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문제 정의
- , 1993) 및 흉선 세포의 증식과 면역 증강 효과(Maeng et al, 1991) 등의 약리 작용이 있는 것으로 보고되어 있다. 이에 본 연구에서는 가시오가피와 더덕의 협동작용으로 효과를 높이고 발효유에 응용 가능성을 검토하기 위하여 농도별로 첨가한 발효유를 제조하여 면역 증강 효능을 가지고 복용에도 편리한 가시오가피 첨가 발효유를 개발할 목적으로 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 가시오가피와 더덕 추출물을 첨가한 발효유가 마우스의 면역 기능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 선발된 수컷 마우스를 대상으로 하여 발효유에 가시오가피와 더덕 열수 추출 건조물(가시오가피 : 더덕 = 8 : 2)을 혼합하여 투여한 그룹 lmg/mL(A), 3mg/mL(B), 9mg/mL(C)의 3그룹으로 나누어 임상 적용 경로인 경구 투여를 선택하여 발효유를 각각 3mL/kg씩 위내로 직접 투여하였다. 대조군은 발효유만 먹인 그룹(D)과 식염수만 먹인 그룹(E)을 두었다.
- 더덕 열수 추출 건조물(가시오가피 : 더덕 = 8 : 2)을 혼합하여 투여한 그룹lmg/mL(A), 3mg/mL(B), 9mg/mL(C)의 3그룹으로 나누어 임상적용 경로인 경구 투여를 선택하여 발효유를 각각 3mL/kg씩 위내로 직접 투여하였다. 대조군은 발효유만 먹인 그룹(D)과 식염수만 먹인 그룹(E)을 두었다. 시료 용량은 시판되고 있는 드링크 발효유 150mL/성인 체중 60kg을 1일 기준으로 결정하였다.
- 면역 활성 증진 효과를 알아보기 위하여 선발된 수컷 마우스를 대상으로 하여 발효유에 가시오가피와 더덕 열수 추출 건조물(가시오가피 : 더덕 = 8 : 2)을 혼합하여 투여한 그룹lmg/mL(A), 3mg/mL(B), 9mg/mL(C)의 3그룹으로 나누어 임상적용 경로인 경구 투여를 선택하여 발효유를 각각 3mL/kg씩 위내로 직접 투여하였다. 대조군은 발효유만 먹인 그룹(D)과 식염수만 먹인 그룹(E)을 두었다.
- ehter 마취후 채혈하고 안락사 시킨 다음 육안적으로 모든 장기를 검사하였다. 모든 시험 동물은 비장과 흉선을 포함하여 간장, 신장(좌우), 폐장, 심장, 고환(수컷:좌우) 등의 절대장기 중량 및 체중에 대한 상대 장기 중량을 측정하였다. 혈중 면역글로불린 검사는 채취한 혈액의 일부를 실온에 30분간 방치하여 응고 후 원심 분리 (3, 000rpm, 30min)하여 얻은 혈청에 대해서 albumin, globulin, total protein 치를 측정하였다.
- 발효유 제조는 원유 96.15%와 탈지 분유 3.85%를 첨가하고 65°C에서 배합하여 완전히 녹인후 90°C 에서 30분간 살균하고, 40°C 로 냉각시킨 다음 ABT - C (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilus로 구성 된 혼 합 균주 , Groupe Rhone-poulenc) 상업 균주를 0.2%(w/w)접종하고, 최종 pH 4.3으로 감소할 때까지 배양한 다음 가시오가피 건조 추출물을 첨가하여 발효유를 제조하였다. 실험에 사용된 동물은 한림실험동물에서 생후 35일령 평균 체중 20g인 SPF ICR 마우스 수컷 60마리를 임의로 12마리씩 5군으로 나누어 총 10주 동안 실험 식이를 급여하여 사육하였다.
- 5% SRBC 부유액을 혼합하여 37°C에서 1시간 방치한 다음 응집을 일으킨 혈청의 최고 희석도를 항체가로 판독하였다. 백혈구 백분율 계산은 wright' stain을 이용하였고 각각의 식이군에서 비장의 여포 변연부의 크기 및 배 중심의 형성 정도를 비교하기 위해 절제된 비장 조직을 10% formalin 용액에 1주 이상 충분히 고정시킨 후 모든 장조직은 파라핀 포매기(Leica, vaccum infiltration Processor)에 포매하여 초박절편기 (Microtom, Leica)로 2~3|im 절편을 만들어 Hematoxylin & Eosin stain으로 염색하여 광학현미경하에서 검경하였다.
- , 1983). 양적혈구(SRBC)에 대한 응집소가 측정(AGG test)은 microtitration tray의 각혈에 56°C에서 30분간 비동화 시킨 혈청에 동량의 0.5% SRBC 부유액을 혼합하여 37°C에서 1시간 방치한 다음 응집을 일으킨 혈청의 최고 희석도를 항체가로 판독하였다. 백혈구 백분율 계산은 wright' stain을 이용하였고 각각의 식이군에서 비장의 여포 변연부의 크기 및 배 중심의 형성 정도를 비교하기 위해 절제된 비장 조직을 10% formalin 용액에 1주 이상 충분히 고정시킨 후 모든 장조직은 파라핀 포매기(Leica, vaccum infiltration Processor)에 포매하여 초박절편기 (Microtom, Leica)로 2~3|im 절편을 만들어 Hematoxylin & Eosin stain으로 염색하여 광학현미경하에서 검경하였다.
- 혈중 면역글로불린 검사는 채취한 혈액의 일부를 실온에 30분간 방치하여 응고 후 원심 분리 (3, 000rpm, 30min)하여 얻은 혈청에 대해서 albumin, globulin, total protein 치를 측정하였다. 양적혈구에 대한 항체 생산세포 측정은 양적 혈구에 대한 Jern's plaque assay method를 다소 수정하여 실시하였다(Gilbert et al., 1983). 양적혈구(SRBC)에 대한 응집소가 측정(AGG test)은 microtitration tray의 각혈에 56°C에서 30분간 비동화 시킨 혈청에 동량의 0.
- 장기 중량 및 크기 측정은 시험 기간 중 폐사한 동물이나 시험 종료 후 모든 생존 동물에 대하여 ehter 마취후 채혈하고 안락사 시킨 다음 육안적으로 모든 장기를 검사하였다. 모든 시험 동물은 비장과 흉선을 포함하여 간장, 신장(좌우), 폐장, 심장, 고환(수컷:좌우) 등의 절대장기 중량 및 체중에 대한 상대 장기 중량을 측정하였다.
- 모든 시험 동물은 비장과 흉선을 포함하여 간장, 신장(좌우), 폐장, 심장, 고환(수컷:좌우) 등의 절대장기 중량 및 체중에 대한 상대 장기 중량을 측정하였다. 혈중 면역글로불린 검사는 채취한 혈액의 일부를 실온에 30분간 방치하여 응고 후 원심 분리 (3, 000rpm, 30min)하여 얻은 혈청에 대해서 albumin, globulin, total protein 치를 측정하였다. 양적혈구에 대한 항체 생산세포 측정은 양적 혈구에 대한 Jern's plaque assay method를 다소 수정하여 실시하였다(Gilbert et al.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 더덕과 가시오가피 줄기(북한산)는 서울 경동시장에서 구입하였고, 가시오가피(줄기)와 더덕은 각각 잘게 썰은 다음 가수량을 무게비 1 : 5의 비율로 넣고 100°C에서 2시간 동안 열탕 추출하였다. 추출액은 감압 농축 과정을 거쳐 동결 건조하였다.
- 대조군은 발효유만 먹인 그룹(D)과 식염수만 먹인 그룹(E)을 두었다. 시료 용량은 시판되고 있는 드링크 발효유 150mL/성인 체중 60kg을 1일 기준으로 결정하였다.
- 3으로 감소할 때까지 배양한 다음 가시오가피 건조 추출물을 첨가하여 발효유를 제조하였다. 실험에 사용된 동물은 한림실험동물에서 생후 35일령 평균 체중 20g인 SPF ICR 마우스 수컷 60마리를 임의로 12마리씩 5군으로 나누어 총 10주 동안 실험 식이를 급여하여 사육하였다.
데이터처리
- 실험결과는 SAS package를 이용하여 실험군당 Mean土SD로 표시하였고, 실험군간 통계적인 유의성은 Ltest로 검정하였다.
성능/효과
- 05)이 있었다. 모든 그룹에서 항체 생산 세포수는 10주령에서 7주령에 비하여 감소하는 경향을 보였다. 항원에 대한항체 생성량을 알아보기 위하여 혈구 응집 반응을 실시한 결과 가시오가피와 더덕을 급여한 군에서 대조군에 비하여 증가하는 경향을 보였고 7주령 A, C 군에서는 유의성 있는 차이를 보였으나 10주령에서는 C군에서만 유의성 있는 차이가 나타났다(P<0.
- 05). 비장 계수는 식이 지속 기간이 길어질수록 증가되었고, 흉선 계수는 B군에서유의성 있는 증가가 관찰되었다(p<0.05). 항체 생산 세포수는 가시오가피와 더덕을 급여한 군모두에서 대조군에 비해 증가하였으며, 특히 A, C군에서는 유의성(p<0.
- 비장 조직을 광학 현미경으로 관찰한 결과 실험 기간 중 C군에서 white Pup 가 가장 심하게 증식되어 활발한 면역 반응을 예상할 수 있었고 B군에서도 약간의 white pulp 증식 소견이 관찰 되었으며, B, C군에서는 종중심에서의 림프구의 유리가 관찰되었다(Fig. 4). 흉선 조직 검사에 서는 B그룹에서 육안적으로 심하게 종대된 마우스의 경우 림프 소절의 심한 종대가 관찰되었고 B, C 그룹에서는 림프 소절의 종대와 소절의 증대 소견이 관찰되었다(Fig.
- 생체내에서 면역반응에 주요한 역할을 하는 것으로 알려진 림프구는 B, C군이 대조군에 비해 증가하는결과를 보였다(Table 2).
- 대조군은 발효유만 먹인 그룹(D)과 식염수만 먹인 그룹(E)을 두었다. 실험 결과 모든 그룹에서 마우스의 증체량과 체중 증가는 유의성이 없었고, 7주와 10주령에 안락사 시킨 마우스의 각 장기인 간, 신장, 심장, 폐, 고환의 무게에서도 유의성이 없었다. 비장 계수는 7 주령에서는 B군에서 유의성 있는 차이를 보였고 10주령에는 C군에서 유의성 있는 증가가 관찰되었다(p<0.
- 실험 기간에 따른 체중 변화를 보면 동일 기간내에 실험군의 평균 체중은 유의성 있는 차이를보이지 않아 실험에 사용한 가시오가피와■더덕 함유 발효유가 마우스의 체중에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다.
- 실험 식이 마우스의 전반적인 면역 기능 상태를 확인하기 위하여 양적혈구 항원에 대한 적혈구 응집소가를 측정한 결과(Fig. 2) 실험식이 투여군인 A〜C군 모두 대조군에 비하여 높은 응집 소가를 보였고, 7주차에는 A, B, C군에서 유의성 있는 증가가 관찰되었다.
- 5). 한편, 폐조직과 심장 조직에서는 실험식이 급여군과 대조군에서 모두 정상적인 소견을 보였다. 간 조직 검사에서는 A군에서 약간의 공포 변성이 관찰되었고 이는 D와 E 그룹의 대조군 마우스에서도 동일한 소견이 관찰되어 실험에 사용된 식이와는 관계가 없었던 것으로 생각된다.
- 모든 그룹에서 항체 생산 세포수는 10주령에서 7주령에 비하여 감소하는 경향을 보였다. 항원에 대한항체 생성량을 알아보기 위하여 혈구 응집 반응을 실시한 결과 가시오가피와 더덕을 급여한 군에서 대조군에 비하여 증가하는 경향을 보였고 7주령 A, C 군에서는 유의성 있는 차이를 보였으나 10주령에서는 C군에서만 유의성 있는 차이가 나타났다(P<0.05).
- 05). 항체 생산 세포수는 가시오가피와 더덕을 급여한 군모두에서 대조군에 비해 증가하였으며, 특히 A, C군에서는 유의성(p<0.05)이 있었다. 모든 그룹에서 항체 생산 세포수는 10주령에서 7주령에 비하여 감소하는 경향을 보였다.
- 혈중 면역글로불린(IgG)의 수치는 7주에서는 B, C군에서 증가하였고 C군에서는 대조군에 비하여 유의성이 있었으며, A, B, C군 7, 10주령에서는 농도 의존적으로 증가하는 소견을 보여 가시오가피와 더덕의 함유가 면역 글로불린의 형성에도 도움을 주는 것으로 사료되었다(Fig. 3).
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