[논문]효모를 이용한 glutathione의 대량 생산 및 공정 모니터링

김춘광; 이종일

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김춘광 (전남대학교 물질 생물화학공학과, 생물공정기술연구실) , 이종일 (응용화학공학부, 생물공정기술연구실)

본 연구에서는 효모 Sacchromyces cerevisiae가 글루타치온을 생산하는 최적 생산조건을 검토하였고 유가 배양을 통해 글루타치온을 대량 생산하고자 하였다. 또한 2차원 형광센서를 이용하여 글루타치온의 생산성에 영향을 줄 수 있는 각종 공정 변수를 온라인 모니터링하여 글루타치온의 생산성을 증가시키는데 이용하였다.

High concentration of glutathione(GSH) has been found in some species of yeast, of which Saccharomyces cerevisiae is used for commercial fermentative production. In this study, we have investigated the optimal conditions of production which could increase the GSH productivity and used it to maximize the production of GSH in fed-batch culture of Sacchromyces cerevisiae. Fermentation process have been also real time monitored by a 2-dimensional fluorescence sensor.

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문제 정의

본 연구에서는 효모 Sacchromyces cerevisiae?} 글루타치온을 생산하는 최적 생산조건을 검토하였고 유가 배양을 통해 글루타치온을 대량 생산하고자 하였다. 또한 2차원 형광센서를 이용하여 글루타치온의 생산성에 영향을 줄 수 있는 각종 공정 변수를 온라인 모니터링하여 글루타치온의 생산성을 증가시키는데 이용하였다.
한편 글루타치온의 대량 생산을 위해서는생물 반응기내의 미생물의 성장이나 대사공정을 온라인 모니터링하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 효모 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 진탕배양에서 최적조건을 검토한 후, 그 결과를 바탕으로 생물 반응기를 이용하여 글루타치온을 대량 생산하기 위한 최적 생산 조건을 살펴보았다. 또한 2차원 형광센서를 이용하여 각종 형광 영역에서 형광 특성 변화를 온라인 모니터링하였고 이를 각종 온라인 및 오프라인 데이터와 비교 분석하였다.

제안 방법

글루타치온의 생산성에 영향을 줄 수 있는 각종 공정 변수를 온라인 모니터링하였으며 특히 2차원 형광 센서를 이용하여 S. cerevisiae의 형광 특성을 측정하여온라인 및 오프라인 데이터와 상관관계를 살펴보았다.
본 연구에서는 효모 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 진탕배양에서 최적조건을 검토한 후, 그 결과를 바탕으로 생물 반응기를 이용하여 글루타치온을 대량 생산하기 위한 최적 생산 조건을 살펴보았다. 또한 2차원 형광센서를 이용하여 각종 형광 영역에서 형광 특성 변화를 온라인 모니터링하였고 이를 각종 온라인 및 오프라인 데이터와 비교 분석하였다.
하였다. 또한 2차원 형광센서를 이용하여 글루타치온의 생산성에 영향을 줄 수 있는 각종 공정 변수를 온라인 모니터링하여 글루타치온의 생산성을 증가시키는데 이용하였다.
또한 발효 조건(pH, 온도 및 cysteine 첨가 시간)에 따른 글루타치온의 생산성을 살펴보았다.
그리고, glutathione productivity를 나타내기 위해 측정된 단백질 농도는 Bradford 법을 사용하였다. 또한, 배양액 중의 cysteine 농도는 시료를 copper(H), iron(IH), 1, 10 - phenanthroline과 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 분석하였다.
)를 이용하여 실시간으로 온라인 모니터링 하였다. 또한, 생물반응기 내의 형광 특성 변화를 온라인모니터링하기 위해 2차원 형광분광광도계(Model F-4500, Hitachi Co.)를 사용하였다.
발효액의 상등액과 생산된 intracelluar 글루타치온의 농도는 시료를 glutathione reductase, DTNB (5, 5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)), NADPH 와 반응 시킨 후 microplate reader를 이용하여 분석하였다. 그리고, glutathione productivity를 나타내기 위해 측정된 단백질 농도는 Bradford 법을 사용하였다.
본 배양에는 복합배지인 YM 배지와 최소 배지를 실험 조건에 따라 적절히 수정하여 사용하였다. 특히 최소 배지에는 글루타치온의 전구체로 사용되는 cysteine, glycine, glutamic acid를 첨가하여 사용하였다.
의한 글루타치온의 생산 특성을 살펴보았다. 생물 반응기를 이용한 회분식 배양에서는 기질의 농도, 아미노산의 첨가시간, 아미노산의 농도 변화에 따른 글루타치온의 생산성을 조사하였으며, 기질을 주기적으로 공급하는 유가 배양을 도입하여 글루타치온을 대량 생산하고자 하였다.
진탕 배양기 실험을 통해 얻은 결과를 이용하여 생물 반응기에서 최소 배양액에 의한 글루타치온의 생산 특성을 살펴보았다. 생물 반응기를 이용한 회분식 배양에서는 기질의 농도, 아미노산의 첨가시간, 아미노산의 농도 변화에 따른 글루타치온의 생산성을 조사하였으며, 기질을 주기적으로 공급하는 유가 배양을 도입하여 글루타치온을 대량 생산하고자 하였다.
진탕 배양기를 이용하여 배양액 조성에 따른 글루타치온의 생산성을 살펴보기 위해복합 배양액 및 최소 배양액을 이용하여 글루타치온의 생산성을 살펴보았다.
본 배양에는 복합배지인 YM 배지와 최소 배지를 실험 조건에 따라 적절히 수정하여 사용하였다. 특히 최소 배지에는 글루타치온의 전구체로 사용되는 cysteine, glycine, glutamic acid를 첨가하여 사용하였다. 배양액 및 반응기는 121 ℃, 14 psi 에서 최소 20분 이상 멸균하였으며, 최소 배지의 탄소원과 가용성 염을분리하여 멸균한 후 혼합하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 균주는 Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754이며 균주의 활성화를 위해 YM(3 g/L yeast extract, 3 g/L malt extract, 5 g/L tryptone, 10 g/L glucose) agar배지를 사용하였으며 종균배양 및 전 배양에는 YM 배지(pH₄)를 사용하였다. 본 배양에는 복합배지인 YM 배지와 최소 배지를 실험 조건에 따라 적절히 수정하여 사용하였다.

이론/모형

reader를 이용하여 분석하였다. 그리고, glutathione productivity를 나타내기 위해 측정된 단백질 농도는 Bradford 법을 사용하였다. 또한, 배양액 중의 cysteine 농도는 시료를 copper(H), iron(IH), 1, 10 - phenanthroline과 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 분석하였다.

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