[논문]청견 잎 에탄올 추출물의 NF-𝜅B와 MAPK 조절을 통한 항염증 효과

박충무; 윤현서

doi:10.15268/ksim.2023.11.3.159

[국내논문] 청견 잎 에탄올 추출물의 NF-𝜅B와 MAPK 조절을 통한 항염증 효과
Anti-inflammatory Effects of Kiyomi (Citrus unshiu × C. sinensis) Leaf Ethanol Extract Via the Regulation of NF-𝜅B and MAPKs in LPS Induced RAW 264.7 Cells 원문보기

Journal of the Korean Society of Integrative Medicine = 대한통합의학회지, v.11 no.3, 2023년, pp.159 - 169

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose : Though other Citrus spp. have reported their anti-inflammatory and antioxidative activities in previous studies, the biological activity of Kiyomi (Citrus unshiu × C. sinensis) has not been reported yet. Therefore, this study attempted to analyze the anti-inflammatory mechanisms of Kiyomi leaf ethanol extract (KLEE) in lipopolysaccharide (LPS) stimulated RAW 264.7 cells. Methods : The cytotoxic effect of KLEE in RAW 264.7 cells was determined by WST-1 assay. Bacterial endotoxin, the concentration of nitric oxide (NO) was analyzed by the Griess reaction. In addition, Western blot analysis was applied to measure the protein expression level of inducible NO synthase (iNOS). The phosphorylated status of the critical inflammatory transcription factor, nuclear factor (NF)-𝜅B, and its upstream signaling molecules, phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt as well as mitogen-activated protein kinases (MAPKs), were also measured by Western blot analysis. Results : KLEE was not cytotoxic up to a concentration of 200 ㎍/㎖, and protein expression levels of iNOS and cyclooxygenase (COX)-2, enzymes that counteract NO and prostaglandin (PG) E2 production, were inhibited by KLEE treatment. The phosphorylated status of PI3K/Akt as well as MAPKs including extracellular regulated kinase (ERK), c-jun NH2kinase (JNK), and p38, were significantly attenuated by KLEE treatment in LPS stimulated RAW 264.7 cells. Moreover, one of phase II enzymes, heme oxygenase (HO)-1 which has known for its anti-inflammatory capacity, was strongly induced by KLEE treatment. Conclusion : Consequently, KLEE treatment significantly attenuated the production of NO as well as the expression levels of iNOS and COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The inflammatory transcription factor, NF-𝜅B, as well as its upstream signaling molecules, PI3K/Akt and MAPKs, were also diminished by KLEE treatment with statistical significance in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. These results suggest that KLEE might be a promising candidate for the attenuation of inflammatory disorders.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig 1. Cytotoxic effect of KLEE treatment in RAW 264.7 cells Cytotoxicity was determined by WST-1 assay and the result is expressed as ratio compared to the control group (LPS treated cells). Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test
그림 Fig 2. NO inhibitory effect of KLEE in LPS stimulated RAW 264.7 cells Accumulated NO concentrations was determined by the Griess reaction. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test
그림 Fig 3. Inhibited effect of KLEE on iNOS and COX-2 expressions in LPS stimulated RAW 264.7 cells Protein expression levels of iNOS and COX-2 by KLEE treatment were decided by Western blot analysis. All signals were normalized to protein levels of actin, an internal control, and expressed as a ratio. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test
그림 Fig 4. Inhibitory effect of KLEE on NF-κB activation in LPS stimulated RAW 264.7 cells Phosphorylated status of p65 by KLEE treatment was determined by Western blot analysis. Induced signal was normalized to protein level of actin, an internal control, and expressed as a ratio. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test
그림 Fig 5. Inhibited phosphorylation of KLEE treatment on PI3K and MAPKs in LPS stimulated RAW 264.7 cells KLEE treatment inhibited phosphorylation levels of Akt, ERK, JNK and p38 by KLEE treatment. All signals were normalized to protein levels of unphosphorylated targets, internal controls, and expressed as a ratio. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test
그림 Fig 6. Effect of KLEE on HO-1 expression in LPS stimulated RAW 264.7 cells Protein expression level of HO-1 by KLEE treatment was decided by Western blot analysis. A signal was normalized to protein level of actin, an internal control, and expressed as a ratio. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

본 연구에서는 청견 잎의 항염증 활성을 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에서 염증 매개 물질인 NO의 생성과 관련된 전사인자인 NF-κB, 상위 신호전달물질인 PI3K/Akt, MAPK의 활성 억제뿐만 아니라 항산화 효소 중 하나인 HO-1의 발현 유도를 통해 확인해보고자 하였다.

제안 방법

KLEE에 의해 조절되는 염증 관련 마커들의 발현을 분석하기 위하여 100-㎜ dish에 파종된 RAW 264.7 세포에 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 시료를 처리하고 2시간 후 1 ㎍/㎖ 농도의 LPS를 처리하였다. 그리고 LPS에 의한 염증에서 KLEE의 효과를 유도하기 위하여 20시간동안 다시 배양하여 iNOS, COX-2와 HO-1을 분석하였다.
RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 nitrite와 PGE2의 생성을 KLEE가 억제하는지 분석하기 위하여 24-well plate에 파종된 세포에 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 CEE를 처리하고 2시간 후 1 ㎍/㎖ 농도의 LPS를 처리한 후 20시간동안 배양하여 염증을 유도하였다. 생성된 nitrite의 농도를 분석하기 위하여 배지 상등액 100 ㎕와 동량의 Griess 시약을 혼합한 후 10분간 실온에서 반응을 진행하고 550 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다(BioTek Instruments Inc.
그리고 염증 매개 물질의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-κB와 세포 내 신호전달 물질인 PI3K/Akt와 MAPK의 활성 또한 Western blot으로 분석하였다.
본 연구에서는 RAW 264.7 세포에 LPS로 염증을 유도하고 청견에탄올 추출물(KLEE)의 항염증 기전을 전사인자와 상위 신호전달물질을 중심으로 분석하였다. 그 결과 LPS에 의해 유도된 NO의 생성과 iNOS, COX-2의 발현은 KLEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되었다.
본 연구에서는 청견 잎 에탄올 추출물(KLEE)의 항염증 기전을 분석하기 위하여 RAW 264.7 세포에 그람 음성 박테리아 외벽에 존재하는 독소 성분인 LPS를 처리하여 염증반응을 유도한 후 염증 매개 물질인 NO와 염증 매개물질의 생성 효소인 iNOS와 COX-2의 발현 정도를 Western blot analysis로 확인하였다. 그리고 염증 매개 물질의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-κB와 세포 내 신호전달 물질인 PI3K/Akt와 MAPK의 활성 또한 Western blot으로 분석하였다.

대상 데이터

JBRI-10179, Jeju biodiversity research center, Korea)은 제주생물다양성연구소에서 분양받아 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, USA)에 녹여 사용하였다. DMSO, LPS(Escherichia coli O111:B4), sodium nitrite, sulfanilamide 등의 시약은 Sigma-Aldrich에서, iNOS, COX-2, HO-1, phospho-p65, phospho-Akt, Akt, phospho-extracellular signal-regulated kinase(ERK), ERK, phospho-c-Jun NH2-terminal kinase(JNK), JNK, phospho-p38, p38, actin의 1차 항체와 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit IgG 항체는 Cell signaling technology(USA)에서 구입하여 분석에 이용하였다.
sinensis) 잎 추출물(Kiyomi leaf ethanol extract; KLEE, No. JBRI-10179, Jeju biodiversity research center, Korea)은 제주생물다양성연구소에서 분양받아 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, USA)에 녹여 사용하였다. DMSO, LPS(Escherichia coli O111:B4), sodium nitrite, sulfanilamide 등의 시약은 Sigma-Aldrich에서, iNOS, COX-2, HO-1, phospho-p65, phospho-Akt, Akt, phospho-extracellular signal-regulated kinase(ERK), ERK, phospho-c-Jun NH2-terminal kinase(JNK), JNK, phospho-p38, p38, actin의 1차 항체와 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit IgG 항체는 Cell signaling technology(USA)에서 구입하여 분석에 이용하였다.

데이터처리

모든 실험 결과는 3회 반복하여 시행 후 SPSS 프로그램(version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균 ± 표준편차(mean ±SD)로 표현하였다
실험군 간의 유의성 검증은 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA)으로 진행하였고 사후분석은 Duncan's multiple range test를 사용하였다.

이론/모형

RAW 264.7 세포에 대한 KLEE의 독성은 EZ-Cytox cell viability assay kit(Daeil Lab., Service, Korea)으로 분석하였다. 24-well plate에 파종된 RAW 264.
7 세포에 50, 100, 200 ㎍/㎖의 KLEE와 1 ㎍/㎖의 LPS를 동시에 처리한 후 4시간동안 배양하였다. 단백질 추출은 protein extraction buffer(PRO-PREP, Intron Biotechnology, Korea)를 이용하였고 추출물의 농도는 Bradford법으로 결정하였다. 추출한 단백질 시료는 LDS sample buffer(Thermo Fisher Scientific, USA)와 섞고 10 % SDS-polyacrylamide gel에 전기영동을 진행하였다.

성능/효과

RAW 264.7 세포에 미치는 KLEE의 독성을 분석하기 위하여 WST-1 assay를 수행한 결과는 Fig 1에서 보는 것과 같이 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 KLEE는 RAW 264.7 세포에 독성을 전혀 미치지 않는 것을 확인하였다. 그리고 KLEE가 RAW 264.
7 세포에 LPS로 염증을 유도하고 청견에탄올 추출물(KLEE)의 항염증 기전을 전사인자와 상위 신호전달물질을 중심으로 분석하였다. 그 결과 LPS에 의해 유도된 NO의 생성과 iNOS, COX-2의 발현은 KLEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되었다. 그리고 전사인자인 NF-κB와 신호전달물질인 PI3K/Akt, MAPK의 인산화 또한 KLEE의 처리에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다.
7 세포에 독성을 전혀 미치지 않는 것을 확인하였다. 그리고 KLEE가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증반응을 억제하는지의 여부를 확인하기 위하여 Griess reaction을 통해 NO 생성량을 분석한 결과 Fig 2에서 보는 것과 같이 1 ㎍/㎖의 LPS 처리에 의해 과량의 NO가 생성되었고 KLEE의 처리로 인해 NO의 생성량이 농도 의존적으로 감소하는 결과를 보였으며 이러한 결과는 NO의 합성을 조절하는 효소인 iNOS의 발현이 억제되는 결과와 일치하는 것을 확인하였다(Fig 3). 또한 염증의 주요한 마커로 알려진 PGE2의 생성을 조절하는 효소인 COX-2 또한 1 ㎍/㎖의 LPS에 의해 과발현되었고 KLEE의 처리로 인해 농도 의존적으로 유의미하게 감소하였다(Fig 3).
그리고 전사인자인 NF-κB와 신호전달물질인 PI3K/Akt, MAPK의 인산화 또한 KLEE의 처리에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다
또한 염증의 주요한 마커로 알려진 PGE2의 생성을 조절하는 효소인 COX-2 또한 1 ㎍/㎖의 LPS에 의해 과발현되었고 KLEE의 처리로 인해 농도 의존적으로 유의미하게 감소하였다(Fig 3). 따라서 KLEE는 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO와 생성과 iNOS, COX-2의 발현을 억제함으로써 염증을 완화하는 것을 알 수 있었다.
7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증반응을 억제하는지의 여부를 확인하기 위하여 Griess reaction을 통해 NO 생성량을 분석한 결과 Fig 2에서 보는 것과 같이 1 ㎍/㎖의 LPS 처리에 의해 과량의 NO가 생성되었고 KLEE의 처리로 인해 NO의 생성량이 농도 의존적으로 감소하는 결과를 보였으며 이러한 결과는 NO의 합성을 조절하는 효소인 iNOS의 발현이 억제되는 결과와 일치하는 것을 확인하였다(Fig 3). 또한 염증의 주요한 마커로 알려진 PGE2의 생성을 조절하는 효소인 COX-2 또한 1 ㎍/㎖의 LPS에 의해 과발현되었고 KLEE의 처리로 인해 농도 의존적으로 유의미하게 감소하였다(Fig 3). 따라서 KLEE는 RAW 264.
이러한 결과를 통해 KLEE는 PI3K/Akt, MAPK의 활성 조절을 통해 NF-κB 활성을 조절하고, 항산화 효소인 HO-1의 발현을 유도함으로써 LPS에 의해 유도된 RAW 264.7 세포의 염증을 유의미하게 억제하는 활성을 나타냈다
7 세포의 염증을 유의미하게 억제하는 활성을 나타냈다. 이러한 연구 결과를 통해 KLEE는 염증 억제에 효과적인 새로운 소재가 될 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통해 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서 KLEE는 PI3K/Akt, MAPK와 NF-κB의 활성 억제 및 HO-1의 발현 유도를 통해 염증을 억제하였고, 이는 KLEE가 신체 내 염증 반응을 조절할 수 있는 새로운 염증 완화 소재로서의 가능성을 시사한다

후속연구

7 세포에서 KLEE는 PI3K/Akt, MAPK와 NF-κB의 활성 억제 및 HO-1의 발현 유도를 통해 염증을 억제하였고, 이는 KLEE가 신체 내 염증 반응을 조절할 수 있는 새로운 염증 완화 소재로서의 가능성을 시사한다. 따라서 본 논문의 결과를 바탕으로 향후 KLEE의 유효성분에 대한 분리 연구 및 항염증 기전의 in vivo 동물 실험이 진행된다면 KLEE가 염증반응을 조절할 수 있는 천연 염증 치료 소재로 이용될 수 있는 가치가 충분히 있을 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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