[논문]Colony Forming Unit(CFU) Assay를 이용한 재조합 단백질 Leukotactin-1(Lkn-1)의 Myelosuppression 및 Myeloprotection 연구

이규화; 이공주; 이은경; 임인환; 전은영; 최무림; 김동일; 박두홍; 윤엽

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이규화 (인하대학교 생물공학과) , 이공주 (목암생명공학연구소) , 이은경 (목암생명공학연구소) , 임인환 (목암생명공학연구소) , 전은영 (목암생명공학연구소) , 최무림 (목암생명공학연구소) , 김동일 (인하대학교 생물공학과) , 박두홍 (목암생명공학연구소) , 윤엽 (목암생명공학연구소)

Pichia pastoris에서 생산된 rtLkn-1 은 농도에 따라 CFU의 colony 형성을 억제하였으며, 마우스와 인간 골수 세포에서 항암제에 의한 stem cell 및 progenitor cell의 사멸을 억제하였고 이것은 항암제가 작용하는 동안 세포 주기를 일시적으로 휴지기로 유도하였기 때문으로 사료된다.

Chemokines are small chemotalic cytokines that have a number of biological functions. Some chemokines regulate the proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells(HSPC). Leukotactin-l(Lkn-l) is a CC chemokine and is known to reduce colony forming unit(CFU). The N-terminal truncated Leukotactin-l(rtLkn-l), produced by Pichia pastoris, suppressed CFU from 40 to 60%. The rtLkn-l protected CFU from cytotoxic effect of anticancer drug such as Ara-C, doxorubicin, cyclophosphamide and 5-FU by cell cycle arrest.

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문제 정의

Figure 2는 thymidine kill assay 결과로서 S phase 상의세포만을 선택직으로 사멸시키는 thymidine의 과량 첨가에서 rtLknT을 첨가하여 colony의 수가 증가하였다. 이것은 세포 주기 중 S phase 상의 HPSC를 일시적으로 G1/G0로 유도하여 사멸을 막았기 때문으로 사료된다" 이후에 in t心s에서 항암제첨가 시 사멸되는 HBSO 보호하는 rtLkn-1 의 효과를 관찰하기 위한 실험을 수행하였다. Figure 3에서 나타낸 것과 같이 각 항암제에 따라 colony수가 감소하였고 rtLknT의 첨가에 의해 27-40% 증가하였디.
past。厂is에서생산한 rtLkn-1 의 셍체내 활성올 조사하기 위하여 생쥐와 인간의 골수세포에서 조혈모세포의 colony 형성에 미치는 영향올 조사하였다. 또한 colony 형성에 미치는 rtLknT의 영향이 조혈모세포의 세포 주기 중 S phase와 관런된 항암제의 독성을 완화시킬 수 있음을 밝히고자 하였다.

제안 방법

실험에 필요한 농도에 따라 재조합 truncated LknT.(rtLknT)고卜 항암제를 첨가하여 비교 실험하였다. 3710, 5% COg, 95% 습도 조건에서 7일간 배양한 후 colony 수를 계산하였다.
(rtLknT)고卜 항암제를 첨가하여 비교 실험하였다. 3710, 5% COg, 95% 습도 조건에서 7일간 배양한 후 colony 수를 계산하였다. Thymidine kill assay는 IMDM 배지에 TBMC* 1.
, ) 본 연구에서는 P. past。厂is에서생산한 rtLkn-1 의 셍체내 활성올 조사하기 위하여 생쥐와 인간의 골수세포에서 조혈모세포의 colony 형성에 미치는 영향올 조사하였다. 또한 colony 형성에 미치는 rtLknT의 영향이 조혈모세포의 세포 주기 중 S phase와 관런된 항암제의 독성을 완화시킬 수 있음을 밝히고자 하였다.
BL/6 자성 마우스를 사용하였다. 골수 조헐세포 체취는 마우스를 경부 탈구시킨 후 대퇴골의 양 끝을 무균직으로 절단하고 주사침(23 gauge)을 골수 강 내로 삽입한 후 IMDM 배지를 주입하여 조혈세포를 유출시켰다. 유출된 조혈 세포는 cell strainerdOO um)로 거른 후 배지로 세척(1, 300 rpm, 10분 원심분리)하였匸卜.
5*10%^로 첨가하고 1 ug/mL의 rtLkn을 첨가하여 2 시간 배양한 후 tliymidine([3H]dThd) 50 uCi/mL을 넣고 다시 30 분 배양하였다. 배양 후 2회 세척하고 CFU-assay를 수행하였다.
유출된 조혈 세포는 cell strainerdOO um)로 거른 후 배지로 세척(1, 300 rpm, 10분 원심분리)하였匸卜. 인간 골수세포는 기증인의 동의하에 정상인에게 제공받았으며, 혈액과 Ficolle 을 혼합하여 2, 000 rpm 으로 10분간 원심 분리하여 mononuclear cell(MNC) 만을 분리한 후 배지로 2회 세척하여 실험하였다. CFU-assay는 methylcellulose 배지 (stem cell 사 M3234에 rmGM-CSF 50 ng/mL 과 rmSCF 50 ng/mL(R&D사) 그리고 rhEPO 3 U/mL(녹십자사)을 넣고 total bone marrow cell(TBMC)을 5><"/mL로 첨가하였匸卜.

대상 데이터

실험동물로는 생후 6주에서 8주 된 C₅₇BL/6 자성 마우스를 사용하였다. 골수 조헐세포 체취는 마우스를 경부 탈구시킨 후 대퇴골의 양 끝을 무균직으로 절단하고 주사침(23 gauge)을 골수 강 내로 삽입한 후 IMDM 배지를 주입하여 조혈세포를 유출시켰다.

성능/효과

Figure 4는 human 골수 세포에 항암 세를 첨가한 실험으로 rtLknT을 첨가하여 63%의 증가된 골수 세포 보호 결과를 나타내었다. 항암제와 rtLkn-1을 같이 첨가하였을 띠], colony가 각각의 효과만큼 줄어들지 않는 깃은 chem이cine에 의해 cell cycle arrest가 일시적으로 이루어져서 항암제에 의한 cell damage를 회복하는 atase가 회복될 시간을 부여한다는 것이 제안되었다. 勺

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