[논문]생체 흡수율이 증가된 liposomal ascorbic acid 제조법 개발

차지현; 우영민; 조은솔; 차재영; 이상현; 이근우; 김안드레

doi:10.5352/jls.2022.32.3.232

생체 흡수율이 증가된 liposomal ascorbic acid 제조법 개발
Development of a Method for Producing Liposome Ascorbic acid with Increased Bio-absorption 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.3, 2022년, pp.232 - 240

차지현 (신라대학교 바이오과학과 제약공학전공) , 우영민 (신라대학교 바이오과학과 제약공학전공) , 조은솔 ((주)한국리포좀) , 차재영 (신라대학교 바이오과학과 제약공학전공) , 이상현 (신라대학교 바이오과학과 제약공학전공) , 이근우 ((주)한국리포좀) , 김안드레 (신라대학교 바이오과학과 제약공학전공)

초록
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리포좀을 제조하는 방법으로 여러가지 알려져 있다. 그 중 Bangham법이 가장 간단하며 일반적으로 많이 이용되어 왔다. 소규모 실험 수준에서는 효과적으로 리포좀을 제조할 수 있지만 유기용매 제거의 어려움과 지질막 형성에 반응기 크기 등의 문제로 대규모 생산을 할 수 없다는 문제점이 있다. 반면 톤(t) 단위로 대량생산이 가능한 Emulsion Method는 균일한 입자를 가진 리포좀으로 제조가 가능하나 포집률이 현저히 낮은 단점이 있다. 그래서 본 연구에서 높은 포집율과 안정성을 향상시킨 Heating Method으로 리포좀 최적의 공정방법을 개발하여 포집률, 입자크기, 제타전위 및 SD rat에 경구 투여하여 흡수율 실험을 수행하였다. 약 214 nm의 작고 균일한 리포좀을 형성하였고, 포집률은 Emulsion Method는 26.46%, Heating Method는 38.67%으로 Heating Method법을 제조된 리포좀이 높은 포집률을 보여주는 것을 확인할 수 있었다. 혈중 농도 대비 모든 군에서 1.5-2배 정도 증가한 경향을 보여주었고, 4-12 hr까지 점차 낮아지는 양상을 나타냈다. Ascorbic acid powder의 혈중 최고 농도는 약 12.017 ㎍/ml, Emulsion Method 리포좀 13.871 ㎍/ml, Heating Method 리포좀은 16.322 ㎍/ml 순으로 ascorbic acid powder보다 향상된 흡수율 결과를 보여주었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Various methods are known for preparing liposomes, the simplest being the Bangham method which has been widely used. Although it is possible to produce liposomes effectively on a small experimental level with this approach, large-scale production cannot be easily performed due to difficulties in removing the organic solvent and the size of the reactor required to form the lipid film. On the other hand, emulsion can mass produce tons of liposomes with uniform particles but has the disadvantage of a significantly low capture rate. This study therefore developed an optimal liposome processing method using heat with improved capture rate and stability, and bio-absorption experiments were performed by oral administration to SD rat alongside capture rate, particle size, and zeta potential. Through the heating method, a small and uniform liposome of about 214 nm was formed and the capture rate was 38.67%, confirming that the liposome prepared by heating has a higher capture rate than the 26.46% achieved through emulsion. Comparing blood concentrations, it showed a 1.5 to 2 fold increase in all groups, gradually decreasing until 4-12 hr. The highest blood concentration of ascorbic acid powder was about 12.017 ㎍/ml, the emulsion liposome 13.871 ㎍/ml, and the heating liposome 16.322 ㎍/ml, thereby showing an improved absorption rate.

주제어

표/그림 (13)

그림 Fig. 1. Liposome preparation method. The manufacturing process (A) by the emulsion and the heating method (B) are diagrammed.
표 Table 1. HPLC condition. Conditions for HPLC analysis for encapsulation efficiency of liposomal vitamin C
표 Table 2. HPLC-TUV condition. Conditions for HPLC-TUV analysis for encapsulation efficiency of liposomal vitamin C
그림 Fig. 2. HPLC peak result. The ascorbic acid peak of the emulsion method (A), and the ascorbic acid peak of the heating method (B).
그림 Fig. 3. Liposome particle size and zeta potential prepared by Emulsion method (EM) and heating method (HM). Emulsion method (A) and heating method (B) the particle size and zeta potential of the liposome were measured for each concentration of lecithin. All the values were expressed as means ± S.D. (n=5). Values with different letters above the bar graph differ significantly by one-way ANOVA followed by multiple tests of LSD (p<0.05).
그림 Fig. 4. Results of particle size and zeta potential of Emulsion Method liposomal ascorbic acid over time. Changes in particle size (A) and zeta potential (B) of liposome during storage were measured by a nanoparticle analyzer. All the values were expressed as means ± S.D. (n=5). Values with different letters above the bar graph differ significantly by one-way ANOVA followed by multiple tests of LSD (p<0.05).
그림 Fig. 5. Results of particle size and zeta potential of Heating method liposomal ascorbic acid over time. Changes in particle size (A) and zeta potential (B) of liposome during storage were measured by a nanoparticle analyzer. All the values were expressed as means ± S.D. (n=5).
그림 Fig. 6. Liposomal ascorbic acid image observation. The size and shape of (A) emulsion method and (B) heating method were observed.
그림 Fig. 7. Liposomal ascorbic acid image observation. Changes in the size and shape of the liposomes after 7 days were observed. (A) emulsion method and (B) heating method.
그림 Fig. 9. HPLC-TUV. The Chromatogram of Blank plasma (A), The chromatogram of LOQ (Limits Quantification) (B).
그림 Fig. 8. Liposomal ascorbic acid image observation. Changes in the size and shape of the liposomes after 14 days were observed. (A) emulsion method and (B) heating method.
그림 Fig. 10. The Concentration of ascorbic acid in Serum. It is a graph showing the blood concentration of 6 mice in each group. (A) is ascorbic acid powder, (B) is an emulsion liposome, (C) is a heating liposome.
그림 Fig. 11. The Concentration of ascorbic acid in Serum. The mice were compared with the average of the blood concentration of each group for 2 hr after oral administration of 10 ml / kg of vitamin C in a 24 hr. It was reached 1-2 hr and gradually decreased. Compared to vitamin C, Liposomal vitamin C tends to increase about 1.5 times in all the groups.

AI 본문요약
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문제 정의

리포좀의 크기 분포가 매우 광범위하며 가변이 가능한 오일 및 금속 오염이 되는 단점이 있다[15]. 본 연구에서는 포집률이 낮은 emulsion 법의 단점을 보완하여 포집률과 안정성을 향상시킨 최적의 공정조건을 도출하고 리포좀 대량생산 방법을 개발하여 산업화될 수 있는 가능성을 확인하였다.

제안 방법

두 가지 방법으로 제조된 리포좀에 포집된 ascorbic acid를 HPLC로 이용하여 포집율률을 측정하였다. Li 등에 의하면 균질 화법으로 제조된 리포좀의 ascorbic acid 포집률이 다양한 제조법에 비해 낮은 포집률을 보여주었다[13].
본 연구는 향상된 포집률과 약 200 nm의 균일한 리포좀을 제조하였으며, ascorbic acid를 포집한 리포좀의 혈중 농도가 16.322 μg/ml로 약 135% 향상된 제조 방법을 개발하였고 이들의 PK (Pharmaco- kinetics)로 SD rat을 이용하여 추적하였다.
본 연구에서는 emulsion법으로 제조된 리포좀을 가온시키면서 입자들이 서로 응집되어 큰 리포좀을 형성되도록 하였고 그 후 다시 균질화시켜 평균 약 200 nm 범위 내의 작고 균일한 입자들을 제조하였다. 이는 리포좀을 형성하는 물리적인 힘인 온도가 일정하게 전달되어 리포좀 입자의 생성이 모두 동일한 것으로 확인하였다.
명암주기 12시간 cycle, 실내온도 20-24℃의 사육실에서 자유급식으로 공급하여 5일 동안 환경에 적응시켰다. 실험동물군을 ascorbic acid powder, emulsion법, heating법으로 나누어 각 군별로 평균체중이 균등하도록 6마리씩 배분하고 3 ml 주사기에 렛드 경구 투여용 존대를 결합하여 10 ml/kg의 시험물질을 경구 투여하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용한 대두레시틴은 ㈜이든타운에프앤비 (Incheon, Korea)에서 구매하여 실험에 사용하였다. 리포좀의내부에 포집될 수용성 형광물질인 fluorescein, ascorbic acid, citric acid는 Sigma (St.
실험동물은 체중 240-260 g 내외의 7주령된 Sprague Dawley계 수컷 쥐를 사용하였다(T&PBIO-IACUC 2021-009)

데이터처리

본 실험에 대한 모든 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 연구 결과 얻어진 자료를 SPSS 20 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 프로그램을 사용하여 one-way ANOVA 분석 후 p< 0.05 수준에서 LSD multiple test에 의해 검정하였다.

이론/모형

리포좀의 크기는 나노 입자 크기 분석기(NanoBrook 90Plus PALS, Brookhaven Instruments Corp., NY)를 이용하여 리포좀 입자크기(particle size), 제타전위(zeta potential) 및 분산지수인 PDI (polydispersity index)를 분석하였다. 제조된 리포좀을 200배 희석하여 RI (refractive index)값을 1.
각 샘플의 입자크기(particle size)값을 설정하여 동일한 조건으로 총 5회 반복 측정하였다. 입자크기, 분산지수 및 제타전위는 동적 광산법 (Dynamic Light Scattering; DLS) 원리를 이용하여 측정하였다.

성능/효과

Ascorbic acid를 함유한 리포좀이 약물전달체로서의 기능을 확인하고자, SD rat에 경구 투여하여 흡수율을 측정한 결과 ascorbic acid, emulsion 및 heating의 시간별혈중농도(AUC0- 24) 및 최고혈중농도(Cmax)는 각각 233.957 μg·hr/ml, 281.481 μg·hr/ml 및 309.981 μg·hr/ml와 12.017 μg/ml, 13.871 μg/ml 및 16.322 μg/ml로 ascorbic acid powder, emuslion lipo- some, heating liposome의 순으로 혈중농도가 높았다.
HPLC를 통해 liposomal ascorbic acid에 대한 포집률을 측정한 결과 emulsion법은 26.46%, heating법은 38.67%으로 heating 법으로 제조된 리포좀이 더 높은 포집률을 보여주었다.
투여 후 1-2 hr까지 증가하다가 그 이후 점차 감소하는 경향을 보였다. Liposomal ascorbic acid 흡수율이 ascorbic acid powder보다 1.5-2배 정도 증가되는 것으로 확인하였다.
Li 등에 의하면 균질 화법으로 제조된 리포좀의 ascorbic acid 포집률이 다양한 제조법에 비해 낮은 포집률을 보여주었다[13]. 이를 바탕으로 Emulsion법의 ascorbic acid는 약 26.46%으로 낮은 포집률을보여주였고 heating법의 ascorbic acid는 약 38.67%의 포집률을 나타내었다. 가온효과로 인해 리포좀들이 서로 응집되면서 입자 크기가 커져 ascorbic acid를 많이 포집할 수 있는 것으로 사료된다(Fig.

후속연구

리포좀은 인지질 및 이들의 유도체가 물에서 분산될 때 자발적으로 소포체를 형성하며, 내부에 수상으로 이루어진 핵을 포함하는 지질 이중층에 의한 특성을 갖는 구형 소포체이다. 다양한 방법으로 제조된 리포좀은 의학, 제약학 및 생화학 분야에서 약물, 효소, 단백질과 같은 치료제를 위한 전달체로 사용될 수 있다.
따라서 film법에 비해 현저히 떨어진다고 알려진 emulsion 법의 낮은 포집률을 개선한 heating법으로 안정적인 리포좀제형으로 제조 후, ascorbic acid powder보다 생체흡수율을향상시킴으로서 대규모 생산 개발에 크게 활용될 가능성을 확인하였고 산업화에 많은 기여가 될 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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