treatment with restriction enzyme Ahd I. The box within the sequence alignments are alleles of each SNPs. DB, DaeBak; BO, BaekOk; HS, HanSaeng; KK, KumKang; DBK, DaeBaek; BH, BaekHwang; KO, KumOk.; JH, JooHwang. Genotyping was performed on 10 individuals per varieties.
그림 Fig. 4. BaekHwang and KumOk specific SNPs verification using tetra-primer ARMS PCR and sequence alignments of the SNP regions. (A) SNP1271 analysis to isolate BaekHwang and KumOk into different groups. (B) SNP427 analysis to differentiate between BaekHwang and KumOk. The boxes within the sequence alignments are alleles of each SNPs. BO, BaekOk; HS, Han Saeng; KK, KumKang; DBK, DaeBaek; BH, Baek Hwang; KO, KumOk.; JH, JooHwang. Genotyping was performed on 10 individuals per varieties.
그림 Fig. 5. JooHwang and HanSaeng specific SNPs verification using tetra-primer ARMS PCR and sequence alignments of the SNP regions. (A) SNP4165 analysis to isolate JooHwang into different groups. (B) SNP4381 analysis to isolate HanSaeng into different groups. The boxes within the sequence alignments are alleles of each SNPs. JH, JooHwang; BO, BaekOk; HS, HanSaeng; KK, KumKang; DBK, DaeBaek. Genotyping was performed on 10 individuals per varieties.
그림 Fig. 6. BaekOk and DaeBaek specific SNPs verification using PCR and sequence alignments of the SNP regions. (A) To isolate the BaekOk, SNP4545 was amplified by using tetra-primer ARMS PCR. (B) To distingquish the DaeBaek, SNP9183 was amplified by PCR and compared by treatment with restriction enzyme Ssp I. The box within the sequence alignments are alleles of each SNPs. BO, BaekOk; KK, KumKang; DBK, DaeBaek. Genotyping was performed on 10 individuals per varieties.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 본 연구에서는 장려품종 누에 10종의 전장유전체서열을 분석하고, 각 품종에 특이적인 2종의 SNP를 선발하여 이를 이용한 decision tree 작성 및 순차 진단을 통한 주요 누에 장려 품종에 대한 판별을 실시하고 마커로서 이용하기 위한 방법을 탐색하고자 하였다.

제안 방법

각 영역의 증폭은 Taq DNA polymerase (Takara, Japan)와 Thermal cycler (Takara, Japan)를 이용하여 94°C에서 2분간 초기 변성 후, 94°C에서 1분, 50°C에서 1분 및 72°C에서 1분 주기를 30회 반복하고, 최종적으로 72°C에서 4분간 각 SNP 영역을 증폭하였다. Tetra-ARMS PCR primer를 이용한 증폭 산물의 경우 바로 2% agarose gels를 이용하여 전기영동하고, RFLP 분석을 위한 증폭 산물의 중 SNP867에 대해서는 Ahd I 효소와 SNP9183에 대해서는 Ssp I 효소를 한시간 동안 처리 후 2% agarose gels에 전기영동하여 밴드의 크기를 비교하였다. 각 증폭산물에 대한 대립유전자 서열 검증을 위하여 외부 primer 쌍에 의해 증폭된 밴드를 pGem-T easy vector system (Promega, USA)에 클로닝 후 universal primer를 이용하여 서열 분석을 실시하였다.
확보된 변이를 대상으로 한 Filtering을 통해 Machine learning classifier를 이용하여 품종구분 모델을 구축에 활용할 고품질 homo type SNP 총 11,640개 확보하였다. 확보된 11,640개의 SNP 정보를 이용하여 J48 classifier를 이용하여 10-fold cross validation 기준 100% 정확도를 보이는 decision tree를 구축하고 이를 위한 9개의 SNP 마커를 확보하였다. 선발된 SNP780과 SNP867이 13번 염색체에 존재하였으며, SNP 1169와 SNP1271이 10번 염색체에 존재하였으며, 그 밖에 SNP들은 각기 다른 염색체 상에 존재하였다(Table 3).
Decision tree (Fig. 1) 상의 SNP1169에 의해 하위영역으로 분리된 7개의 품종 중 금옥잠과 백황잠을 판별하기 위하여 SNP1271 영역에 대해 T-ARMS PCR을 실시하고 Fig. 4A에 나타내었다.
Decision tree (Fig. 1) 상 SNP1271의 하위영역으로 구분되어진 5개의 품종 중 주황잠을 판별하기 위하여 SNP 4165 영역에 대해 T-ARMS PCR을 실시하고 Fig. 5A에 나타내었다.
주황잠 이외의 4개 품종 중 한생잠을 판별하기 위해서는 SNP4381 영역에 대해 T-ARMS PCR을 실시하여 구분하였다(Fig. 5B).
그 결과, 백옥잠은 262와 106 bp의 밴드가 증폭되었고 금강잠 및 대백잠에서는 262와 197bp의 밴드가 증폭되어 3개 품종 중 백옥잠만을 구분할 수 있었으며, 대립유전자 검증을 위하여 262 bp의 증폭 산물에 대해 염기서열을 분석한 결과 T>G 변이가 확인되었다. 마지막으로, 금강잠과 대백잠을 구분하기 위해서는 SNP9183 영역에 대한 증폭 후 Ssp I 제한효소를 처리하여 각 품종을 판별하였다(Fig. 6B).
준비된 T-ARMS PCR 및 RFLP 검증을 위한 Table 1의 프라이머와 서열분석을 위하여 추출한 genomic DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 영역의 증폭은 Taq DNA polymerase (Takara, Japan)와 Thermal cycler (Takara, Japan)를 이용하여 94°C에서 2분간 초기 변성 후, 94°C에서 1분, 50°C에서 1분 및 72°C에서 1분 주기를 30회 반복하고, 최종적으로 72°C에서 4분간 각 SNP 영역을 증폭하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 장려품종 누에는 품종 육성 용 원종 교배종인 Daehwang (Jam 323×324), Joohwang (Jam 325×326, Goldensilk (Jam 311×312), Daebaek (Jam 157×162), Hansaeng (Jam 153×154), Daebak (Jam 155×156), Kumkang (Jam 159×160), Kumok (Jam 125×140), Baekok (Jam 123×124), Baekhwang (Jam 327×328)을 이용하였으며, 누에 사육은 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육기준(온도, 24～27℃, 습도, 70～90%)에 준하여 신선한 뽕잎을 급여하고 25℃, 16L8D의 조건에서 사육하였다.
품종 특이적인 SNP 선발을 위하여 염기서열분석 결과와 기 분석된 집누에의 참조유전체 서열정보를 바탕으로 Samtools를 이용한 변이추출을 진행한 결과, 10개 품종에서 총 22,450,538개의 변이가 확보되었다. 확보된 변이를 대상으로 한 Filtering을 통해 Machine learning classifier를 이용하여 품종구분 모델을 구축에 활용할 고품질 homo type SNP 총 11,640개 확보하였다. 확보된 11,640개의 SNP 정보를 이용하여 J48 classifier를 이용하여 10-fold cross validation 기준 100% 정확도를 보이는 decision tree를 구축하고 이를 위한 9개의 SNP 마커를 확보하였다.

데이터처리

Tetra-ARMS PCR primer를 이용한 증폭 산물의 경우 바로 2% agarose gels를 이용하여 전기영동하고, RFLP 분석을 위한 증폭 산물의 중 SNP867에 대해서는 Ahd I 효소와 SNP9183에 대해서는 Ssp I 효소를 한시간 동안 처리 후 2% agarose gels에 전기영동하여 밴드의 크기를 비교하였다. 각 증폭산물에 대한 대립유전자 서열 검증을 위하여 외부 primer 쌍에 의해 증폭된 밴드를 pGem-T easy vector system (Promega, USA)에 클로닝 후 universal primer를 이용하여 서열 분석을 실시하였다.

성능/효과

2), SNP780에서는 A>T 변이가, SNP867 영역에서는 G>A 변이가 확인되어 두개의 SNP를 이용했을 때 10개 장려품종 중 골든실크와 대황잠을 정확히 구분할 수 있었다.
누에 품종 구분 마커 개발을 위하여, 백옥잠, 대황잠, 주황잠, 골든실크, 대백잠, 한생잠, 대박누에, 금강잠, 금옥잠, 백황잠 10개 품종을 대상으로 각 품종별 10개체씩 DNA를 추출하고 농도 및 순도를 분석한 결과 NGS 서열 분석에 충분한 DNA가 확보되었다. 염기서열 분석을 위하여 데이터를 생산한 결과, 총 587,123,548,200 bp의 염기서열이 분석되었고, 품질점수는 86.
누에 품종 구분 마커 개발을 위하여, 백옥잠, 대황잠, 주황잠, 골든실크, 대백잠, 한생잠, 대박누에, 금강잠, 금옥잠, 백황잠 10개 품종을 대상으로 각 품종별 10개체씩 DNA를 추출하고 농도 및 순도를 분석한 결과 NGS 서열 분석에 충분한 DNA가 확보되었다. 염기서열 분석을 위하여 데이터를 생산한 결과, 총 587,123,548,200 bp의 염기서열이 분석되었고, 품질점수는 86.85%가 Q30 이상으로 99.9%의 정확성을 나타냈다. 생산된 데이터에 대해 Index sequence를 이용한 De-multiplexing을 수행하여 누에 10개 품종 100개체의 개별 시료에 대한 데이터를 확보한 결과, 100개체의 시료 중 최소 데이터 생산량은 약 4.
9%의 정확성을 나타냈다. 생산된 데이터에 대해 Index sequence를 이용한 De-multiplexing을 수행하여 누에 10개 품종 100개체의 개별 시료에 대한 데이터를 확보한 결과, 100개체의 시료 중 최소 데이터 생산량은 약 4.3 Gb 였으며, 이러한 결과는 보편적인 곤충의 게놈의 크기를 1 Gb 미만으로 가정했을 때, 각 시료에서 일반적인 곤충의 약 4배 이상의 서열데이터가 확보된 것 판단된다.
품종 특이적인 SNP 선발을 위하여 염기서열분석 결과와 기 분석된 집누에의 참조유전체 서열정보를 바탕으로 Samtools를 이용한 변이추출을 진행한 결과, 10개 품종에서 총 22,450,538개의 변이가 확보되었다. 확보된 변이를 대상으로 한 Filtering을 통해 Machine learning classifier를 이용하여 품종구분 모델을 구축에 활용할 고품질 homo type SNP 총 11,640개 확보하였다.
각 SNP를 이용하여 10개의 품종을 구분하기위하여 decision tree를 작성한 결과(Fig. 1), 9개의 SNP 대한 순차적인 분석을 통해 품종이 구분되는 것으로 확인 되었다.
T-ARMS PCR을 통해 SNP780 영역을 증폭하고 전기영동을 통해 밴드의 크기를 분석한 결과(Fig. 2A), 대황잠과 골든실크에서는 175와 265 bp 크기의 밴드가 생성되는 반면, 대박잠을 포함하는 8개 품종에서는 135와 265 bp 크기에 밴드가 형성되어 품종을 두개의 그룹으로 분리할 수 있었다. 이후 대황잠과 골든실크를 세부적으로 구분하기 위하여 SNP867에 대하여 T-ARMS PCR을 수행한 결과(Fig.
2A), 대황잠과 골든실크에서는 175와 265 bp 크기의 밴드가 생성되는 반면, 대박잠을 포함하는 8개 품종에서는 135와 265 bp 크기에 밴드가 형성되어 품종을 두개의 그룹으로 분리할 수 있었다. 이후 대황잠과 골든실크를 세부적으로 구분하기 위하여 SNP867에 대하여 T-ARMS PCR을 수행한 결과(Fig. 2B), 대황잠에서는 501과 376 bp 크기의 밴드가 확인되었으며 골든실크에서는 501과 167 bp 크기가 증폭되어 두개의 품종이 명확하게 구분되었다.
이후 대황잠과 골든실크를 세부적으로 구분하기 위하여 SNP867에 대하여 T-ARMS PCR을 수행한 결과(Fig. 2B), 대황잠에서는 501과 376 bp 크기의 밴드가 확인되었으며 골든실크에서는 501과 167 bp 크기가 증폭되어 두개의 품종이 명확하게 구분되었다. 증폭된 SNP 영역에 대한 대립유전자 서열정보를 확인하기 위하여 SNP780 영역에서는 265 bp와 SNP867 영역에서 501 bp 증폭 산물의 염기서열을 분석한 결과(Fig.
2B), 대황잠에서는 501과 376 bp 크기의 밴드가 확인되었으며 골든실크에서는 501과 167 bp 크기가 증폭되어 두개의 품종이 명확하게 구분되었다. 증폭된 SNP 영역에 대한 대립유전자 서열정보를 확인하기 위하여 SNP780 영역에서는 265 bp와 SNP867 영역에서 501 bp 증폭 산물의 염기서열을 분석한 결과(Fig. 2), SNP780에서는 A>T 변이가, SNP867 영역에서는 G>A 변이가 확인되어 두개의 SNP를 이용했을 때 10개 장려품종 중 골든실크와 대황잠을 정확히 구분할 수 있었다.
증폭된 SNP1169 영역에 대한 대립유전자를 검증하기 위하여 제한효소를 처리하기전인 980 bp의 증폭 산물에 대한 염기서열을 분석한 결과, 대박잠에서만 A>C변이가 확인되어 SNP1169 영역에 대한 증폭 및 제한효소 처리를 통해 SNP780 검증에서 분리된 8개 품종 중 대박잠을 정확하게 구분할 수 있었다.
그 결과, 주황잠에서는 487과 138 bp의 밴드가 나타난 반면 한생잠을 포함하는 4개 품종에서는 487과 392 bp의 밴드가 나타나 주황잠을 구분할 수 있었으며, 487 bp의 증폭 산물에 대한 염기서열 분석 결과 주황잠에서만 C>T의 변이를 가지고 있었다.
증폭된 SNP 영역에 대한 대립유전자 서열정보를 확인하기 위하여 SNP1271영역에서는 414 bp와 SNP427 영역에서 319 bp 증폭 산물의 염기 서열을 분석한 결과(Fig 4), SNP1271에서는 T>C 변이가, SNP427 영역에서는 T>C 변이가 확인되어 두개의 SNP를 이용했을 때, SNP1169에 의해 하위영역으로 분리된 7개의 품종 중 금옥잠과 백황잠을 정확히 구분할 수 있었다.
3에 나타내었다. 그 결과, SNP1169 영역에 대한 증폭 산물의 크기는 980 bp 이지만, 내부에 제한효소 Ahd I의 절단부위가 2번 존재하는 대박잠의 경우 108, 634, 및 238 bp 크기의 세개 밴드가 형성되고, 증폭산물내에 Ahd I의 절단부위가 한번만 존재하는 금옥잠 포함 7개 품종에서는 108과 872 bp 크기의 밴드 두개만 나타나 대박잠과 차이를 나타냈다(Fig. 3A).
4A에 나타내었다. 그 결과, 금옥잠과 백황잠에서는 414 및 180 bp의 밴드가 나타난 반면, 주황잠을 포함하는 5개의 품종에서는 414와 278 bp의 밴드가 나타나 밴드 크기를 통해 2개의 그룹으로 분리가 가능하였다. 분리된 그룹 중 금옥잠과 백황잠을 각각 판별하기 위하여 SNP427에 대해여 분석한 결과(Fig.
그 결과, 한생잠에서는 391 및 271 bp의 밴드가 형성되었고 백옥잠을 포함하는 3개 품종에서는 391과 164 bp의 밴드가 확인되어 한생잠만을 구분할 수 있었으며, 대립유전자를 검증하기 위하여 391 bp 증폭 산물에 대해 염기서열을 분석한 결과 한생잠에서만 G>T의 변이가 확인 되었다.
제한효소를 처리하지않은 543 bp의 증폭산물에 대해 염기서열을 분석한 결과, 두 품종에서는 SNP9183 영역에 대립 형질로 A>G를 가지고 있음이 확인되었다.
그 결과, 백옥잠은 262와 106 bp의 밴드가 증폭되었고 금강잠 및 대백잠에서는 262와 197bp의 밴드가 증폭되어 3개 품종 중 백옥잠만을 구분할 수 있었으며, 대립유전자 검증을 위하여 262 bp의 증폭 산물에 대해 염기서열을 분석한 결과 T>G 변이가 확인되었다
Decision tree (Fig. 1)의 최하위 부분에 존재해는 3개 품종에 대해 판별하기위하여, 백옥잠의 경우 SNP4545 영역을 T-ARMS PCR을 통하여 증폭하였다(Fig. 6A).
6B). SNP9183 영역에 대한 증폭 산물의 크기는 543 bp이며 금강잠의 경우 제한효소부위가 1개만 존재해 109와 434 bp 두개의 밴드가 형성되는 반면 대백잠에서는 2개의 제한 효소 부위가 존재해 109, 268, 및 167 bp 세개의 밴드가 나타나 금강잠과 명확하게 구분되었다. 제한효소를 처리하지않은 543 bp의 증폭산물에 대해 염기서열을 분석한 결과, 두 품종에서는 SNP9183 영역에 대립 형질로 A>G를 가지고 있음이 확인되었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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