[논문]PCR detection of food-borne pathogenic microorganisms in milk

김경주; 이기세

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김경주 (명지대학교 환경생명공학과) , 이기세 (명지대학교 환경생명공학과)

본 실험에서는 우유에 존재하는 특정미생물을 PCR 에 의해 검출하기 위한 시료 전처리 방법을 비교 하였다 . PCR 혼합물 내에 우유의 함량이 높아지면 PCR이 저해됨을 알 수 있으며 SDS lysis 처리를 한 후의 PCR 효율이 가장 좋았다.

Milk is easily contaminated by pathogenic microorganisms and contains many ingredients that inhibit normal PCR. In this study, we developed a detection mothed for pathogenic microorganisms existing in milk by usting PCR. 'Sample pretreatment prior to PCR were compared to overcome the inhibition. A high PCR efficiency was achieved by SDS lysis pretreatment. without further purification of DNA for PCR.

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문제 정의

본 실험에서는 우유에 존재하는 특정미생물을 PCR에 의해 검출하기 위한 시료 전처리 방법을 비교 하였다. PCR 혼합물 내에 우유의 함량이 높아지면 PCR이 저해됨을 알 수 있으며 SDS lysis 처리를 한 후의 PCR 효율이 가장 좋았다.
그러나 우유에서 직접 in situ PCR을 수행할 때 우유의 복잡한 성분(단백질, 미네랄, 지방등)들로 인하여 PCR 반응이 inhibition받는 것이 알려져 있다. 본 연구에서는 Giardia [amblia와 Listeria monocytogenes를 우유로부터 PCR 검출할 때 우유성분에 의한 inhibition을 극복하기 위하여 효과적인 시료 전처리 방법을 도출하고자 하였다. 시료 전처리 방법으로 DNA 추출 및 정제의 초기단계인 freeze■기:hawing과 SDS lysis를 이용하여 전 처리 방법에 따른 PCR효율을 비교하였다.

제안 방법

PCRe 최초 95℃에서 5분간, 그리고 40 cy이e의 95℃, 72℃, 50℃를 각 1분간 하였고 마지막 cyclee 72C에서 10분간 실시하여 4℃로 보관하였다. PCR 생성물은 2% agarose g이 electrophoresis를 통하여 확인하였다.
오염 우유 시료를 ( i ) in situ, (ii) freeze—thawing, (ⅲ) SDS lysisd% SDS, 20mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 50mM NaC】) 처리, (ⅳ) freeze-thawing 후 SDS lysis 처리를 한 네 가지의 PCR효율을 비교하였다. PCRe 최초 95℃에서 5분간, 그리고 40 cy이e의 95℃, 72℃, 50℃를 각 1분간 하였고 마지막 cyclee 72C에서 10분간 실시하여 4℃로 보관하였다. PCR 생성물은 2% agarose g이 electrophoresis를 통하여 확인하였다.
monocytogenese: 사용하여 실험하였고, 우유는 식품점에서 구입하여 PCR 혼합물에 투입하여 실험하였다. 접종된 각 균은 TYI-S-33, LB버!]지에서 배양되었고 각각 hemacytometer를 이용한 DMC(direct microscope count) 와 agar배지 에서의 CFU(colony forming unit) 를 측정 하였다. 오염 우유 시료를 ( i ) in situ, (ii) freeze—thawing, (ⅲ) SDS lysisd% SDS, 20mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 50mM NaC】) 처리, (ⅳ) freeze-thawing 후 SDS lysis 처리를 한 네 가지의 PCR효율을 비교하였다.
본 연구에서는 Giardia [amblia와 Listeria monocytogenes를 우유로부터 PCR 검출할 때 우유성분에 의한 inhibition을 극복하기 위하여 효과적인 시료 전처리 방법을 도출하고자 하였다. 시료 전처리 방법으로 DNA 추출 및 정제의 초기단계인 freeze■기:hawing과 SDS lysis를 이용하여 전 처리 방법에 따른 PCR효율을 비교하였다.
접종된 각 균은 TYI-S-33, LB버!]지에서 배양되었고 각각 hemacytometer를 이용한 DMC(direct microscope count) 와 agar배지 에서의 CFU(colony forming unit) 를 측정 하였다. 오염 우유 시료를 ( i ) in situ, (ii) freeze—thawing, (ⅲ) SDS lysisd% SDS, 20mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 50mM NaC】) 처리, (ⅳ) freeze-thawing 후 SDS lysis 처리를 한 네 가지의 PCR효율을 비교하였다. PCRe 최초 95℃에서 5분간, 그리고 40 cy이e의 95℃, 72℃, 50℃를 각 1분간 하였고 마지막 cyclee 72C에서 10분간 실시하여 4℃로 보관하였다.

대상 데이터

실험 균주로는 G. lainblia, L. monocytogenese: 사용하여 실험하였고, 우유는 식품점에서 구입하여 PCR 혼합물에 투입하여 실험하였다. 접종된 각 균은 TYI-S-33, LB버!]지에서 배양되었고 각각 hemacytometer를 이용한 DMC(direct microscope count) 와 agar배지 에서의 CFU(colony forming unit) 를 측정 하였다.

성능/효과

방법을 비교 하였다. PCR 혼합물 내에 우유의 함량이 높아지면 PCR이 저해됨을 알 수 있으며 SDS lysis 처리를 한 후의 PCR 효율이 가장 좋았다.

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