[논문]항당뇨 효능이 있는 천연물의 탐색 및 활성물질의 분석

이화신; 박보배; 유선녕; 김민지; 배윤진; 이이룬; 이예은; 김시윤; 심윤호; 안순철

doi:10.5352/jls.2023.33.10.783

항당뇨 효능이 있는 천연물의 탐색 및 활성물질의 분석
Screening of Natural Products for Anti-diabetic Activity and Analysis of Their Active Compounds 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.33 no.10, 2023년, pp.783 - 790

이화신 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학 교실) , 박보배 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학 교실) , 유선녕 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학 교실) , 김민지 (물금고등학교) , 배윤진 (물금고등학교) , 이이룬 (물금고등학교) , 이예은 (물금고등학교) , 김시윤 (물금고등학교) , 심윤호 (물금고등학교) , 안순철 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학 교실)

초록
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현대인들의 식습관 변화로 인해 대사성 질환의 발생률이 증가하고 있으며, 특히 당뇨병이 가장 큰 문제로 꼽힌다. 하지만 기존의 당뇨병 치료제는 부작용을 동반하고 있어서 예로부터 쓰이던 천연물을 통해 부작용이 적은 항당뇨 활성 물질을 찾고자 하였다. 따라서 본 실험에서는 항당뇨 및 항산화 활성이 있는 천연물을 탐색하기 위하여, DPPH free radical scavenging assay와 α-glucosidase 및 PTP1B inhibition assay를 이용하였다. 항당뇨 효능이 예상되는 12가지의 시료를 메탄올로 추출하고 항당뇨 활성 및 항산화 활성을 측정하였다. 그 중 항당뇨 활성이 우수한 느릅나무, 벌나무 가지, 연 씨앗, 홍화 씨앗 등의 4가지 시료를 대상으로 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 활성물질을 용매추출하여 항당뇨 활성을 측정하였다. 그 결과, α-glucosidase와 PTP1B 저해활성이 우수한 홍화 씨앗의 에틸아세테이트 분획물(MG-11-E)을 선정하였다. MG-11-E를 대상으로 preparative thin layer chromatography를 수행한 결과, 분획물 #6에서 α-glucosidase 및 PTP1B에 대한 우수한 저해활성을 보였다. 50% 메탄올을 이동상으로 하여 TLC 분획물 #6을 high performance liquid chromatography하여 각각을 분획하고 항당뇨 활성을 측정한 결과, 단일 peak를 보인 RT 4분에서 항당뇨 활성이 확인되었다. 따라서 홍화 씨앗의 추출물의 항당뇨 효능을 나타내는 항당뇨 활성 성분은 PTP1B 보다 α-glucosidase에 대한 저해 활성이 더욱 강하게 나타나 PTP1B를 저해하는 천연물과 조합하여 사용함으로써 당뇨병에 대한 효과를 높일 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Modern people have an increased incidence of metabolic diseases due to changed eating habits, and diabetes is considered the most significant metabolic disease. Given that existing diabetes treatments are accompanied by side effects, the aim of this study was to identify traditional natural products that have anti-diabetic activity. The potential anti-diabetic and antioxidant activities of natural products were examined using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay, α-glucosidase assay, and protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) inhibition assay. Methanol extracts of Ulmus davidiana var. japonica, Acer tegmentosum branches, Nelumbo nucifera seeds, and Carthamus tinctorius seeds were found to have high anti-diabetic activity and further fractionated with solvents using ethyl acetate and butanol. Consequently, the ethyl acetate fraction of C. tinctorius seeds (MG-11-E) with high α-glucosidase and PTP1B inhibitory activity was selected. MG-11-E was subjected to preparative thin layer chromatography, and fraction #6 showed high α-glucosidase and PTP1B inhibitory activity. Fraction #6 was analyzed and fractionated via high performance liquid chromatography with 50% methanol as the mobile phase, and anti-diabetic activity was observed in the sample that eluted after 4 min as a single peak. The α-glucosidase inhibitory activity exhibited by this sample seemed to be greater than the PTP1B inhibitory activity; thus, it was concluded that a greater anti-diabetic therapeutic effect may be achieved by combining this agent with natural products that inhibit PTP1B activity.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Sample list used in this experiment
그림 Fig. 1. Anti-diabetic activities of methanol extracts from natural products. (A) DPPH free radical scavenging activity. (B) α- Glucosidase inhibitory activity. (C) PTP1B inhibitory activity. All data were presented as means ± SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001, compared to control.
그림 Fig. 2. Anti-diabetic activities of organic solvent extracts from natural products. (A) α-Glucosidase inhibitory activity. (B) PTP1B inhibitory activity. M: methanol extract of natural product, E: ethyl acetate layer, b: butanol layer, W: water layer from methanol extract. All data were presented as means ± SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001, compared to control.
$Fig. 3. Preparative thin layer chromatography (TLC) of ethyl acetate fraction (MG-11-E) from methanol extract of Carthamus tinctorius seeds. (A) α-Glucosidase inhibitory activity, (B) PTP1B inhibitory activity. (C) TLC captured under UV lamp at 254 nm (up) and after anisaldehyde sulfuric acid staining (down). All data were presented as means ± SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001, compared to control.$ 그림 Fig. 3. Preparative thin layer chromatography (TLC) of ethyl acetate fraction (MG-11-E) from methanol extract of Carthamus tinctorius seeds. (A) α-Glucosidase inhibitory activity, (B) PTP1B inhibitory activity. (C) TLC captured under UV lamp at 254 nm (up) and after anisaldehyde sulfuric acid staining (down). All data were presented as means ± SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001, compared to control.
$Fig. 4. (A) High performance liquid chromatography (HPLC) of preparative TLC #6 fraction of MG-11-E. HPLC was performed by using Shiseido CAPCELL PAK –MG C18 (Ø 10×250 mm, 5 μm). Sample was flowed for 20 minutes under conditions of 50% methanol and detected at 220 nm. Flow rate was 2 ml/min. (B) α-Glucosidase inhibitory activity (left) and PTP1B inhibitory activity (right) of fraction collected at RT 4 min by HPLC. All data were presented as means ± SD of three independent experiments. **p<0.01 and ***p<0.001, compared to control.$ 그림 Fig. 4. (A) High performance liquid chromatography (HPLC) of preparative TLC #6 fraction of MG-11-E. HPLC was performed by using Shiseido CAPCELL PAK –MG C18 (Ø 10×250 mm, 5 μm). Sample was flowed for 20 minutes under conditions of 50% methanol and detected at 220 nm. Flow rate was 2 ml/min. (B) α-Glucosidase inhibitory activity (left) and PTP1B inhibitory activity (right) of fraction collected at RT 4 min by HPLC. All data were presented as means ± SD of three independent experiments. **p<0.01 and ***p<0.001, compared to control.

AI 본문요약
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제안 방법

항당뇨 효능과 관련된 3가지의 생리활성을 검토한 결과, MG-3 (느릅나무), MG-6 (벌나무 가지), MG-8 (연 씨앗), MG-11 (홍화 씨앗)에서 항산화 및 항당뇨 효능이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 따라서 4가지 천연물들을 선정하고 용매추출을 통해 추가적으로 생리활성을 분석하였다.
Column은 column oven에서 50℃를 유지하였으며, 이동상으로는 50% 메탄올을 이용하여 2 ml/min의 flow rate에서 20분간 용출시키고 220 nm 의 파장에서 용출되는 각 성분을 검출하였다. 이후 용출된 머무름 시간대(retention time, RT)에서 분획물을 받아 각각을 농축 혹은 희석한 후, 분획물의 항당뇨 활성을 측정하였다.
전개용매로 클로로포름:메탄올:증류수(4:2:1, lower phase)를 사용하여 preparative thin layer chromatography (TLC)하여 전개 순서에 따라 MG-11-E를 총 11개 구획으로 나누고 각 분획의 항당뇨 활성을 측정하였다. α-Glucosidase 저해 활성은 TLC 분획물 #5와 #6에서(Fig.
천연물 추출물의 항당뇨 활성을 측정하기 위하여 α-glucosidase 저해 활성과 protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) 저해 활성을 측정하였다.
항당뇨 활성이 비교적 높은 것으로 확인된 4가지의 메탄올(M) 추출물로부터 에틸아세테이트(E), 부탄올(b), 증류수(W)층으로 분획한 시료들을 대상으로 α-glucosidase및 PTP1B inhibition assay를 통해 항당뇨 활성을 측정하였다
항산화 활성은 느릅나무, 벌나무 가지, 연잎, 연 씨앗, 홍화 씨앗 등에서 나타났으며, α-glucosidase 및 PTP1B 저해를 통한 항당뇨 활성은 느릅나무, 벌나무 가지, 연 씨앗, 홍화 씨앗 등에서 높게 나타났다. 항산화 및 항당뇨 효능 실험에서 높은 활성을 보인 느릅나무, 벌나무 가지, 연 씨앗, 홍화 씨앗은 용매추출을 통해 용매별로 분획하여 각 분획물의 활성을 측정하였다. 그 결과, 에틸아세테이트층 분획물이 부탄올층 및 수층에 비해 높은 항당뇨 활성을 보였다.

대상 데이터

본 연구는 항산화 및 항당뇨 활성이 알려진 천연물들 중 인터넷이나 약재상, 한약방 등 주변에서 쉽게 구할 수 있는 것들을 대상으로 진행하였다. 그 결과, 선정된 천연물들 대부분에서 항산화 및 항당뇨 활성을 확인할 수 있었다.
본 연구에 사용된 천연물 목록은 Table 1과 같았으며 경상남도 양산시 남부시장의 한약재 소매상에서 구입하였다. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), ascorbic acid, α-glucosidase, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), acarbose, p-nitrophenyl phosphate (pNPP), ursolic acid는 Sigma Chemical Co.

데이터처리

모든 실험의 결과는 3번 반복 수행하여 얻어진 것으로, 통계 분석은 ANOVA에 의해 분석하여 mean ± S.D로 표시하였고, 통계적 유의성은 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 판정하였다.

성능/효과

α-Glucosidase inhibition assay의 경우, 시료의 농도를 100, 300, 1,000 μg/ml으로 희석하여 처리한 결과, 각 농도별로 MG-3 (느릅나무)에서 59.52, 91.02, 97.54%, MG-6(벌나무 가지)에서 80.22, 95.66, 96.68%, MG-8 (연 씨앗)에서 71.23, 81,15, 88.33%, MG-9 (양파)에서 53.41, 76.10, 94.50%, MG-11 (홍화 씨앗)에서 80.09, 90.33, 94.63%의 저해 활성을 보였으며 농도 의존적으로 저해활성이 증가하였다(Fig
30, 100, 300 μg/ml의 농도에서 α-glucosidase 저해 활성을 조사한 결과, MG-3은 E, b, W층 분획물 모두 비슷한 활성을 보였으며, MG-11의 경우 E층 분획물에서, MG-6과 MG-8은 b층 분획물에서 높은 저해 활성을 보였다(Fig
30, 100, 300 μg/ml의 농도에서 PTP1B 저해 활성을 조사한 결과, MG-3, MG-6과 MG-8은 W층 분획물에서, MG-11은 E층 분획물에서 높은 저해 활성을 보였다(Fig
HPLC에서 단일 peak의 분획을 취하여 항당뇨 활성을 측정한 결과, α-glucosidase와 PTP1B에 대한 저해 활성을 보였다(Fig
PTP1B inhibition assay 또한 시료의 농도를 100, 300, 1,000 μg/ml으로 희석하여 처리하였으며, 그 결과 각 농도별로 MG-3 (느릅나무)에서 66.17, 77.58, 86.27%, MG-6(벌나무 가지)에서 78.39, 89.11, 94.55%, MG-8 (연 씨앗)에서 81.31, 87.11, 92.06%, MG-10 (톳)에서 71.39, 80.25, 89.53%, MG-11 (홍화 씨앗)에서 84.13, 87.10, 94.34%의 저해 활성을 보였으며 농도 의존적으로 증가하였다(Fig
TLC 분석을 통해 홍화 씨앗의 에틸아세테이트층을 용출되는 성분에 따라 분획하여 항당뇨 활성을 측정한 결과, α-glucosidase 저해능은 분획물 #2에서 특히 높았으나 #1과 #6에서도 저해능을 보였다
본 연구는 항산화 및 항당뇨 활성이 알려진 천연물들 중 인터넷이나 약재상, 한약방 등 주변에서 쉽게 구할 수 있는 것들을 대상으로 진행하였다. 그 결과, 선정된 천연물들 대부분에서 항산화 및 항당뇨 활성을 확인할 수 있었다. 항산화 활성은 느릅나무, 벌나무 가지, 연잎, 연 씨앗, 홍화 씨앗 등에서 나타났으며, α-glucosidase 및 PTP1B 저해를 통한 항당뇨 활성은 느릅나무, 벌나무 가지, 연 씨앗, 홍화 씨앗 등에서 높게 나타났다.
항산화 및 항당뇨 효능 실험에서 높은 활성을 보인 느릅나무, 벌나무 가지, 연 씨앗, 홍화 씨앗은 용매추출을 통해 용매별로 분획하여 각 분획물의 활성을 측정하였다. 그 결과, 에틸아세테이트층 분획물이 부탄올층 및 수층에 비해 높은 항당뇨 활성을 보였다. TLC 분석을 통해 홍화 씨앗의 에틸아세테이트층을 용출되는 성분에 따라 분획하여 항당뇨 활성을 측정한 결과, α-glucosidase 저해능은 분획물 #2에서 특히 높았으나 #1과 #6에서도 저해능을 보였다.
1A). 그 중 MG-3 (느릅나무), MG-6 (벌나무 가지), MG-7 (연잎), MG-8 (연 씨앗)의 항산화 활성이 다른 시료들에 비해 높은 것을 확인할 수 있었다.
천연물 추출물들의 항산화능을 측정하기 위하여 각 시료들을 100, 300, 1,000 μg/ml의 농도로 희석한 후 DPPH free radical scavenging assay를 진행한 결과, 100 μg/ml의 농도에서 MG-2, MG-3, MG-6, MG-7, MG-8, MG-11에서 각각 51.86, 69.73, 71.63, 72.04, 69.02, 58.56%의 항산화 활성이 측정되었으며, 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 경향을 보였다(Fig
1C). 항당뇨 효능과 관련된 3가지의 생리활성을 검토한 결과, MG-3 (느릅나무), MG-6 (벌나무 가지), MG-8 (연 씨앗), MG-11 (홍화 씨앗)에서 항산화 및 항당뇨 효능이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 따라서 4가지 천연물들을 선정하고 용매추출을 통해 추가적으로 생리활성을 분석하였다.
항산화 활성은 느릅나무, 벌나무 가지, 연잎, 연 씨앗, 홍화 씨앗 등에서 나타났으며, α-glucosidase 및 PTP1B 저해를 통한 항당뇨 활성은 느릅나무, 벌나무 가지, 연 씨앗, 홍화 씨앗 등에서 높게 나타났다
홍화 씨앗 에틸아세테이트층의 TLC 분획물 #6의 항당뇨 활성 성분을 HPLC로 분석한 결과, RT 4분에 나타나는 peak의 물질이 α-glucosidase와 PTP1B를 저해하는 것으로 확인되었으며, in vitro 효소 저해 활성에서는 α-glucosidase에 비해 PTP1B에 대한 저해 정도가 상대적으로 약한 것으로 확인되었다

후속연구

따라서 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 방법으로 홍화 씨앗 추출물을 이용하는 것과 더불어 PTP1B를 더욱 강력하게 저해할 수 있는 천연물을 병용한다면 보다 높은 항당뇨 활성을 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 더불어 홍화 씨앗 뿐 만 아니라 느릅나무, 벌나무 가지, 연 씨앗의 항당뇨 활성물질에 대한 분리, 정제 등의 추가 실험을 통해 항당뇨 효능이 있는 천연물의 개발에 도움이 될 것으로 판단된다.
홍화 씨앗 에틸아세테이트층의 TLC 분획물 #6의 항당뇨 활성 성분을 HPLC로 분석한 결과, RT 4분에 나타나는 peak의 물질이 α-glucosidase와 PTP1B를 저해하는 것으로 확인되었으며, in vitro 효소 저해 활성에서는 α-glucosidase에 비해 PTP1B에 대한 저해 정도가 상대적으로 약한 것으로 확인되었다. 따라서 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 방법으로 홍화 씨앗 추출물을 이용하는 것과 더불어 PTP1B를 더욱 강력하게 저해할 수 있는 천연물을 병용한다면 보다 높은 항당뇨 활성을 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 더불어 홍화 씨앗 뿐 만 아니라 느릅나무, 벌나무 가지, 연 씨앗의 항당뇨 활성물질에 대한 분리, 정제 등의 추가 실험을 통해 항당뇨 효능이 있는 천연물의 개발에 도움이 될 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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