[논문]CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 마커를 적용한 김 교잡육종 기술 개발

박은정

doi:10.5657/kfas.2023.0124

[국내논문] CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 마커를 적용한 김 교잡육종 기술 개발
Cross-breeding of Neopyropia spp. (Bangiales, Rhodophyta) Using CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) Markers 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.56 no.1, 2023년, pp.124 - 132

박은정 (국립수산과학원 수산식물품)

Abstract ▼ AI-Helper

This study aimed to cross between Korean and Japanese pure lines of Neopyropia strains to establish cross breeding technology and identify a superior variety that harbors the strength of both parents. Four crossing combinations were tried using three methods, resulting in 1,476 single conchocelis colonies. The three co-dominant Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) markers (EF-1α/Mse I, TOP2/Mse I, car A/ApaL I) were used to distinguish heterozygotic sporophytes and their maternal lines obtained from the inter and intraspecific cross-fertilization within the wild type of Neopyropia strains. Of the 1,476 colonies, 26.9% (218) were heterozygotes obtained from the nuclear CAPS markers. Their maternal line was clearly confirmed using organelle CAPS marker and chimeric thallus was obtained from crossing experiment of Japanese N. yezoensis (♀) and Korean N. yezoensis (♂). The use of CAPS markers improved the efficiency of crossbreeding by quickly screening heterozygotes and maternal lines in the conchocelis phase, which otherwise required pigmentation mutants as genetic markers.

Keyword

표/그림 (12)

그림 Fig. 1. Gametophytic thalli of the three Neopyropia strains (A) used in crossing experiments and their reproductive parts (BD). A, Korean N. tenera, Korean N. yezoensis, and Japanese N. yezoensis; B, Surface view of spermatangia and carpogonia of the Korean N. tenera; C, Surface view of spermatangia and carpogonia of the Korean N. yezoensis; D, Surface view of spermatangia and carpogonia of the Japanese N. yezoensis; Scale bar 100 μm.
그림 Fig. 2. Schematic view of the three method of crossing experiment used in this study (A-C). A, Crossing A was made by coculturing with a large number of mature paternal thalli and a small number of mature maternal thalli; B, Crossing B was made by coculturing with a large number of mature paternal parts and a small number of mature maternal parts; C, Crossing C was made by coculturing with the same number of mature parts obtained from the paternal and maternal thalli.
표 Table 1. List of primers used in the CAPS analysis and their PCR amplifcation conditions for screening heterozygotes and their maternal line
그림 Fig. 3. Confirmation of cross-fertilization within conchocelis colonies obtained from the crossing experiment JNY (♀)×KNY (♂) by EF-1α (ORF)/Mse I CAPS marker (21-45). JNY, Japanese Neopyropia yezoensis; KNY, Korean Neopyropia yezoensis.
표 Table 2. CAPS makers for screening heterozygotes and their maternal line
그림 Fig. 4. Confirmation of maternal line within heterozygotic conchocelis obtained from the crossing experiment KNY (♀·♂)×JNY (♂·♀) by car A/ApaL I CAPS marker (22-44). KNY, Korean Neopyropia yezoensis; JNY, Japanese Neopyropia yezoensis.
그림 Fig. 5. Confirmation of cross-fertilization within conchocelis colonies obtained form the crossing experiment KNT (♀·♂)×JNY (♂·♀) by TOP2/Mse I CAPS marker (51-75). KNY, Korean Neopyropia yezoensis; JNY, Japanese Neopyropia yezoensis.
표 Table 3. The number of crossing times and the separated conchocelis according to the combination and method of crossing experiments
그림 Fig. 6. Confirmation of maternal line within heterozygotic conchocelis obtained from the crossing experiment KNT (♀·♂)×JNY (♂·♀) by car A/ApaL I CAPS marker (52-74). KNY, Korean Neopyropia yezoensis; JNY, Japanese Neopyropia yezoensis.
표 Table 4. The number of the heterozygotic conchocelis and the information of their maternal line according to the crossing experiments
그림 Fig. 7. Blade length, blade width and the ratio of blade length/ width of the hybrid B-②-41 originated from the crossing with JNY (♀)×KNY (♂) under the different temperature conditions. Bar indicate the mean±standard deviation. JNY, Japanese Neopyropia yezoensis; KNY, Korean Neopyropia yezoensis.
그림 Fig. 8. Chimeric F₁ thallus selected from the hybrid conchocelis of B-②-41 strain which was originated from crossing with JNY (♀)×KNY (♂). JNY, Japanese Neopyropia yezoensis; KNY, Korean Neopyropia yezoensis.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 교잡육종법을 통해 일본품종과 자생품종의 형질을 동시에 나타내는 우량 계통주를 선발하고자 하였다. 또한, CAPS 마커를 적용하여 2n 상태의 사상체(conchocelis) 단계에서 교잡여부 및 교잡체의 모계를 확인함으로써 교잡육종 기술 확립뿐만 아니라 교잡의 효율성을 높이고자 하였으며, 방사무늬김의 종내 및 근연종인 참김(N.
또한, CAPS 마커를 적용하여 2n 상태의 사상체(conchocelis) 단계에서 교잡여부 및 교잡체의 모계를 확인함으로써 교잡육종 기술 확립뿐만 아니라 교잡의 효율성을 높이고자 하였으며, 방사무늬김의 종내 및 근연종인 참김(N. tenera Kjellman)과의 종간 교잡 시 타가수정률을 높이기 위한 다양한 교잡방법을 제시하고자 한다.

제안 방법

종내 및 종간 교잡체 유도에는 순계로 개발된 KNT, KNY, JNY TKR 10-1을 이용하였으며, 네 가지 교잡조합과 타가 수정률을 높이기 위한 세 가지 교잡방법을 적용하여 총 18회의 교잡실험을 수행하였다(Fig. 1, Fig.
JNY (♀)×KNY (♂)의 교잡 조합으로 crossing B 방법에서 얻어졌으며, JNY가 모계인 교잡사상체 B-②-41에서 각포자 방출과 발아를 유도한 후, 유엽의 온도별 생장도를 12주 동안 조사하였다

대상 데이터

KNY (♀·♂)×JNY (♂·♀)의 교잡실험에서 총 720개의 단일 사상체를 분리하였으며, KNT (♀·♂)×JNY (♂·♀)의 교잡실험에서 총 756개의 단일 사상체를 분리하여 총 1,476개의 단일 사상 체군을 확보하였다(Table 3).
총 414개의 사상체군을 대상으로 한 EF-1α (ORF)/Mse I의 CAPS 분석으로 양친의 밴드 유형을 모두 나타낸 107개의 교잡사상체를 분리하였다(Table 4).
5B, Table 2). 총 394개의 사상체군을 대상으로 한 TOP2/Mse I의 CAPS 분석으로 양친의 밴드 유형을 모두 나타낸 111개(28.1%)의 교잡사상체를 분리하였다(Table 4).

성능/효과

교잡여부를 확인하기 위한 CAPS 분석으로 Mse I을 처리한 결과, 사상체 24, 26, 27, 39–44에서는 KNY의 밴드 유형인 약 760, 460 bp의 2개의 밴드와 JNY의 밴드 유형인 약 1,200 bp의 단일 밴드로 나타나는 양친의 CAPS 유형이 모두 확인되었다
KNY (♀·♂)×JNY (♂·♀)의 교잡실험으로부터 얻어진 720개의 사상체 중에서 오염이 적고 생장이 양호한 414개의 사상체군을 대상으로 한 EF-1α (ORF)의 PCR 산물은 약 1,200bp 크기로 확인되었다(Fig
총 107개의 교잡사상체를 대상으로 모계를 조사한 결과, KNY가 모계인 개체군은 95개(88.8%), JNY가 모계인 개체군은 12개(11.2%)로 분석되었다(Table 4). 약 950 bp 크기의 carA의 PCR 산물을 ApaL I으로 처리한 CAPS 분석 결과를 보면, 조사한 모든 교잡사상체에서 950 bp의 단일 밴드로 나타나는 JNY의 유형으로 확인되어 JNY가 모계인 교잡사상체로 확인되었다(Fig.
2%)로 분석되었다(Table 4). 약 950 bp 크기의 carA의 PCR 산물을 ApaL I으로 처리한 CAPS 분석 결과를 보면, 조사한 모든 교잡사상체에서 950 bp의 단일 밴드로 나타나는 JNY의 유형으로 확인되어 JNY가 모계인 교잡사상체로 확인되었다(Fig. 4, Table 2, Table 4).
KNT (♀·♂)×JNY (♂·♀)의 교잡실험으로부터 얻어진 756개의 사상체군 중 오염이 적고 생장이 양호한 394개의 사상체군을 대상으로 한 TOP2의 PCR 산물은 약 1,200 bp 크기로 확인되었다(Fig
교잡여부를 확인하기 위한 CAPS 분석으로 Mse I을 처리한 결과, 사상체 52, 53, 65, 67, 70–72, 74에서는 KNT의 밴드 유형인 약 570, 450, 190 bp와 JNY의 밴드 유형인 약 750, 240, 210 bp로 모두 6개의 밴드 유형이 나타나 교잡체로 확인되었으며, 나머지 17개의 사상체군은 모두 KNT (51, 54–64, 66, 68, 69, 75) 또는 JNY (73)만의 밴드 유형을 나타내어 각각의 자가수정 유래의 사상체임을 확인하였다(Fig
총 111개의 교잡사상체를 대상으로 모계를 조사한 결과, KNT가 모친인 개체군은 105개(94.6%), JNY가 모친인 개체군은 6개(5.4%)로 분석되었다(Table 3). CAPS 분석 결과를 보면, 약 950 bp 크기의 carA의 PCR 산물을 ApaL I으로 처리한 후, 조사한 교잡사상체 중 52, 53, 65, 74는 KNT의 540, 410 bp의 밴드 유형을 나타내어 KNT가 모계인 교잡사상체임을 확인하였다.
4%)로 분석되었다(Table 3). CAPS 분석 결과를 보면, 약 950 bp 크기의 carA의 PCR 산물을 ApaL I으로 처리한 후, 조사한 교잡사상체 중 52, 53, 65, 74는 KNT의 540, 410 bp의 밴드 유형을 나타내어 KNT가 모계인 교잡사상체임을 확인하였다. 반면, 67, 70–72는 JNY의 약 950 bp의 밴드 유형을 나타내어 JNY가 모계인 교잡사상체임을 확인하였다(Fig.
이상의 CAPS 분석 결과를 요약해 보면, 총 1,476개의 사상체군 중에서 선별한 808개의 사상체군을 대상으로 두 가지 세트의 마커로 분석한 결과, 양친의 밴드 유형을 모두 나타낸 교잡사상체군은 종내 교잡실험에서 107개와 종간 교잡실험에서 111개로 총 218개로써 타가수정률은 26.9%로 나타났다(Fig. 3B, Fig.
특히, 10°C에서는 다른 엽체들에 비해 생장속도가 월등하게 빠른 엽체가 선발되었으며, 엽체의 생장은 16주까지 지속되어 엽장 124 cm, 엽폭 15 cm로 나타났다. CAPS 마커로 사상체 단계에서 교잡여부 및 모계를 확인한 이후에 얻어진 F1 세대로 엽체 일부분에 양친의 엽색(JNY, 연갈색; KNY, 진갈색)이 모두 발현되는 색상 구분 키메라(chimeric thallus)로 확인되어 육안으로도 교잡여부를 확인하였다(Fig. 8).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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