[논문]Streptococcus mutans의 전사체 분석과 독활 추출물로부터 활성 성분 분리

이현정; 강다영; 이윤채; 김정남

doi:10.5352/jls.2023.33.7.538

[국내논문] Streptococcus mutans의 전사체 분석과 독활 추출물로부터 활성 성분 분리
Transcriptome Analysis of Streptococcus mutans and Separation of Active Ingredients from the Extract of Aralia continentalis 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.33 no.7, 2023년, pp.538 - 548

이현정 (부산대학교 자연과학대학 생명시스템학과) , 강다영 (부산대학교 자연과학대학 생명시스템학과) , 이윤채 (부산대학교 자연과학대학 생명시스템학과) , 김정남 (부산대학교 자연과학대학 생명시스템학과)

초록
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식물 천연추출물에서 항균력을 갖는 활성 물질을 분리하고 이를 구강 건강 관리 제품에 사용하려는 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 유기용매를 사용하여 독활과 우방자로부터 추출한 복합 화합물에 대한 구강 감염균인 Streptococcus mutans의 특정 유전자 발현 변화를 분석하여 항균 기작을 분석하고자 하였다. 전사체 분석 결과, 두 가지 천연추출물에 의해 다양한 대사 및 생리 작용과 연관된 유전자의 발현이 공통적으로 증가하거나 감소하는 것으로 나타났다. 세 가지 유전자(SMU_1584c, SMU_2133c, SMU_921)는 공통적으로 높은 수준으로 발현되었으며, 특히 이 중 SMU_921 (rcrR)은 두 가지 sugar phosphotransferase system (PTS)의 전사 활성자로써 당원의 수송과 생물막 형성에 기여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 우방자 추출물에 비해 다수의 유전자 발현 변화에 영향을 미치는 것으로 나타난 독활 추출물의 성분 분석을 진행하였고, 활성 분획의 가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)을 통해 두 가지 활성 단일 물질을 동정하였다. 물질 분리 과정에서 여러 유기용매 분획 중 hexane층(ACEH)의 항균 활성이 가장 높게 관찰되었다. 다양종 미생물 군집을 사용한 실험결과, S. mutans에 대한 ACEH의 항균 특이성이 관찰되었으나, 상대적으로 S. sanguinis와 S. gordonii의 생균수도 크게 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 독활 천연추출물의 광범위한 항균 활성을 시사하며, 동정한 단일 물질의 항균 기작을 분석하여 맞춤형 항균 소재 개발에 중요한 기초 자료를 제공할 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

The research has been conducted on the isolation of antimicrobial compounds from plant natural extracts and their potential application in oral health care products. This study aimed to investigate the antimicrobial mechanism by analyzing the changes in gene expression of Streptococcus mutans, a major oral pathogen, in response to complex compounds extracted from Aralia continentalis and Arctii Semen using organic solvents. Transcriptome analysis (RNA-seq) revealed that both natural extracts commonly upregulated or downregulated the expression of various genes associated with different metabolic and physiological activities. Three genes (SMU_1584c, SMU_2133c, SMU_921), particularly SMU_921 (rcrR), known as a transcription activator of two sugar phosphotransferase systems (PTS) involved in sugar transport and biofilm formation, exhibited consistent high expression levels. Additionally, component analysis of the A. continentalis extract was performed to compare its effects on gene expression changes with the A. Semen extract, and two active compounds were identified through gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis of the active fraction. The n-hexane fraction (ACEH) from the A. continentalis extract exhibited antibacterial specificity against S. mutans, leading to a significant reduction in the viable cell counts of Streptococcus sanguinis and Streptococcus gordonii among the tested multi-species bacterial communities. These findings suggest the broad-spectrum antibacterial activity of the A. continentalis extract and provide essential foundational data for the development of customized antimicrobial materials by elucidating the antibacterial mechanism of the identified active compounds.

Keyword

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Transcriptome analysis of S. mutans when exposed to plant extracts. Differentially expressed genes (DGEs) in each condition, with a log₂ fold change greater than 1 or less than -1 (p<0.05) were identified and grouped. (A) A Venn diagram displays the upregulated genes (top) and downregulated genes (bottom) when cells are treated with each extract, with the number of included genes indicated inside each area. (B) A heatmap shows the log2 value of differentially expressed genes compared to the untreated sample, with hierarchical clustering results represented on the left side of the heatmap. The red or green color on the individual genes indicate increased or decreased gene expression, respectively, corresponding to the fold change.
표 Table 1. Differentially expressed genes (DEGs) of S. mutans treated with A. Semen extract
표 Table 2. Differentially expressed genes (DEGs) of S. mutans treated with A. continentalis extract
표 Table 2. Continued
$Fig. 2. (A) The antibacterial effect of the individual layers was tested by disc diffusion assay. The organic solvents used for chromatography of A. continentalis represent are presented as follows: E for ethanol; Hex for hexane; Chl for chloroform; EA for ethyl acetate; BuOH for butanol. H<sub>2</sub>O and DMSO were used as a control. (B) A total of 15 fractions were separated from the ACEH layer using silica gel and chromatographed on a Thin Layer Chromatography (TLC) plate. (C) Confirmation of the separation and purification of the active layers using a W252 column was made through TLC. (D) The antibacterial activity of the three fractions was confirmed following separation through a W252 column.$ 그림 Fig. 2. (A) The antibacterial effect of the individual layers was tested by disc diffusion assay. The organic solvents used for chromatography of A. continentalis represent are presented as follows: E for ethanol; Hex for hexane; Chl for chloroform; EA for ethyl acetate; BuOH for butanol. H₂O and DMSO were used as a control. (B) A total of 15 fractions were separated from the ACEH layer using silica gel and chromatographed on a Thin Layer Chromatography (TLC) plate. (C) Confirmation of the separation and purification of the active layers using a W252 column was made through TLC. (D) The antibacterial activity of the three fractions was confirmed following separation through a W252 column.
$Fig. 3. (A) The substances in each fraction were profiled at a wavelength of 220 nm using Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC). (B) The major substances comprising the fraction with antibacterial activity against S. mutans were identified based on GC-MS spectral matching against a reference database.$ 그림 Fig. 3. (A) The substances in each fraction were profiled at a wavelength of 220 nm using Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC). (B) The major substances comprising the fraction with antibacterial activity against S. mutans were identified based on GC-MS spectral matching against a reference database.
$Fig. 4. (A) After treating the three strains with the ACEH fraction, the number of viable cells was measured by colony-forming units (CFU) assay and compared with the number of viable cells in the absence of ACEH. *, statistical significance was determined by the ANOVA analysis at p<0.05. (B) To measure each strain in the mixed culture, 16s rRNA-specific oligomers were synthesized and confirmed by PCR amplification with S. mutans genomic DNA as a template. (C) The ratio of viable cell counts for each strain in the mixed culture was analyzed in the absence or presence of ACEH.$ 그림 Fig. 4. (A) After treating the three strains with the ACEH fraction, the number of viable cells was measured by colony-forming units (CFU) assay and compared with the number of viable cells in the absence of ACEH. *, statistical significance was determined by the ANOVA analysis at p<0.05. (B) To measure each strain in the mixed culture, 16s rRNA-specific oligomers were synthesized and confirmed by PCR amplification with S. mutans genomic DNA as a template. (C) The ratio of viable cell counts for each strain in the mixed culture was analyzed in the absence or presence of ACEH.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 구강 감염균인 S. mutans가 이러한 항균 활성을 나타내는 독활과 우방자 천연추출물에 대한 반응으로 유전자 발현이 변화되는 것을 전사체 분석 기법(RNA-seq)을 사용하여 비교 분석하였으며, 천연 추출물의 혼합물에서 항균성을 주로 나타내는 유효 성분을 분리하기 위한 연구도 함께 수행하였다. 또한, 토착종을 포함한 다양종 미생물 환경에서 독활 천연추출물이 S.
구강 유해 세균인 S. mutans에 대해 항균 활성을 가지는 ACEH가 다른 구강 세균에 미치는 영향을 파악하기 위하여 S. mutans를 비롯하여 S.

제안 방법

또한, 토착종을 포함한 다양종 미생물 환경에서 독활 천연추출물이 S. mutans에 대해 갖는 유효성분의 항균력을 실험해 보았다.
4A). 이를 통해 ACEH가 구강미생물의 생존에 미치는 개별적인 효과를 확인하였으며, 세 개의 균주가 함께 존재할 때 ACEH의 효과를 보기 위하여 균주를 혼합하여 다양종 미생물 환경을 조성하였다. 먼저, 각 균주의 16s rRNA를 암호화하는 유전자에 결합하는 primer를 디자인하였다.
먼저, 각 균주의 16s rRNA를 암호화하는 유전자에 결합하는 primer를 디자인하였다. 다양종 균주가 있는 혼합물에서 원하는 균주를 동정해야 하므로 합성된 primer가 다른 균주의 유전자들과 결합하지 않는 특이성을 가지는지를 PCR 반응을 통해 확인하였다(Fig. 4B).
Mid-exponential phase의 균 배양액을 1:1:1 (v/v)의 비율로 섞은 후 ACEH를 MIC농도인 8 μg/ml로 처리하여 한시간 배양하였으며, 비교군으로 ACEH를 처리하지 않은 혼합 배양액을 사용하였다. 두 혼합 배양액으로부터 genomic DNA를 추출하고, 이를 주형으로 앞서 검증한 primer를 사용하여 정량적 PCR을 통해 혼합 배양액 속의 각 균주의 비율을 확인하였다(Fig. 4C).

데이터처리

실험 결과의 통계분석은 SPSS (statistical package for social science) 프로그램을 이용하여 analysis of variance (ANOVA) 분석법을 적용하였고, least significant difference (LSD)를 사용하여 신뢰수준 95% (p<0.05)에서 통계적 유의성을 검증하였다.

성능/효과

이 값을 백분율로 환산하여 ACEH 처리 전과 후의 균주 비율 변화를 측정하였다. 결과에서 볼 수 있듯이 ACEH를 처리하였을 때, 각 균주의 구성 비율은 각각 96.56%, 3.37%, 그리고 0.07%로 비처리군에 비해 배양액을 구성하는 각 균주의 비율에 변화가 현저하게 관찰되었다. 그러므로, ACEH의 항균력은 S.
결론적으로 혼합물인 ACEH는 항균제 대체재로 효과는 있으나, 구강 감염성 세균인 S. mutans에 대한 특이성이 낮았다.

후속연구

mutans에 대한 특이성이 낮았다. 특히, 토착세균의 생균수를 크게 감소시킬 수 있어 전체적인 구강의 건강에 대한 효과 검증은 아직 미비하나, 보다 다양한 구강미생물 생태에서 체계적인 측정을 한다면 이 후보 천연추출물의 효과를 입증할 수 있을 것으로 기대한다. 후속 연구에서는 동정한 단일 물질을 이용하여 인체유래 치태 미생물 생태에 대한 항균 기능을 확인할 것이며, 다른 구강 유해 균주에 대한 항균 활성을 검증하여 실용화 단계를 위한 기초 자료로 활용할 계획이다.
특히, 토착세균의 생균수를 크게 감소시킬 수 있어 전체적인 구강의 건강에 대한 효과 검증은 아직 미비하나, 보다 다양한 구강미생물 생태에서 체계적인 측정을 한다면 이 후보 천연추출물의 효과를 입증할 수 있을 것으로 기대한다. 후속 연구에서는 동정한 단일 물질을 이용하여 인체유래 치태 미생물 생태에 대한 항균 기능을 확인할 것이며, 다른 구강 유해 균주에 대한 항균 활성을 검증하여 실용화 단계를 위한 기초 자료로 활용할 계획이다.

참고문헌 (22)

Baj, T., Sieniawska, E., Ludwiczuk, A., Widelski, J., Kieltyka-Dadasiewicz, A., Skalicka-Wozniak, K. and Glowniak, K. 2017. Thin-layer chromatography-fingerprint, antioxidant activity, and gas chromatography-mass spectrometry profiling of several Origanum L. species. JPC-J.？Planar Chromat. 30, 386-391.
de Andrade, B. B., Moreira, M. R., Ambrosio, S. R.,？Furtado, N. A., Cunha, W. R., Heleno, V. C., Silva, A.？N., Simao, M. R., da Rocha, E. M., Martins, C. H. and？Veneziani, R. C. 2011. Evaluation of ent-kaurenoic acid？derivatives for their anticariogenic activity. Nat. Prod.？Commun. 6, 777-780.
Farkash, Y., Feldman, M., Ginsburg, I., Steinberg, D. and？Shalish, M. 2019. Polyphenols inhibit Candida albicans？and Streptococcus mutans biofilm formation. Dent. J. 7, 42.

상세보기
Forssten, S. D., Bjorklund, M. and Ouwehand, A. C. 2010.？Streptococcus mutans, caries and simulation models. Nutrients 2, 290-298.

상세보기
Gong, T., He, X., Chen, J., Tang, B., Zheng, T., Jing, M.,？Lin, Y., Pan, Y., Ma, Q., Li, Y. and Zhou, X. 2021. Transcriptional profiling reveals the importance of RcrR in the？regulation of multiple sugar transportation and biofilm formation in Streptococcus mutans. mSystems 6, e0078821.

상세보기
Gross, E. L., Beall, C. J., Kutsch, S. R., Firestone, N. D.,？Leys, E. J. and Griffen, A. L. 2012. Beyond Streptococcus？mutans: dental caries onset linked to multiple species by？16S rRNA community analysis. PLoS One 7, e47722.

상세보기
Han, S., Abiko, Y., Washio, J., Luo, Y., Zhang, L. and？Takahashi, N. 2021. Green tea-derived epigallocatechin？gallate inhibits acid production and promotes the aggregation of Streptococcus mutans and non-mutans streptococci. Caries Res. 55, 205-214.

상세보기
Hong, R., Sur, B., Yeom, M., Lee, B., Kim, K. S., Rodriguez, J. P., Lee, S., Kang, K. S., Huh, C. K., Lee, S. C.？and Hahm, D. H. 2018. Anti-inflammatory and anti-arthritic effects of the ethanolic extract of Aralia continentalis Kitag. in IL-1β-stimulated human fibroblast-like？synoviocytes and rodent models of polyarthritis and nociception. Phytomedicine 38, 45-56.
Huang, R., Zhang, J., Yang, X. F. and Gregory, R. L. 2015.？PCR-based multiple species cell counting for in vitro？mixed culture. PLoS One 10, e0126628.

상세보기
Jeong, S. I., Han, W. S., Yun, Y. H. and Kim, K. J. 2006.？Continentalic acid from Aralia continentalis shows activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.？Phytother. Res. 20, 511-514.
Jeong, S. I., Kim, B. S., Keum, K. S., Lee, K. H., Kang,？S. Y., Park, B. I., Lee, Y. R. and You, Y. O. 2013. Kaurenoic Acid from Aralia continentalis inhibits biofilm formation of Streptococcus mutans. Evid. Based Complement.？Alternat. Med. 2013, 160592.

상세보기
Lee, D. H., Seo, B. R., Kim, H. Y., Gum, G. C., Yu, H.？H., You, H. K., Kang, T. H. and You, Y. O. 2011. Inhibitory effect of Aralia continentalis on the cariogenic properties of Streptococcus mutans. J. Ethnopharmacol. 137, 979-984.

상세보기
Lee, Y. C., Cho, S. G., Kim, S. W. and Kim, J. N. 2019.？Anticariogenic potential of Korean native plant extracts？against Streptococcus mutans. Planta Med. 85, 1242-1252.

상세보기
Lemos, J. A., Palmer, S. R., Zeng, L., Wen, Z. T., Kajfasz,？J. K., Freires, I. A., Abranches, J. and Brady, L. J. 2019. The？Biology of Streptococcus mutans. Microbiol. Spectr. 7, 10.

상세보기
Loesche, W. J. 1986. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol. Rev. 50, 353-380.

상세보기
Moreira, M. R., Souza, A. B., Soares, S., Bianchi, T. C.,？de Souza Eugenio, D., Lemes, D. C., Martins, C. H., da？Silva Moraes, T., Tavares, D. C., Ferreira, N. H., Ambrosio, S. R. and Veneziani, R. C. 2016. ent-Kaurenoic acid-rich extract from Mikania glomerata: In vitro activity？against bacteria responsible for dental caries. Fitoterapia？112, 211-216.

상세보기
Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A. and Hunter,？N. 2002. Determination of bacterial load by real-time PCR？using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology (Reading) 148, 257-266.
Pitts, N. B., Zero, D. T., Marsh, P. D., Ekstrand, K.,？Weintraub, J. A., Ramos-Gomez, F., Tagami, J., Twetman,？S., Tsakos, G. and Ismail, A. 2017. Dental caries. Nat. Rev.？Dis. Primers 3, 17030.
Schneider-Rayman, M., Steinberg, D., Sionov, R. V.,？Friedman, M. and Shalish, M. 2021. Effect of epigallocatechin gallate on dental biofilm of Streptococcus mutans: An in vitro study. BMC Oral Health 21, 447.

상세보기
Woo, Y. M., Kim, O. J., Jo, E. S., Kim, S. J., Lee, Y. H.,？Ahn, M. Y., Lee, S. H., Ha, J. M. and Kim, A. 2019. Anti-inflammatory effects of the combined extracts of Achyranthes japonica nakai and Aralia continentalis kitagawa？in vitro and in vivo. Data Brief 25, 104088.
Wu, C. Y., Su, T. Y., Wang, M. Y., Yang, S. F., Mar, K.？and Hung, S. L. 2018. Inhibitory effects of tea catechin？epigallocatechin-3-gallate against biofilms formed from？Streptococcus mutans and a probiotic lactobacillus strain. Arch. Oral Biol. 94, 69-77.

상세보기
Zhang, C., Xin, Y., Wang, Y., Guo, T., Lu, S. and Kong,？J. 2015. Identification of a novel dye-decolorizing peroxidase, EfeB, translocated by a twin-arginine translocation？system in Streptococcus thermophilus CGMCC 7.179. Appl. Environ. Microbiol. 81, 6108-6119.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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