본 연구는 쓴메밀 추출물(FTE)의 미백 효과를 검증하기 위해 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, 타이로시나아제 활성 저해 효과 및 세포내 멜라닌 합성 억제 효과를 측정하였고, 단메밀 추출물(FEE)과 그 효능 비교를 하였다. 그 결과로 쓴메밀 추출물은 단메밀 추출물보다 항산화 효과 및 타이로시나아제 활성 저해, 세포내 멜라닌 합성 억제 효과가 높음을 확인하였다. 또한 인체 적용 실험에서 자외선 조사에 의한 인공 색소침착을 유발한 후, 쓴메밀 추출물을 함유한 크림을 제조하여 도포하였고, 8주 경과 후 피부 밝기를 측정한 결과 통계적으로 유의한 수준의 피부 미백 효과를 나타내었다. 이러한 결과들로 쓴메밀 추출물은 미백 개선을 위한 화장품 소재로 이용 가능성이 높을 것으로 기대된다.
본 연구는 쓴메밀 추출물(FTE)의 미백 효과를 검증하기 위해 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, 타이로시나아제 활성 저해 효과 및 세포내 멜라닌 합성 억제 효과를 측정하였고, 단메밀 추출물(FEE)과 그 효능 비교를 하였다. 그 결과로 쓴메밀 추출물은 단메밀 추출물보다 항산화 효과 및 타이로시나아제 활성 저해, 세포내 멜라닌 합성 억제 효과가 높음을 확인하였다. 또한 인체 적용 실험에서 자외선 조사에 의한 인공 색소침착을 유발한 후, 쓴메밀 추출물을 함유한 크림을 제조하여 도포하였고, 8주 경과 후 피부 밝기를 측정한 결과 통계적으로 유의한 수준의 피부 미백 효과를 나타내었다. 이러한 결과들로 쓴메밀 추출물은 미백 개선을 위한 화장품 소재로 이용 가능성이 높을 것으로 기대된다.
This study was performed to DPPH radical scavenging activity, ABTS radical scavenging activity, tyrosinase inhibition activity and intracellular melanin synthesis inhibition to verify the whitening effect of Fagopyrum tataricum (bitter buckwheat) extract as contrasted with Fagopyrum esculentum (swee...
This study was performed to DPPH radical scavenging activity, ABTS radical scavenging activity, tyrosinase inhibition activity and intracellular melanin synthesis inhibition to verify the whitening effect of Fagopyrum tataricum (bitter buckwheat) extract as contrasted with Fagopyrum esculentum (sweet buckwheat) extract. F. tataricum extract in consequence showed higher antioxidant activities, tyrosinase inhibition activity and melanin synthesis inhibition compared with F. esculentum extract. We investigated skin bright value during 8 weeks after induction of pigmentation in human skin from UV irradiation. In result, we obtained statistically a significant skin whitening effect from visual and mechanical evaluation. Accordingly, F. tataricum extract is expected to be high availability as functional cosmetic material for skin whitening.
This study was performed to DPPH radical scavenging activity, ABTS radical scavenging activity, tyrosinase inhibition activity and intracellular melanin synthesis inhibition to verify the whitening effect of Fagopyrum tataricum (bitter buckwheat) extract as contrasted with Fagopyrum esculentum (sweet buckwheat) extract. F. tataricum extract in consequence showed higher antioxidant activities, tyrosinase inhibition activity and melanin synthesis inhibition compared with F. esculentum extract. We investigated skin bright value during 8 weeks after induction of pigmentation in human skin from UV irradiation. In result, we obtained statistically a significant skin whitening effect from visual and mechanical evaluation. Accordingly, F. tataricum extract is expected to be high availability as functional cosmetic material for skin whitening.
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문제 정의
본 연구에서는 쓴메밀 추출물을 화장품 기능성 소재로 활용하고자 그 효능⋅효과를 입증해 보였다.
이에 본 연구에서는 쓴메밀 추출물의 피부 미백 소재로서의 효능을 확인하고자 단메밀과 쓴메밀의 추출물의 항산화 효과, 타이로시나아제 활성 저해 효과, 멜라닌 합성 억제 효과를 수행하여 비교 ⋅ 분석하였고, 추출물을 함유한 제형을 인체에 적용하여 화장품의 기능성 소재로 활용될 수 있음을 규명하고자 하였다.
제안 방법
In vitro 실험에서 쓴메밀 추출물의 타이로시나아제 활성 저해 및 멜라닌 합성 억제 효과가 실제적으로 사람 피부의 미백 개선에 도움을 주는지 확인하기 위하여 쓴메밀 추출물을 2.0% 함유한 크림에 대하여 인체 적용 시험을 실시하였다. 자외선 조사에 의한 마지막 인공 색소 침착 10 day 경과 후, 시료 도포 4 wk, 6 wk, 8 wk 경과 후 시험자들을 대상으로 8단계로 구분하여 쓴메밀 추출물을 포함한 크림과 포함하지 않은 크림(placebo) 간의 판정값 차이를 구하여 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 p < 0.
ABTS 라디칼 소거능 측정법은 기본적으로 항산화물질의 수소 이온 공여능을 측정하는 항산화능 분석 방법이다. 과황산칼륨과의 반응에 의해 생성된 ABTS․+ 자유 라디칼이 추출물속의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 항산화 효과를 측정한다.
1 mM DPPH와 각각의 추출물을 2 : 1 비율로 균일하게 혼합한 다음 상온에서 약 1 h 반응시킨 후, 흡수분광광도계를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 메탄올을 첨가하였고, DPPH 라디칼 소거능의 정도는 다음과 같은 계산식에 따라 계산하였다.
멜라닌 생성은 타이로신이 산화되는 과정이므로 항산화 효과가 있는 성분은 멜라닌 생성을 저해할 가능성이 있으므로 쓴메밀 추출물의 미백 효과 검증을 위해 항산화 효과를 먼저 측정하였다[17]. 항산화능 측정에는 DPPH radical 소거능 측정법을 많이 이용하는데, DPPH는 비교적 안정한 자유라디칼을 가지고 있는 화합물로써 항산화력이 있는 물질과 만나게 되면 환원 작용에 의해 라디칼이 소거되어 탈색되므로 이를 이용하여 항산화 효과를 측정하였다[26].
미백 개선 효과 육안 평가를 위하여 23명의 피검자를 대상으로 최소 홍반량(minimal erythema dose, MED)을 판정한 후에 인공 색소 침착을 위해 인공 자외선 방출기(Multi-port Solar simulator 601-300W Solar Light, USA)를 사용하여 2.5 MED 광량으로 1회에 걸쳐 광조사를 실시하였다. 시험부위의 피부 색상은 두 명의 전문의에 의해 이중 맹검법으로 평가되었다.
배양 후, 배지를 제거하고 10% FBS, 2 μM α-MSH와 2 mM theophylline이 함유된 DMEM으로 교체 및 각각의 추출물을 첨가하여 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 될 때까지 배양하였다.
배양 후, 배지를 제거하고 10% FBS, 2 μM α-MSH와 2 mM theophylline이 함유된 DMEM으로 교체 및 각각의 추출물을 첨가하여 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 될 때까지 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거한 다음 DPBS로 세척하고 trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 5000 rpm으로 10 min 원심분리한 후 상등액을 제거하여 세포 pellet을 얻었다.
세포독성 시험을 통해, 쓴메밀 추출물의 피부 안전성을 평가하였다. 배양된 B16F10 마우스 멜라노마 세포를 96 well plate에 각각 1 × 104 cells/well로 분주하고 24 h 배양하였다.
5 MED 광량으로 1회에 걸쳐 광조사를 실시하였다. 시험부위의 피부 색상은 두 명의 전문의에 의해 이중 맹검법으로 평가되었다. 평가는 인공색소 침착 10일 경과 후(0 wk), 시료 도포 4주(4 wk), 6주(6 wk), 8주(8 wk) 경과 후에 하고, 색소 침착 정도를 8단계로 구분하여 평가하였다.
쓴메밀 추출물의 in vitro 미백 효과를 평가하기 위하여, 일차적으로 세포 자극을 일으키지 않는 농도 범위를 MTT assay로 평가하였다. MTT assay는 생존 세포의 미토콘드리아 능력을 이용하는 검사법으로 탈수소 효소 작용에 의하여 노란색의 수용성 기질(MTT tetrazolium)이 청자색을 띄는 비수용성 MTT-formazan 결정체로 환원된다[20].
육안 평가 단계에서 인공자외선 방출기를 사용하여 2.5 MED 광량으로 광조사된 인공 색소 침착 부위의 피부미백효과 측정은 chromameter CR-400 (Minolta, Japan)을 이용하여 23명의 피검자를 대상으로 색소 침착된 부위의 L* value (채도인자) 변화를 측정하여 미백 개선 효과를 평가하였다. 평가는 자외선 조사 10일 경과 후(0 wk), 시료 도포 4주(4 wk), 6주(6 wk), 8주(8 wk) 경과 후에 측정하였다.
육안 평가를 통하여 통계학적으로 유의한 쓴메밀 추출물의 미백 개선 효과 결과를 더욱 확인하기 위하여 기기적 평가를 육안 평가 방법과 동일하게 쓴메밀 추출물을 2.0% 함유한 크림에 대하여 실시하였다. 자외선 조사에 의한 마지막 인공 색소 침착 10 day 경과 후, 시료 도포 4 wk, 6 wk, 8 wk 경과 후 시험자들을 대상으로 chromameter CR-400을 이용하여 색소 침착된 부위의 밝기 변화를 총 5회 측정하여 평균값을 얻었다.
0% 함유한 크림에 대하여 실시하였다. 자외선 조사에 의한 마지막 인공 색소 침착 10 day 경과 후, 시료 도포 4 wk, 6 wk, 8 wk 경과 후 시험자들을 대상으로 chromameter CR-400을 이용하여 색소 침착된 부위의 밝기 변화를 총 5회 측정하여 평균값을 얻었다. 결과는 쓴메밀 추출물을 포함한 크림과 포함하지 않은 크림(placebo) 간의 평균값 차이를 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 p < 0.
희석된 용액 760 μL와 증류수 200μL, 각각의 추출물 40 μL를 혼합하여 흡광도를 측정하였다. 추출물 비첨가군으로는 80% 메탄올을 사용하였고, ABTS 라디칼 소거능은 다음과 같은 계산식에 따라 계산하였다[23-25].
타이로시나아제 활성 저해 효과가 있는 쓴메밀 추출물이 미백 개선 성분으로 검증하기 위해 B16F10 mouse melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제 효과를 측정하였다. 추출물의 농도를 최대 1 μL/mL 으로 처리하고 세포를 수립하여 멜라닌 양을 측정한 결과, 쓴메밀 추출물은 38.
시험부위의 피부 색상은 두 명의 전문의에 의해 이중 맹검법으로 평가되었다. 평가는 인공색소 침착 10일 경과 후(0 wk), 시료 도포 4주(4 wk), 6주(6 wk), 8주(8 wk) 경과 후에 하고, 색소 침착 정도를 8단계로 구분하여 평가하였다. 시험시료와 대조시료 간의 판정값 차이를 구하여 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 * p <0.
5 MED 광량으로 광조사된 인공 색소 침착 부위의 피부미백효과 측정은 chromameter CR-400 (Minolta, Japan)을 이용하여 23명의 피검자를 대상으로 색소 침착된 부위의 L* value (채도인자) 변화를 측정하여 미백 개선 효과를 평가하였다. 평가는 자외선 조사 10일 경과 후(0 wk), 시료 도포 4주(4 wk), 6주(6 wk), 8주(8 wk) 경과 후에 측정하였다. 5회 측정 후 최대값과 최소값을 제외한 3회의 평균값을 구하였다.
항산화 효과를 측정하기 위하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼을 이용하여 측정하였다. 메탄올과 증류수의 6 : 4(v / v) 혼합용매에 녹인 0.
Ltd.로부터 구입하였고, 실험에 사용한 기기는 흡수 분광광도계(UVmax, Molecular Devices, USA), 원심분리기, 항온기, 현미경, CO2 incubator를 사용하였다.
본 실험에서 사용한 단메밀과 쓴메밀은 강원도 평창에 농촌진흥청 고령지 농업연구센터에서 제공받아 실험하였다. 분쇄된 단메밀 또는 쓴메밀 분말 10 g을 70%에탄올과 1,3-부틸렌글리콜 7 : 3 (w / w) 비율의 혼합용매 300 g과 혼합하였다.
한국 세포주 은행에서 구입한 B16F10 마우스 멜라노마(mouse melanoma) 세포를 10% FBS, 1% penicillin streptomycin이 첨가된 DMEM에 배양하여 실험에 사용하였다. 각 세포는 10 cm 세포 배양접시에 10 mL의 배지로 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 세포가 70 ~ 80% 합류(confluency)가 되도록 배양하였다.
데이터처리
평가는 자외선 조사 10일 경과 후(0 wk), 시료 도포 4주(4 wk), 6주(6 wk), 8주(8 wk) 경과 후에 측정하였다. 5회 측정 후 최대값과 최소값을 제외한 3회의 평균값을 구하였다. 시험시료와 대조시료 간의 측정값 차이를 구하여 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 * p < 0.
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5% 유의수준에서 student’s t-test로 검정하였다.
시험시료와 대조시료 간의 측정값 차이를 구하여 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 * p < 0.05로 유의성 여부를 확인하였다.
시험시료와 대조시료 간의 판정값 차이를 구하여 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 * p <0.05로 유의성 여부를 확인하였다.
자외선 조사에 의한 마지막 인공 색소 침착 10 day 경과 후, 시료 도포 4 wk, 6 wk, 8 wk 경과 후 시험자들을 대상으로 8단계로 구분하여 쓴메밀 추출물을 포함한 크림과 포함하지 않은 크림(placebo) 간의 판정값 차이를 구하여 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 p < 0.05로 유의성 여부를 확인한 결과 통계학적으로 유의한 미백 효과를 나타내었다(Figure 5).
이론/모형
ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법에 의하여 측정하였다. 7 mM ABTS와 2.
성능/효과
Improvement of whitening effect by mechanical evaluation after cream containing 2% FTE treatment. After 8 weeks, the cream showed statistically a significant whitening effect than placebo. Data presented are the mean ± S.
B16F10 마우스 멜라노마 세포에 대하여 농도 변화에 따른 세포의 생존율을 확인한 결과, 단메밀과 쓴메밀 추출물 모두 5 μL/mL까지 95% 이상의 세포 생존율을 확인하였다.
결과는 쓴메밀 추출물을 포함한 크림과 포함하지 않은 크림(placebo) 간의 평균값 차이를 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 p < 0.05로 유의성 여부를 확인한 결과 쓴메밀 추출물을 포함한 화장품 도포 8주 후 통계학적으로 유의한 수준의 미백 효과를 나타내었다(Figure 6).
그 결과 두 추출물 모두 농도 의존적으로 ABTS 라디칼 소거능이 증가하였으며, 추출물 농도 5 μL/mL에서 쓴메밀은 91.52%이고 단메밀이 69.67%로 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈다(Figure 2).
그 결과 쓴메밀과 단메밀 추출물 모두 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였으며, 추출물 농도 5 μL/mL에서 쓴메밀은 79.63%으로 단메밀 49.30%인 것에 비해 높은 소거 활성을 나타냈다(Figure 1).
또한 타이로시나아제 활성은 5 μL/mL에서 56.34% 저해하였고, 세포내 멜라닌 합성을 1 μL/mL에서 38.24% 억제시키므로 쓴메밀 추출물의 미백 효과를 확인하였다.
쓴 메밀 추출물은 5 μL/mL 농도에서 저해율이 56.34%이고, 단메밀 추출물은 39.93%로 쓴메밀 추출물이 보다 효과가 높은 것으로 확인되었고, 기존의 미백 효과가 있다고 알려진 알부틴과 유사한 효과가 나타났다(Figure 3).
인체 적용 실험에서도 쓴메밀 추출물을 함유한 크림 사용시 피부 이상반응이 없고, 8주 후 피부 미백 효과에 도움을 주는 것으로 나타났다. 이상의 in vitro 및 인체 적용 실험 결과를 통해 쓴메밀 추출물은 단메밀 추추물보다 기능성 소재로서의 미백 효과가 우수함을 증명하였다.
24% 억제시키므로 쓴메밀 추출물의 미백 효과를 확인하였다. 인체 적용 실험에서도 쓴메밀 추출물을 함유한 크림 사용시 피부 이상반응이 없고, 8주 후 피부 미백 효과에 도움을 주는 것으로 나타났다. 이상의 in vitro 및 인체 적용 실험 결과를 통해 쓴메밀 추출물은 단메밀 추추물보다 기능성 소재로서의 미백 효과가 우수함을 증명하였다.
추출물의 농도를 최대 1 μL/mL 으로 처리하고 세포를 수립하여 멜라닌 양을 측정한 결과, 쓴메밀 추출물은 38.24%이고 단메밀 추출물은 27.78%로 멜라닌 합성이 억제됨을 확인하고, 쓴메밀 추출물이 단메밀 추출물 보다 멜라닌 합성 억제 효과가 높은 것으로 확인되었다(Figure 4).
측정 결과 쓴메밀과 단메밀 추출물 모두 농도 의존적으로 타이로시나아제 활성 억제 효과가 증가하였다. 쓴 메밀 추출물은 5 μL/mL 농도에서 저해율이 56.
항산화 효과, 타이로시나아제 활성 저해 효과, 멜라닌 합성 억제 효과를 수행해 본 결과 쓴메밀 추출물은 5 μL/mL에서 79.63%로 비교군인 단메밀 추출물에 비해 높은 항산화 효과를 보여주었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
멜라닌은 무엇인가?
멜라닌(melanin)은 생물체에 널리 존재하는 페놀류의고분자 천연 색소로 인체에서는 표피 기저층에 있는 멜라노사이트(melanocyte) 내의 멜라노솜(melanosome)에서 기질인 타이로신(tyrosine)의 연속적인 산화반응으로 합성된다. 이때 타이로시나아제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine)를 거쳐 도파퀴논(phenylanine-3,4-quinone)으로 산화되고, 이들은 효소의 작용 및 자동 산화반응에 의해 중간 대사산물(DOPA chrome, indole carboxylic acid, indole quinone)을 거쳐 최종적으로 멜라닌을 합성한다[9-11].
멜라닌의 합성은 구체적으로 어떤 과정을 통해 이루어지는가?
멜라닌(melanin)은 생물체에 널리 존재하는 페놀류의고분자 천연 색소로 인체에서는 표피 기저층에 있는 멜라노사이트(melanocyte) 내의 멜라노솜(melanosome)에서 기질인 타이로신(tyrosine)의 연속적인 산화반응으로 합성된다. 이때 타이로시나아제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine)를 거쳐 도파퀴논(phenylanine-3,4-quinone)으로 산화되고, 이들은 효소의 작용 및 자동 산화반응에 의해 중간 대사산물(DOPA chrome, indole carboxylic acid, indole quinone)을 거쳐 최종적으로 멜라닌을 합성한다[9-11].
루틴의 효능으로 어떤 것들이 보고되었는가?
메밀의 주요 성분으로 알려진 루틴(rutin)은 폴리페놀(poly phenol) 화합물로 케르세틴(quercetin)에 루티노사이드(rutinoside)가 결합된 물질이다. 강력한 항산화 효과와 삼투압 조절 능력을 통해 항염, 항암, 항당뇨 활성, 항혈전 효과 외에도 산화 스트레스에 대한 세포보호 효과 등이 보고 되고 있다[10]. 또한 칼콘(chalcone), 케르세틴(quercetin), 헤스페리딘(hesperidin)과 같이 비타민(vitamin) P 작용이 있어 비타민 C의 흡수와 기능을 돕는다. 쓴메밀은 이 루틴의 함량이 단메밀(27 mg%)에 비해 최소 12.
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