[논문]겨우살이 추출물의 미백 효과

하영술; 김은지; 구영민; 길영숙; 신승미; 김상곤; 강하은; 윤태진

doi:10.5352/jls.2022.32.5.355

겨우살이 추출물의 미백 효과
Depigmenting Effects of Mistletoe (Viscum album var. coloratum) Extracts 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.5, 2022년, pp.355 - 361

하영술 (경상국립대학교병원 의생명연구원) , 김은지 (경상국립대학교병원 의생명연구원) , 구영민 ((재)경남한방항노화연구원) , 길영숙 ((재)경남한방항노화연구원) , 신승미 ((재)경남한방항노화연구원) , 김상곤 ((재)경남한방항노화연구원) , 강하은 (경상국립대학교 의과대학 피부과학교실 건강과학연구원 경상국립대학교병원) , 윤태진 (경상국립대학교 의과대학 피부과학교실 건강과학연구원 경상국립대학교병원)

초록
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멜라닌 색소는 피부색의 주요 원인이다. 멜라닌 색소는 멜라닌 세포에서 생성된 다음 각질 세포로 전달되어 결국 피부 표면에 다양한 색상을 부여한다. 많은 탈색제 및 피부 미백제가 개발되었지만, 색소 침착을 감소시키기 위한 재료에 대한 수요는 여전히 증가하고 있다. 본 연구에서 천연 화합물을 사용하여 탈색 및 피부 미백에 대한 재료를 찾으려고 시도한 결과 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물이 색소 침착을 억제할 수 있음을 발견하였다. 인간 멜라닌 세포에 겨우살이 추출물(mistletoe extracts, ME)을 처리했을 때 색소 침착이 극적으로 감소하였다. 프로모터 리포터 분석은 ME 처리가 HM3KO 흑색종 세포에서 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), melanophilin (MLPH), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), and tyrosinase (TYR) 유전자의 전사를 억제한다는 것을 보여주었다. 일관되게 ME는 MITF, TRP-1 및 TYR과 같은 색소 침착 관련 분자의 단백질 수준을 감소시켰다. 또한 ME는 cAMP Responsive Element Binding Protein (CREB), AKT 및 ERK의 인산화를 감소시켰다. 이러한 결과는 ME가 색소 침착과 관련된 세포 내 신호 전달의 조절을 통해 멜라닌 생성을 억제한다는 것을 시사한다. 끝으로 ME는 색소 침착에 대한 생체 내 평가 모델인 제브라피쉬 배아의 멜라닌 생성을 현저하게 억제하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Melanin pigments are the main cause of skin color. They are produced in melanocytes and then transferred to keratinocytes, which eventually gives the skin surface a variety of colors. Although many skin-lightening or depigmenting agents have been developed, the demand for materials to reduce pig- mentation is still increasing. Here, we tried to find materials for skin-lightening or depigmentation using natural compounds and found that mistletoe (Viscum album var. coloratum) extracts (ME) had an inhibitory effect on tyrosinase activity. As a result, ME significantly reduced pigmentation in human primary melanocytes. In addition, a promoter reporter assay revealed that ME inhibited the transcription of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), melanophilin (MLPH), tyrosinase-related protein-2 (TRP-2), and tyrosinase (TYR) genes in HM3KO melanoma cells. In addition, ME decreased the protein level for pigmentation-related molecules, such as TYR and TRP-1. Furthermore, it markedly inhibited the melanogenesis of zebrafish embryos, an in vivo evaluation model for pigmentation. To elucidate the action mechanism of ME, we investigated its effects on intracellular signaling. Eventually, the ME dramatically decreased the phosphorylation of the cAMP responsive element binding protein (CREB), AKT, and ERK. The data suggest that ME may inhibit the melanogenesis pathway by regulating the signaling pathway related to pigmentation. Taken together, these data propose that ME can be developed as a depigmenting or skin-lightening agent.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Effect of mistletoe extract (ME) on pigmentation. (A) Inhibitory effect of ME on mushroom tyrosinase activity. ME (20 μg/ml) or Kojic acid (0.75 mM) was incubated with the same units of mushroom tyrosinase. Following incubation, the amount of dopachrome produced was determined at 510 nm. Data are the means ± SD. **p<0.01, *p<0.05 vs. control. (B) Cytotoxicity of ME in primary melanocytes. Cells were treated with the indicated concentrations of ME for 24 hr. Cytotoxicity was measured by CCK-8 assay. The data are represented as percent of control (vehicle-treated). The mean values ± SD are averages of triplicate measurements. **p<0.01, *p<0.05 vs. control. (C) Cells were treated with ME (20 μg/ml) for 72 hr. Cells were harvested by centrifugation, and pellet color was shown (image). Cells were lysed and melanin was dissolved in 1 N NaOH at 100℃ for 30 min. Melanin content was determined by spectrometer (bars). Data are the means ± SD. **p<0.01 vs. control.
그림 Fig. 2. Effect of ME on the promoter activity of pigmentation-related genes. Luciferase reporter assay with ME. HM3KO melanoma cells were infected with adenoviruses carrying various reporter genes (MITF-Luc, MLPH-Luc, TRP2- Luc, and Tyrosinase-Luc). Twenty-four hr after infection, the cells were treated with ME (20 μg/m) for 24 hr and luciferase reporter activity was measured. The experiment was performed at least in triplicate, and the data are represented as relative luciferase activity of vehicle-treated control (ME-). **p<0.01, *p<0.05 vs. vehicle-treated control.
그림 Fig. 3. Effect of ME on the expression of pigmentation-related genes and intracellular signaling in primary melanocytes. (A) The protein level of the pigmentation-related genes was assessed by Western blotting. β-actin was used as a loading control. (B) Primary melanocytes were treated with ME for the indicated time points. The phosphorylation of AKT, CREB, and Erk1/2 was determined by Western blot.
그림 Fig. 4. Effect of ME on the pigmentation of zebrafish embryo. Synchronized embryos were treated with ME at the indicated concentrations. ME was dissolved in 0.1% DMSO, then added to the embryo medium. The effect on the pigmentation of zebrafish were observed under the stereomicroscope. PTU was used as a positive control. Pictures are dorsal and lateral views of embryos at 55 hr post-fertilization (hpf).

AI 본문요약
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문제 정의

우리는 천연화합물 소재를 사용하여 멜라닌 생성 억제제를 스크리닝하려고 시도했으며 겨우살이 추출물이 멜라닌 세포의 색소 침착에 대한 탁월한 억제 효능을 가지고 있음을 발견하였다. 이 연구에서 우리는 겨우살이 추출물이 멜라닌 세포와 제브라피쉬에서 색소 침착을 억제한다는 증거와 작용 기전을 제시하고자 한다.

제안 방법

ME가 인간 멜라닌 세포에서 멜라닌 색소 침착을 감소시킴에 따라 ME가 색소 침착과 관련된 유전자 발현에 영향을 미치는지 조사하였다. 예상대로 ME는 인간 멜라닌 세포에서 tyrosinase 및 TRP-1과 같은 색소 침착 관련 분자에 대한 단백질 수준을 감소시켰지만 TRP-2 및 MITF 수준은 크게 영향을 받지 않았다(Fig.
colora- tum)는 (재)경남한방항노화연구원(Sancheong, Korea) 에서제공받아 사용하였다. 건조한 한국산 겨우살이를 믹서기로 분쇄하여 분말 상태로 만든 후 시료 중량의 10배에 해당하는 양의 70% 에탄올을 추출 용매로 하여 30분간 초음파 세척기(Ultrasonic Cleaner, DAIHAN, Korea)로 추출하여 여과지로 여과하였다. 이후 회전식 증발농축기 (Rotary Evaporator, EYELA, Japan)를 이용하여 농축 시켜 시험용액으로 이용하였다.
겨우살이 추출물(mistletoe extracts, ME)에 의한 tyrosinase 저해 효과를 측정하기 위하여 tyrosinase에 의한 L-티로신의 산화 정도를 측정하였다. Tyrosinase는 멜라닌 합성 과정에서 티로신을 DOPA로 전환하는 tyrosine hydroxy lase 활성과 DOPA를 DOPA quinone으로 산화반응을 촉매하는 DOPA oxidase 활성을 가진 반응속도 제한 효소이다[8].
멜라닌 생성은 다양한 신호 전달 경로가 함께 관여하는 과정이기 때문에 [4, 21], 다음으로 세포 내 신호 전달 경로에 대한 ME의 효과를 평가했다. 먼저 cAMP/PKA 신호 전달의 잘 확립된 하위 신호 전달 경로인 CREB의 활성화에 대한 ME의 효과를 평가하였다. ME의 처리는 CREB의 인산화를 감소시켰다(Fig.
하지만 최근에는 tyrosinase 뿐만 아니라 MITF, TRP- 1, TRP-2 등과 같은 단백질을 이용하여 멜라닌 합성 억제에 대한 연구가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 ME 가 멜라닌 생성에 관계된 주요 유전자인 MITF, TRP-2, TYR, 및 MHPH 프로모터에 미치는 영향을 알아보기 위하여 흑색종 세포(HM3KO)에 리포터 유전자로 루시퍼라아제를지닌 아데노바이러스를 감염시키고 ME를 처리한 후 24 시간 뒤에 리포터 활성을 측정하였다. Fig.
조작의 단순성 외에도 제브라피쉬 모델은 유기체 기반의 화합물 독성 동시 측정과 같은 추가 이점이 있다. 본 연구에서는 동물모델로 제브라피쉬를 사용하여제브라피쉬 배아를 ME로 처리하고 색소 침착에 미치는 영향을 확인하였다. Tyrosinase 억제제인 PTU를 양성대조군으로 사용하였고, PTU 처리는 0.
이를 위해 많은 연구자들이 색소 생성 흑색종 세포주, 기니피그, 제브라피쉬 등 다양한 실험 모델을 사용하여 대규모 스크리닝 및 검증 테스트를 수행하고 있다[5, 7, 18]. 우리는 천연화합물 소재를 사용하여 멜라닌 생성 억제제를 스크리닝하려고 시도했으며 겨우살이 추출물이 멜라닌 세포의 색소 침착에 대한 탁월한 억제 효능을 가지고 있음을 발견하였다. 이 연구에서 우리는 겨우살이 추출물이 멜라닌 세포와 제브라피쉬에서 색소 침착을 억제한다는 증거와 작용 기전을 제시하고자 한다.

대상 데이터

본 연구에서 사용된 겨우살이(Viscum album var. colora- tum)는 (재)경남한방항노화연구원(Sancheong, Korea) 에서제공받아 사용하였다. 건조한 한국산 겨우살이를 믹서기로 분쇄하여 분말 상태로 만든 후 시료 중량의 10배에 해당하는 양의 70% 에탄올을 추출 용매로 하여 30분간 초음파 세척기(Ultrasonic Cleaner, DAIHAN, Korea)로 추출하여 여과지로 여과하였다.

데이터처리

GraphPad Prism (버전 5.01; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 통계 분석에 사용하였다. 데이터는 평균±표준편차로 표시하였다.
데이터는 평균±표준편차로 표시하였다. 그룹 간 차이를 분석하기 위해 one-way ANOVA를 통해 통계적 유의성을 5% 수준에서 분석하였고, 사후검정으로 Mann-Whitney test를 수행하였다.
데이터는 평균±표준편차로 표시하였다

성능/효과

2에서 보는 바와 같이 ME (20 µg/ml)를 처리한 HM3KO군에서는 MITF-luc, TRP2-luc, TYR-luc, MLPH-luc의 루시퍼라아제활성이 ME를 처리하지 않은 군보다 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로 세포 내 tyrosinase의 활성 저해 효과를 확인하기 위하여 먼저 ME의 농도 변화에 따른 인간 멜라닌 세포의 생존율을 확인한 결과, 20 µg/ml의 농도까지는 97.4% 이상의 세포 생존율을 확인하였으나 그 이상의 농도에서 세포 독성이 나타났다(Fig
또한, Kudo 등[15]은 황금(Scutellaria baicalensis Georgi)에서 추출한 Wogonin과 같은 O‑methylated flavone이 액틴 필라멘트의 melanosome 수송과 관련된 운반 단백질인 MLPH를 분해하여 세포 내 melanosome 수송을 억제할 수 있다고 보고하였다. 따라서 ME가 HM3KO 세포에서 MITF, TRP-2, TYR 및 MLPH 유전자의 프로모터 활성 억제 효과를 가지고 있는 것으로 보임에 따라 이들 단백질의 발현 억제를 통하여 색소 생성을 억제할 수 있음을 시사 하였다.
본 연구에서 ME는 눈에 띄는 부작용 없이 200 µg/ml의 용량에서 제브라피쉬의 색소 침착에 대한 현저한 억제 가능성을 보여주었다. 따라서 이러한 결과는 ME가 피부 미백제로 개발될 수 있음을 시사한다.
본 연구에서 ME는 눈에 띄는 부작용 없이 200 µg/ml의 용량에서 제브라피쉬의 색소 침착에 대한 현저한 억제 가능성을 보여주었다
ME가 인간 멜라닌 세포에서 멜라닌 색소 침착을 감소시킴에 따라 ME가 색소 침착과 관련된 유전자 발현에 영향을 미치는지 조사하였다. 예상대로 ME는 인간 멜라닌 세포에서 tyrosinase 및 TRP-1과 같은 색소 침착 관련 분자에 대한 단백질 수준을 감소시켰지만 TRP-2 및 MITF 수준은 크게 영향을 받지 않았다(Fig. 3A).
3B). 이러한 결과는 ME가 AKT와 ERK 경로의 억제를 통해 멜라닌 세포의 색소 침착을 억제함을 시사한다. 앞서 언급했듯이 cAMP/ PKA 신호전달 분자는 멜라닌 생성의 중심 역할을 하며, 이는 α-MSH와 같은 외부 자극을 전사 인자 MITF에 연결한다[5].
1C). 이러한 결과는 ME가 tyrosinase 활성 및 멜라닌 합성 억제 효과에 직접적으로 관여하는 것으로 사료된다.
따라서 세포를 이용한 이후 추가 실험에서는 ME가 독성을 보이지 않는 20 µg/ml 이하의 농도에서 실험을 진행하였다. 인간 멜라닌 세포를 ME로 처리한 결과 세포 펠릿 색상과 멜라닌 함량은 유의하게 감소하였다(Fig. 1C).

후속연구

따라서 인간 멜라닌 세포에서 ME 처리에 의한 AKT와 ERK의 활성 억제가 색소 침착을 저해할 수 있을 것이라 사료되며, 이는 지속된 AKT와 ERK 활성화는 인간 멜라닌 세포의 증식을 억제하여 멜라닌 합성을 감소시킬 수 있음을 제시한 선행연구 결과와 일치한다[12]. AKT 및 ERK 활성화의 다른 역학에 따른 색소 침착의 차이점과 관련 기전 연구는 추후 지속적으로이루어져야 할 것이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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