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문제 정의
- 이와 같이 대부분의 식품 가공 공정이나 화학 제조 공정에서 효소나 미생물 등의 반응에 의해 소비되는 당분과 잔존량을 측정하고, 부족한 양을 공급하는 작업이 자동화되어 있지 않은 실정이다. 본 연구에서는 근적외 투과 스펙트럼을 이용하여 발효과정중의 주요성분의 스펙트럼 특성을 구명하며, 이를 이용한 주요성분의 예측 모델을 개발하여 실시간 모니터링 가능성을 구명하고자 한다.
제안 방법
- 1. 이스트 추출물, 펩톤, 갈락토즈를 증류수에 혼합한 발효 배지에서 실제 갈락토즈의 농도와 스 펙트럼을 이용하여 400'2500 nm영역에서 당도 예측 모델을 개발하였다. 여러 선처리 중 SNV전처 리를 했을 때 7?2=q994이고 SEP=0.
- 3. 실험의 여건상 시료를 냉동보관 하였다가 동일한 조건에서 해동하여 분해능이 높은 N[RS6500분광기를 이용하여 스펙트럼을 측정하였다. 갈락토즈의 농도를 예측하는 식을 500-1100 nm, 900-1700 nm, 400 〜 2500 nm의 파장대별로 개발하였다.
- CDI 분광광도계를 이용하여 측정한 스펙트럼데이터를 이용하여 OD를 예측하는 검량식을 개발하였다(표 3). 검량식 개발 방법은 갈락토즈 검량식 개발과 동일하다.
- 실험의 여건상 시료를 냉동보관 하였다가 동일한 조건에서 해동하여 분해능이 높은 N[RS6500분광기를 이용하여 스펙트럼을 측정하였다. 갈락토즈의 농도를 예측하는 식을 500-1100 nm, 900-1700 nm, 400 〜 2500 nm의 파장대별로 개발하였다. 각각의 SEP는 0.
- 농도가 다른 혼합 수용액 배지 47개의 스펙트럼을 무작위로 반으로 나눈 다음, 절반은 검량식 (calibration equation) 개발에, 나머지는 검량식 검증용(validation)으로 사용하였다. 농도 예측 검량 식을 개발하기 위해 PLS회귀법을 사용하였고, 적정 factor의 수는 PRESS curve를 이용하여 육안 으로 결정하였다.
- 발효액의 당도는 DNS방법을 이용하여 측정하였다. 또한 발효액 속의 미생물 농도 측정에 있어서는 Ultrospec 2000(Pharmacia Biotech, USA)을 이용하여 미생물의 농도를 대표하는 흡광도(OD) 를 측정하였다. OD(Optical Density)값에 건조 균체량을 곱하여 환산하면 균체 농도를 구할 수 있 다.
- 배지에 균 배양액(preculture)을 넣은 후 30°C로 중탕하여, 발효시작부터 35시간 동안 34개의 시 료를 채취하였다. 그림3에서 미생물의 농도는 지수함수적으로 증가하고, 기질인 갈락토즈는 이에 반하여 감소함을 알 수 있다.
- 접종 다음 단계로 전배 양을 수행하였으며 삼각 플라스크에 YPD배지(yeast extract 10g/L, peptone 20 g/L, glucose 20 g/L)의 혼합액 100 mL를 담아 접종액 5 mL를 넣어 같은 조건으로 24시간 배양하였다. 본 발효에서 배지(YPG)는 전배양액과의 합이 1.5L가 되도록 만들어졌으며 이때의 농도는 yeast extract 1%, peptone 2%, galactose 4%가 되도록 하였다. 발효 조건은 온도 30°C, pH 5.
- 본 연구에서는 PLS모델 구현을 위해 PLS_Toolbox (ver 2.0, Eigenvector Research, USA) 및 Matlab(ver 5.3, Mathwork, USA)을 사용하였으며, 검량 표준오차(Standard Error of Calibration, SEC), 결정 계수( 7기) 및 예측 표준 오차(Standard Error of Prediction, SEPX 통해 개발된 모델의 정밀도와 예측 성능을 평가하였다.
- 시료 채취에 있어 수동적인 방법으로는 발효조에 연결된 주사기를 통해 시료를 채취하였고 발효 실험의 끝부분에서 정량펌프를 이용하여 반자동 방식으로 시료를 채취하였다. 스펙트럼 측정에 있어서는 발효공정 중 온라인(On-line) 상태에서의 시료의 스펙트럼 측정과 성분 예측 가능성을 규명하기 위하여 실시간으로 스펙트럼의 측정이 가능한 CDI SNIR103스펙트로미터 (Control Development, USA)를 사용하였으며, 냉동 보관된 시료의 스펙트럼은 CDI보다 분해능이 높은 서울대학교 NICEM에 설치되어 있는 NIRS6500(NIRS, USA)스펙트로미터를 사용하였다.
- 시료 채취에 있어 수동적인 방법으로는 발효조에 연결된 주사기를 통해 시료를 채취하였고 발효 실험의 끝부분에서 정량펌프를 이용하여 반자동 방식으로 시료를 채취하였다. 스펙트럼 측정에 있어서는 발효공정 중 온라인(On-line) 상태에서의 시료의 스펙트럼 측정과 성분 예측 가능성을 규명하기 위하여 실시간으로 스펙트럼의 측정이 가능한 CDI SNIR103스펙트로미터 (Control Development, USA)를 사용하였으며, 냉동 보관된 시료의 스펙트럼은 CDI보다 분해능이 높은 서울대학교 NICEM에 설치되어 있는 NIRS6500(NIRS, USA)스펙트로미터를 사용하였다.
- 실험의 여건상 채취한 샘플을 냉동보관 하였다가 동일한 조건에서 해동하여 분해능이 높은 NIRS6500분광기를 이용하여 스펙트럼을 측정하였다. 이 스펙트럼을 이용하여 갈락토즈의 농도를 예측하는 식을 500-1100 nm, 900〜1700 nm, 400〜2500 nm의 파장대별로 분리하여 개발하였다.
- 실험의 여건상 채취한 샘플을 냉동보관 하였다가 동일한 조건에서 해동하여 분해능이 높은 NIRS6500분광기를 이용하여 스펙트럼을 측정하였다. 이 스펙트럼을 이용하여 갈락토즈의 농도를 예측하는 식을 500-1100 nm, 900〜1700 nm, 400〜2500 nm의 파장대별로 분리하여 개발하였다. 이 때 각각의 SEP는 0.
대상 데이터
- 발효에 사용한 yeast균은 Saccharomyces cerevisiae M6HIR10C로서 김(2001)에 의해 재조합된 효모이다. 발효조는 스위스 Bioengineering사의 AG Fermenter System으로서 서울대학교 식품공학과 생물화학공학 실험실에 설치되어 있는 것을 사용하였다.
이론/모형
- 농도가 다른 혼합 수용액 배지 47개의 스펙트럼을 무작위로 반으로 나눈 다음, 절반은 검량식 (calibration equation) 개발에, 나머지는 검량식 검증용(validation)으로 사용하였다. 농도 예측 검량 식을 개발하기 위해 PLS회귀법을 사용하였고, 적정 factor의 수는 PRESS curve를 이용하여 육안 으로 결정하였다. 표1은 전처리 유무에 따른 검량식의 개발 및 검증결과를 보여주고 있다.
- 발효액의 당도는 DNS방법을 이용하여 측정하였다. 또한 발효액 속의 미생물 농도 측정에 있어서는 Ultrospec 2000(Pharmacia Biotech, USA)을 이용하여 미생물의 농도를 대표하는 흡광도(OD) 를 측정하였다.
성능/효과
- 2. 실제 발효과정 중에 시료를 채취하여 온라인(on-line) 측정이 가능한 CDI 스펙트로미터로 흡 광스펙트럼(파장범위: 900-1700 nm)을 측정한 결과, 각 파장에서의 흡광도는 미생물의 농도에 따 라 증가하였다. 이는 미생물이 증가함에 따라 산란이 증가하였기 때문으로 판단된다.
- 4. 결론적으로 실시간 측정이 가능한 CDI 스펙트로미터로 발효 중 갈락토즈 및 미생물의 농도변화를 온라인 모니터링할 수 있는 것으로 나타났으며 이를 토대로 유가식 배양에서 배양의 자동화가 가능할 것으로 추정된다. 당원(carbon source)으로 갈락토즈 한 종류만을 사용하였지만 나아가 복합당 및 당알코올 등의 물질을 사용하였을 때 이를 예측할 수 있는가에 대한 연구가 필요하다.
- 그림3에서 미생물의 농도는 지수함수적으로 증가하고, 기질인 갈락토즈는 이에 반하여 감소함을 알 수 있다. CDI스펙트로미터를 이용한 스펙트럼을 전처리 하여 개발한 모델을 보면 여러 가지 전처리 중에서 MSC 전처리를 수행한 경우에 결정계수( R2)와 SEP가 각각 0.959 및 0.2기로서 가장 우수하였다.
- 259%이었다. 범위에 따른 약간의 차이가 있었고 파장 범위를 900-1700 nm로 하였을 때 모델의 성능이 제일 좋았으며 전처리에 의한 효과가 두드러지게 나타나지는 않았다. 또한 냉동 전후의 스펙트럼 이상 여부를 조사한 결과 거의 변화가 없었다.
- 259%이었다. 범위에 따른 약간의 차이가 있었고 파장 범위를 900-1700 nm로 하였을 때 모델의 성능이 제일 좋았으며 전처리에 의한 효과가 두드러지게 나타나지는 않았다. 또한 냉동 전후의 스펙트럼 이상 여부를 조사한 결과 거의 변화가 없었다.
- 발효시작 후 35시간이 지난 다음에 갈락토.스의 소진으로 더 이상의 미생물의 성장이 없다고 판단되어 주사기와 큐벳 대신에 정량 펌프와 flow-cell을 이용하여 정상적인 스펙트럼이 측정됨을 확인하였다. 정량 펌프의 rpm을 변화시킬 때 약간의 맥동이 있었지만 곧 안정된 스펙트럼으 也였나.
- 표1은 전처리 유무에 따른 검량식의 개발 및 검증결과를 보여주고 있다. 이 결과에 의하면 산란보정과 관계되는 MSC 또는 SNV 전처리를 수행하는 것이 전처리를 하지 않는 경우보다 양호한 결과를 가져옴을 알 수 있다.
- 검량식 개발 방법은 갈락토즈 검량식 개발과 동일하다. 이 결과에 의하면 전처리 없이 개발된 모델에서 SEP=2.942로서 전체 OD범위(0〜42.6) 대비 6.9%이었다. MSC 전처리는 처리 결과와 상관없이 비슷한 값을 보였지만 다른 전처리들은 factor수가 크게 증가하였다.
- 이는 미생물이 증가함에 따라 산란이 증가하였기 때문으로 판단된다. 이들 스펙트 럼 데이터를 이용하여 갈락토즈의 농도와 OD(Optical Density)로 측정된 미생물의 농도를 예측하는 PLS회귀모델을 개발한 결과, 갈락토즈의 경우 R2와 SEP가 각각 0.952 및 0.297%(농도 대비7.4%)였으며, 0D의 경우 이들 값이 각각 0.962 및 2.942(전체 OD범위 대비 6.9%)로서 온라인 측정이 가능함을 알 수 있었다.
- 089이었다. 전체 갈락토즈의 농도 대비 최소 2.2%의 오차 범 위내에서 예측이 가능함을 알 수 있었다.
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