[논문]NF-κB 신호경로에서 CLK3의 새로운 음성 조절자로서의 기능

전별은; 권찬성; 이지은; 우예린; 김상우

doi:10.5352/jls.2022.32.11.833

NF-κB 신호경로에서 CLK3의 새로운 음성 조절자로서의 기능
CLK3 is a Novel Negative Regulator of NF-κB Signaling 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.11, 2022년, pp.833 - 840

전별은 (부산대학교 자연과학대학 생명과학과) , 권찬성 (부산대학교 자연과학대학 생명과학과) , 이지은 (부산대학교 자연과학대학 생명과학과) , 우예린 (부산대학교 자연과학대학 생명과학과) , 김상우 (부산대학교 자연과학대학 생명과학과)

초록
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만성 염증은 종양의 발생 및 진행과 밀접하게 연관되어 있다. 핵인자 kappa B (NF-κB)는 5개의 전사인자로 구성되며 염증 반응에 필수적인 역할을 한다. 다양한 암에서 NF-κB의 조절장애가 보고되고 있으며 NF-κB 조절이 암 치료에 있어 핵심 표적이 된다. 본 연구에서는 CDC Like Kinase 3 (CLK3)를 NF-κB 신호전달 경로를 조절하는 새로운 키네이스임을 확인하였다. 우리는 CLK3가 정규 및 비정규 NF-κB 신호전달경로를 억제하는 것을 밝혔다. CLK3 과발현 또는 knock-down 세포주를 이용한 루시퍼레이즈 분석 결과, 이 키네이스는 TNFα와 PMA가 유도하는 정규 NF-κB 신호전달경로 활성을 억제하였다. 또한 CLK3 과발현은 잘 알려진 비정규 NF-κB 신호경로 유도제인 NF-κB-inducing kinase (NIK) 또는 CD40에 의한 NF-κB 활성을 저해하였다. 추가적으로 CLK3의 NF-κB 신호전달 저해기전을 설명하고자 TNFα 처리 후 웨스턴 블롯 분석으로 이 키네이스 영향권 내에 있는 NF-κB 신호경로 분자들을 식별하였다. 그 결과 CLK3가 TAK1, IKKα/α, p65, IκBα 및 ERK1/2-MAPK의 인산화/활성화를 저해하여 TNFα 처리로 유도된 NF-κB 및 MAPK 신호경로를 모두 억제함을 밝혔다. 앞으로의 연구는 CLK3가 정규 및 비정규 NF-κB 경로를 억제하는 기작을 밝히는데 초점을 맞출 것이다. 위 연구 결과들을 토대로 CLK3가 NF-κB 신호전달경로의 새로운 음성 조절자로써 기능함을 제시하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Chronic inflammation has been shown to be closely associated with tumor development and progression. Nuclear factor kappa B (NF-κB) is composed of a family of five transcription factors. NF-κB signaling plays a crucial role in the inflammatory response and is often found to be dysregulated in various types of cancer, making it an attractive target in cancer therapeutics. In this study, CDC-like kinase 3 (CLK3) was identified as a novel kinase that regulates the NF-κB signaling pathway. Our data demonstrate that CLK3 inhibits the canonical and non-canonical NF-κB pathways. Luciferase assays following the transient or stable expression of CLK3 indicated that this kinase inhibited NF-κB activation mediated by Tumor necrosis factor-alpha (TNFα) and Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), which are known to activate NF-κB signaling via the canonical pathway. Consistent with data on the ectopic expression of CLK3, CLK3 knockdown using shRNA constructs increased NF-κB activity 1.5-fold upon stimulation with TNFα in HEK293 cells compared with the control cells. Additionally, overexpression of CLK3 suppressed the activation of this signaling pathway induced by NF-κB-inducing kinase (NIK) or CD40, which are well-established activators of the non-canonical pathway. To further examine the negative impact of CLK3 on NF-κB signaling, we performed Western blotting following the TNFα treatment to directly identify the molecular components of the NF-κB pathway that are affected by this kinase. Our results revealed that CLK3 mitigated the phosphorylation/activation of transforming growth factor-α-activated kinase 1 (TAK1), inhibitor of NF-κB kinase alpha/beta (IKKα/α), NF-κB p65 (RelA), NF-κB inhibitor alpha (IκBα), and Extracellular signal-regulated kinase 1/2-Mitogen-activated protein kinase (ERK1/2-MAPK), suggesting that CLK3 inhibits both the NF-κB and MAPK signaling activated by TNFα exposure. Further studies are required to elucidate the mechanism by which CLK3 inhibits the canonical and non-canonical NF-κB pathways. Collectively, these findings reveal CLK3 as a novel negative regulator of NF-κB signaling.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. CLK3 inhibits canonical NF-κB signaling. HEK293 cells were transfected with either vector control or CLK3 along with NF-κB luciferase constructs (firefly) and renilla constructs and incubated for 24 hr. Then, cells were exposed to TNFα (100 ng/ml) (A) or PMA (200 ng/ml) (B). After 6 hr incubation, dual luciferase reporter assays were performed. NF-κB firefly luciferase activity was normalized to renilla luciferase activity. Statistical significance was calculated using the two-tailed one-way analysis of variance (ANOVA) test (*p<0.05). (C) Human colorectal cancer cell line HCT116 cells transduced with either MSCV vector control or MSCV-CLK3 were lysed and ectopic expression of CLK3 was analyzed by Western blot. (D) HCT116 cells stably expressing either vector control or CLK3 were treated with vehicle or TNFα (100 ng/ml) (D) or for PMA (200 ng/ml) (E), followed by dual luciferase reporter assays. The two-tailed Mann-Whitney test was used to calculate statistical significance (*p<0.05).
그림 Fig. 2. Knock-down of CLK3 activates canonical NF-κB signals. (A) HEK293 cells transduced with either CDH-scramble vector control or shRNA-CLK3 were lysed and downregulation of CLK3 was analyzed by Western blot. (B) HEK293 cells stably expressing either vector control or shRNA-CLK3 were treated with vehicle or TNFα (100 ng/ml), followed by dual luciferase reporter assays. Statistical significance was calculated using the two-tailed Mann-Whitney test (*p<0.05).
그림 Fig. 3. CLK3 inhibits non-canonical NF-κB signaling. HEK293 cells were transfected with either NIK (40 ng/ml) (A) or CD40 (100 ng/ml) (B) in the presence or absence of CLK3, followed by dual luciferase reporter assays. Statistical significance was calculated using the two-tailed one-way analysis of variance (ANOVA) test (*p<0.05). HCT116 cells transduced with either MSCV or MSCV-CLK3 were transfected with NIK (80 ng/ml) (C) of CD40 (100 ng/ml) (D), followed by assessment of NF-κB activity by dual luciferase reporter assays. NF-κB firefly luciferase activity was normalized to renilla luciferase activity. The two-tailed Mann-Whitney test was used to calculate statistical significance (*p<0.05).
그림 Fig. 4. CLK3 modulates TNFα-induced phosphorylation/activation of molecular components of NF-κB and MAPK pathway. HEK293 was transfected with either CLK3 (1 μg/ml) or vector. Twenty four hours later, cells were treated with TNFα (100 ng/ml) for 0~8 hr. (A) Protein expression levels of IκBα, and phosphorylation levels of TAK1, IKKα/β, IκBα, and p65 were detected by Western blot. (B) Phosphorylation levels of JNK, ERK1/2 and p38 MAPKs were measured by Western blot. β-actin is used as a loading control.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구 논문에서는 CLK3가 NF-κB 활성화를 조절함과 그에 대한 기작을 밝혔다.
우리는 CLK3가 NF-κB 경로의 활성화에 관여하는 여러 분자중에서 어떤분자에 영향을 미치는지 조사하기로 하였다

가설 설정

앞선 결과로 CLK3 과발현이 NF-κB 활성을 저해하는 것을 보였으므로 우리는 CLK3 저해 시 NF-κB 활성이 증가할 것이라는 가설을 세웠다

제안 방법

CLK3가 MAPK의 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 vector 또는 CLK3를 HEK293 세포주에 형질주입 후 TNFα를 처리하고 JNK, ERK1/2, p38의 인산화 정도를 분석하였다(Fig
CLK3를 안정적으로 발현하는 세포주 제작을 위하여, HEK293 세포주에 MSCV construct와 pKAT 및 VSVG를 Co-transfection 시켜 24시간 후 바이러스 배양액을 얻었다. 바이러스 배양액을 HCT116 세포주에 처리하고 puromycin (1 mg/ml)으로 형질도입된 세포주를 선별하였다.
CLK3을 MSCV-puro vector에 클로닝하기 위하여, Forward : 5’-TTTGGATCCATGCATCACTGTAA-3’, Reverse : 5’-TTTGCTAGCATCTGCTTGGGT-3’ primer를 이용하여 CLK3 암호화 영역을 PCR로 증폭시켰다
HEK293 세포주에 CLK3를 형질주입하고 24시간 후에 TNFα (100 ng/ml)를 0 ~ 8시간 처리 후 웨스턴 블롯을 진행하여 TAK1, IKKα/β, IκBα 그리고 p65의 인산화/활성화 및 IκBα의 단백질 발현 정도를 분석하였다(Fig
본 연구에서는 HEK293에 CLK3를 형질주입하거나 CLK3를 형질도입하여 안정적으로 과발현시키는 HCT116 세포주를 제작하고, 다양한 방법을 이용하여 정규 및 비정규 NF-κB 활성을 유도한 뒤 CLK3가 NF-κB 활성에 미치는 영향을 조사하였다

대상 데이터

Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)사에서 phospho-ERK1/2 (#9101), phospho-IKKα/β (#2697), phospho-p65 (#3033), phospho-TAK1 (#4531), phospho-JNK (#4668), phospho-IκBα (#9247), phospho-p38 (#4511), phospho-JNK (#4668) 1차 항체를 구매하였고, Santa cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)사에서 anti-IκBα (#sc-1643) 와 β-actin (#sc-47778)을 구매하여 사용하였다. 2차항체는 Bethyl (Montgomery, TX, USA)사에서 HRP conjugated anti-rabbit 및 anti-mouse (A120-101p 및 A90-116p-33) 항체를 구매하여 사용하였다.
CLK3 유전자에 대한 lentivirus small hairpin (shRNA) constructs를 Open BioSystems (Huntsville, AL, USA)에서 구입하였고, HEK293 세포주에 Packaging vector와 함께 co-transfection 시켰다. 대조군으로는 CDH-scramble vector를 HEK293 세포주에 Packaging vector와 함께 co-transfection 하였다.
Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)사에서 phospho-ERK1/2 (#9101), phospho-IKKα/β (#2697), phospho-p65 (#3033), phospho-TAK1 (#4531), phospho-JNK (#4668), phospho-IκBα (#9247), phospho-p38 (#4511), phospho-JNK (#4668) 1차 항체를 구매하였고, Santa cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)사에서 anti-IκBα (#sc-1643) 와 β-actin (#sc-47778)을 구매하여 사용하였다
CLK3를 안정적으로 발현하는 세포주 제작을 위하여, HEK293 세포주에 MSCV construct와 pKAT 및 VSVG를 Co-transfection 시켜 24시간 후 바이러스 배양액을 얻었다. 바이러스 배양액을 HCT116 세포주에 처리하고 puromycin (1 mg/ml)으로 형질도입된 세포주를 선별하였다.
인간 대장암 유래 세포주(HCT116; Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea) 및 인간 배아 신장 유래 세포주(HEK293)는 10%의 FBS (Fetal Bovine Serum, Hyclone), 1% L-glutamine, 1% HEPES (N-2-hydrocyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic Acid), 그리고 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM (Welgene; Gyeongsan, Korea) 배지에서 5% 이산화탄소와 37℃ 환경 하에 배양되었다.

데이터처리

통계 처리를 위하여 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타냈으며, 통계적으로 유의미한 차이는 GraphPad Prism (Version 5.03)을 이용하여 two-tailed Mann-Whitney 또는 one-way ANOVA test를 수행하여 결론 지었다

성능/효과

Vector를 형질주입하였을 경우, p38의 경우는 인산화 정도의 변화가 없었으며, ERK1/2의 경우는 약하게, JNK의 경우는 강하게 인산화의 증가를 보였다. CLK3를 형질주입하였을 때, JNK의 인산화가 증가하지 못했고, ERK1/2는 인산화 정도가 감소하는 경향을 보였다. 이는 CLK3가 TNFα에 의해 활성화되는 NF-κB 뿐만 아니라 MAPK의 활성도 억제함을 시사한다.
그 결과, CLK3는 정규와 비정규 NF-κB 신호 경로를 저해함을 밝혔다
대조군인 HEK293 CDH-scramble 과 CLK3가 Knock-down된 HEK293 shRNA-CLK3 세포주에 TNFα를 처리하여 NF-κB 활성을 유도시킨 결과 대조군 대비 CLK3 knock-down 세포주에서 NF-κB 활성이 1.5배 증가하였다(Fig
Vector를 형질주입하고 TNFα를 처리한 경우 보고된 바와 같이 인산화가 효율적으로 증가하였다. 반면에 CLK3를 도입한 경우에는 시간이 지남에 따라 이들 분자 모두의 인산화/활성화 정도가 감소함을 확인하였다. 특히 NF-κB 활성에 가장 중요한 역할을 맡고 있는 IκBα의 인산화에서 큰 차이가 나타났다.
위 실험결과를 종합하면, HEK293과 HCT116 세포주에 형질주입과 형질도입 방식으로 CLK3의 발현을 조절함에 따라 정규 NF-κB 활성이 CLK3에 의해 저해됨을 나타낸다.

후속연구

따라서 NF-κB의 선택적 비활성화를 표적으로 하는 치료제 개발은 지속적으로 이루어져야 하며, 이를 위하여 NF-κB 신호경로에 대한 더 깊은 이해가 반드시 필요하다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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