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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 더덕의 열수추출물에 대하여 in vitro 계에서 여러 종류의 림파구(splenocyte, lymph node, Peyer'spatch) 증식에 미치는 영향을 조사하고 아울러 더덕열수추출물에 대하여 마크로파지세포(RAW 264.7) 모델계에서 면역기능의 중요한 매개물질인 사이토카인 (TNF-a 및 IL-6) 생산유도 정도를 측정하여 면역증강효과를 파악하고, 이미 잘 알려진 인삼추출액(10)과 비피더스균(11)의 면역증강효과와 비교하고자 한다.
제안 방법
-
)으로 원하는 농도의 균수로 현탁하였다. Bifidobacterium의 생균수 측정은 Gas-Paks(BBL Micro biology Sy stems) 을 이용하여 37℃
에서 48시간 혐기적 배양을 하여 측정하였다. 동물세포배양 시료로 사용하기 위해 951에서 30분간 열처리 한 다음 -2℃에서 냉동보관하면서 사용하였다. - 다음으로 표준의 recombinant IL-6와 TNF-a 또는 배양상등액을 50 (iL/well 넣어 37℃에서 1시간 반응시키고, 다시 PBST로 4회 세척한 후, 2 ㎍/mL의농도로 희석한 biotinylated rat anti-mouse IL-6 또는 TNF-a항체를 50 μL넣어 상온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 6회 세척한 plate에 1.5 ㎍/mL 농도의 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate(Sigma Chemical Co.)를 50 pL/well 넣어 상온에서 한시간 반응시키고, 8회 세척 후 결합한 peroxidase conjugate의 양을 0.1 M citric-phosphate buffer(pH 5.5)와 0.4 mM tetramethylbenzidine(Sigma Chemical Co.)을포함하는 기질용액 100μL를 넣어 측정하였다. 최종적으로 동량의 6 N H2SO4를 넣어 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 2)로 3회 세척하여 여분의 항체를 제거한 다음, 비특이적 결합을 방지하기 위하여, 3%(w/v) BSA용액 300(1L를 넣어 37℃30분간 반응시키고 PBST로 3회 세척하였다. 다음으로 표준의 recombinant IL-6와 TNF-a 또는 배양상등액을 50 (iL/well 넣어 37℃에서 1시간 반응시키고, 다시 PBST로 4회 세척한 후, 2 ㎍/mL의농도로 희석한 biotinylated rat anti-mouse IL-6 또는 TNF-a항체를 50 μL넣어 상온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 6회 세척한 plate에 1.
- 9배의 증식효과를 나타냈다. 더덕열수추출물은 또한 RAW 264.7 세포주에 의한 TNF-a나 IL-6 같은 사이토카인 생산을 자극하였다. RAW 264.
- 더덕열수추출물의 면역증강효과를 조사하였다. 더덕열수추출물을 1에서 25 ng/mL 의 농도로 첨가했을 때 BSAS.
- )는 1, 2, 4 ㎍/mL의 농도로 첨가하였다. 또한 림파구 증식 효과가 알려진 B. adoles centis M101-4 균주는 106, 107, 108 cells/mL의 농도로 첨가하여 세포 증식 자극정도를 비교하였다. 세포의 증식은 Mosmann(12)에 의한 MTT assay를 변형하여 측정하였다.
- 면역하지 않은 정상 마우스(BALB/c, 웅성, 8주령)로부터 비장 및 Peyer's patch를 분리하여 림파절 세포와 동일한 방법으로 세포 분산액을 조제하였다. 이때 Peyer's patch의 분리는 Suzuki 등에 의한 방법(13)을 사용하였다.
- )을 면역하고 2주 후에 마우스를 해부하여 생성된 림파절을 분리하였다. 분리된 림파절을 슬라이드글라스로 파쇄한 다음, 10%(v/v)의 fetal bovine serum (FBS; Gibco Laboratories)과 50 ㎛의 2-mercaptoethanol을 함유한 RPMI 1640 배지 (Sigma Chemical Co)로 세포 분산액을 만들고 trypan blue로 염색하여 viable cell의 농도를 측정하였다. 4×105 cells/well 농도의 림파구와 일정 농도(1, 5, 25)㎍/mL)의 더덕열수추출물 또는 인삼열수추출물을 96-well plate(Costar)에 넣어 37℃, 5% CO2 조건하에서 72시간 배양하였다.
- 비장 세포 및 Peyer's patch 세포에 대해서도 림파절 세포와 동일한 방법으로 세포증식을 비교하여 보았다. Fig.
- 상등액 중의 사이토카인은 Dong 등(14)에 의한 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, 0.
- adoles centis M101-4 균주는 106, 107, 108 cells/mL의 농도로 첨가하여 세포 증식 자극정도를 비교하였다. 세포의 증식은 Mosmann(12)에 의한 MTT assay를 변형하여 측정하였다. 즉, 림파구 및 각 시료와의 72시간 배양 후 lO^L의 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT; Sigma Chemical Co.
- ) 용액 (5mg/mL PBS)을 넣고 6시간 더 배양한 다음 100|iL의 isopropanol을 첨가하였다. 용액의 흡광도는 microplate spectrophotometer(Spectra Max 340PC; Molecular Devices)를 이용하여 570nm에서 측정하였다.
- adoles centis M101-4 균주를 48-well plate에 넣은 후 5% CO2 조건하에서 37℃에서 48시간 배양하였다. 이때 1 ㎍/mL 의 LPS 첨가군과 무첨가군으로 나누어 실험하였다. 배양 후 상등액을 원심분리에 의해 회수하고, 사이토카인 정량을 위해 -20℃에 보관하면서 사용하였다.
- 4×105 cells/well 농도의 림파구와 일정 농도(1, 5, 25)㎍/mL)의 더덕열수추출물 또는 인삼열수추출물을 96-well plate(Costar)에 넣어 37℃, 5% CO2 조건하에서 72시간 배양하였다. 이때 B 세포 마이토젠인 lipopolysaccharide(LPS; Sal monella typhymurium 유래, Sigma Chemical Co.)는 0.1, 1, 10㎍/mL의 농도로, T 세포 마이토젠인 Concanavalin A(Con A; Type IV, Sigma Chemical Co.)는 1, 2, 4 ㎍/mL의 농도로 첨가하였다. 또한 림파구 증식 효과가 알려진 B.
- 더덕 및 인삼은 세척 후 박피하지 않은 상태의 청결한 것을 이용하였다. 추출 효율의 증대를 위해 절편 형태로 절단하고, 시료:물의 비율을 1:40으로 하여 95~100℃에서 2시간 동안 열수 추출한 다음, 감압여과하여 잔사를 제거한 후 청징된 추출액을 얻었다. 동물세포배양 시료로 사용하기 위해 각 추출물을 회전농축기(Eyela)로 농축하고, 고형분 함량을 측정한 다음 -20℃에 보관하면서 사용하였다.
대상 데이터
- B. adolescentis M101-4는 Japan Bifidus Foundation으로부터 구입하여 37℃에서 5% lactose가 함유된 MSR 배지 (Difco Laboratories)로 계대배양 및 본배양을 하였다. B.
- RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection으로부터 구입하였다. l%(v/v) NCTC 135 배지, 10% FBS, 50 ㎛ 2-mercaptoethanol, 1 mM sodium pyruvate, 100 U/ mL penicillin 및 l00㎍/mL streptomycin 을 함유한 RPMI 1640 배지에 계대배양한 다음, 5×105 cells/mL의 세포와 일정 농도의 더덕 열수추출물, 인삼열수추출물 또는 B.
- 더덕은 경북 안동 천지영농조합에서 가을에 수확한 2년근을 구입하였고, 비교군으로서 인삼은 경북 풍기에서 재배된 6년근 수삼을 구입하여 약 0~5℃에서 저장하면서, 2개월 이내에 사용하였다. 더덕 및 인삼은 세척 후 박피하지 않은 상태의 청결한 것을 이용하였다.
- 마우스는 (주)대한동물실험센터로부터 8주령의 웅성 BALB/c를 구입하여 동물실에 도착 후 1주간 환경에 적응시킨 후 처리 당 3마리를 실험에 사용하였다. 마우스의 뒷발바닥과꼬리의 피하에 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.
데이터처리
- 본 실험에서의 통계처리는 3회 반복 실험한 결과의 평균치±표준오차로 나타내었고 유의성 검정은 student t-test 또는 Duncaa's multiple range test로 하였다.
이론/모형
- 최종적으로 동량의 6 N H2SO4를 넣어 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Cytokine의 생산량은 Softmax curve fitting program(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)을 이용하여 표준곡선으로부터 산출하였다.
- 더 덕열수추출물, 인삼열수추출물 및 비 피더스균에 대 하여 마크로파지세포(RAW 264.7) 모델계에서 면역 기능의 중요한 매개물질인 사이토카인 생산 유도 정도를 ELISA 방법에 의해 측정하였다. Table 1에 나타낸 바와 같이 1 ㎍/mL의 LPS 로 미리 자극된 마크로파지에 대해서는 TNF-a 생산을 촉진하지 않았으나, LPS를 첨가하지 않은 마크로파지에 대해서는 더덕열수추출물을 Hig/mL 첨가 시 대조구에 비해 12.
- adolescentis M101-4 균주를 96-well plate에 넣어 3TC, 5% CO2 조건하에서 48시간 배양하였다. 이때 LPS와 Con A를 사용하여 증식 자극 정도를 비교하였으며, 세포의 증식은 MTT assay로 측정하였다.
- 세포 분산액을 조제하였다. 이때 Peyer's patch의 분리는 Suzuki 등에 의한 방법(13)을 사용하였다. 5×105 cells/ well 농도의 비장세포 또는 Peyer's patch 세포와 일정 농도의 더 덕열수추출물, 인삼열수추출물 또는 B.
성능/효과
- 2배의 증식효과가 나타났으며, 추출물의 첨가농도가 증가함에 따라 증가하였다. B 세포의 마이토젠인 LPS는 물론, T 세포 마이토젠인 Con A는 낮은 농도에서도 세포증식효과가 큰 것으로 나타났으며, 이는 림파절에 포함된 B 세포는 물론 면역된 항원(BSA)에 대한 T 세포의 증식이 이루어진 것으로 추정된다. 더덕열수추출물은 Con A나 LPS와 같은 마이토젠에 비해서는 그 효과가 약했으나 인삼열수추출물보다는 증식효과가 높은 것으로 나타났으며, B.
- 동일한 방법으로 세포증식을 비교하여 보았다. Fig. 2 및 Fig. 3에 나타낸 바와 같이 비장세포의 splenocyte에 대해서는 더덕열수추출물을 ll ㎍/mL 첨가 시 무첨가 대조군에 비해 4.2배 , 5 ㎍/mL에서는 7.3배 , 25 ㎍/mL에서는 13.8배의 증식효과가 나타났으며, Peyer's patch 세포에 대해서는 1 ㎍/mL 첨가 시 3.1 배, 5㎍/mL 에서는 4.4배, 25㎍/mL에서는 6.9배의 증식효과가 나타났다. 더덕열수추출물은 이들 림파세포에 대해 농도 의존적인 세포의 증식을 보였고, Con A나 LPS 와 같은 마이토젠에 비해서는 그 효과가 약했으나 인삼열수추출물보다는 증식효과가 약간 높은 것으로 나타났다.
- B 세포의 마이토젠인 LPS는 물론, T 세포 마이토젠인 Con A는 낮은 농도에서도 세포증식효과가 큰 것으로 나타났으며, 이는 림파절에 포함된 B 세포는 물론 면역된 항원(BSA)에 대한 T 세포의 증식이 이루어진 것으로 추정된다. 더덕열수추출물은 Con A나 LPS와 같은 마이토젠에 비해서는 그 효과가 약했으나 인삼열수추출물보다는 증식효과가 높은 것으로 나타났으며, B. adolescetis에 비해서는 열처리한 사균체를 첨가하였으므로 동일 농도에서의 비교는 어려웠으나, 25 ㎍/mL의 더덕열수추출물 첨가 시, 108 cells/mL의 비피더스균체를 첨가한 것과 유사한 정도의 증식효과를 나타내었다.
- 9배의 증식효과가 나타났다. 더덕열수추출물은 이들 림파세포에 대해 농도 의존적인 세포의 증식을 보였고, Con A나 LPS 와 같은 마이토젠에 비해서는 그 효과가 약했으나 인삼열수추출물보다는 증식효과가 약간 높은 것으로 나타났다. 또한 기존의 면역증강효과가 있는 비피더스균과는 유사한 결과를 나타내었다.
- 2배의 세포증식 효과를 나타냈다. 더덕열수추출물은 인삼열수추출물보다 증식효과가 높게 나타났으며, 면역증강효과가 알려진 B. adolescentis M101-4 와는 유사한 정도의 효과를 보였다. 비장 및 Peyer's patch 세포에 대해서는 1에서 25 ㎍/mL 의 더덕열수추출물을 첨가했을 때 각각 4.
- 1은 BSA로 면역한 마우스로부터 림파절을 분리하여 각 시료에 대한 세포증식을 비교한 것으로 결과는 무첨가군에 대한 증식 정도를 증식 배수로 산출한 것이다. 더덕열수추출물을 lug/mL 첨가 시 control에 비해 2.8배 , 5 ㎍/mL 에서는 4.8배, 25 ㎍/mL에서는 11.2배의 증식효과가 나타났으며, 추출물의 첨가농도가 증가함에 따라 증가하였다. B 세포의 마이토젠인 LPS는 물론, T 세포 마이토젠인 Con A는 낮은 농도에서도 세포증식효과가 큰 것으로 나타났으며, 이는 림파절에 포함된 B 세포는 물론 면역된 항원(BSA)에 대한 T 세포의 증식이 이루어진 것으로 추정된다.
- 7 세포를 lipopolysaccharides. 자극했을 경우, TNF-a 및 IL-6는 무첨가군에 비해 별다른 증진효과를 나타내지 않았으나, 자극하지 않은 RAW 264.7 세포에 대해서는 TNF-a는 12.6에서 67.8배, 11-6는 2.8에서 10.1 배 증가하였다. 이상의 결과로 더덕열수추출물을 이용하여 노화 및 질병에 따라 수반되는 면역력 감소를 방지하는 기능성식품 및 신소재로의 개발이 기대된다.
후속연구
- 또한 유산균의 세포벽성분 특히 peptidoglycan 분획과 같은 다당류에 항암작용 및 면역증강작용이 있음이 다수 등이 보고(17-18))되어 있으며, Yu와 shin(19)은 창출의 열수추출획분의 장관면역활성성분이 다당류일 것으로 추정하였다. 대부분 식물류의 열수추출물에는 lignin을 포함한 다량의 다당류를 포함하고 있으며, 더덕열수추출물에 대한 기존의 보고(7-8)를 볼때 면역증강작용을 나타내는 물질이 다당류일 것으로 추정되나, 추후 활성물질을 분리하여 그 구조와 기능의 상관관계를 밝히는 것이 필요할 것으로 사료된다.
- 5배 내지 4배 정도의 높은 수준으로 촉진되었으며, 인삼의 saponin, polysaccharide 성분등도 강한 세포증식 촉진효과를 발휘하였다고 보고되어 있다. 본 실험에서는 더덕열수추출물이 LPS와 증식패턴이 유사한 것으로 보아 B 세포에 특이적으로 작용하는 마이토젠으로 생각되나, 본 실험의 결과만으로는 세포증식의 target 세포가 어느 것인지 알 수 없으므로 이에 대해 추후 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 1 배 증가하였다. 이상의 결과로 더덕열수추출물을 이용하여 노화 및 질병에 따라 수반되는 면역력 감소를 방지하는 기능성식품 및 신소재로의 개발이 기대된다.
- 마크로파지가 생산하는 또 다른 사이토카인인 IL-6에 대하여는 TNF-a 보다는 다소 미약한 효과가 관찰되어 25|ig/mL 첨가 시 약 10배의 IL-6 생산을 촉진하였다(Table 2). 이상의 결과로부터 더덕열수추출물이 마크로파지를 직접 자극하여 사이토카인을 생산하게 하는 것으로 생각되며 추후 in vivo에서의 실험 및 물질의 분리가 진행되어야 할 것으로 사료된다. 면역증강물질에 대해서는 버섯류의 lentinan 및 schizophyllan 등이 알려져 있으며 B-glucan구조를 가진 이들 다당류는 생체방어계에 중요한 면역세포의 증식 분화 등을 촉진하여 항암제로 이용되고 있다(15-16).
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