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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 다항목측정 및 고집적어레이형 DNA칩의 개발을 위하여 생체재료의 새로운 고정화 방법을 제안하였다. 즉, 생체재료를 칩상에 직접 고정화 하는 것이 아니고 미소담체(particles)에 고정화한 후, 담체를 칩상에 고정화하는 2단계 고정화이다.
- 또한, 많은 분석을 동시에 할 수 있으며, 미소화에 의하여 시약이나 시료 소비량의 억제나 복합적 정보의 취득이 기대되고 있다. 본 연구는 이를 위한 미소담체의 제작, 배치의 친화력으로서 얇은 판 (plate)을 다이싱(dicing)하여 얻은 미소담체와 패턴화 소수성막을 갖는 기판과의 소수성상호작용을 이용한 방법과 그 결과에 대하여 기술 하겠다.
제안 방법
- cover glass의 미소가공에 대한 모식도를 그림 1에 나타내었다. 우선, cover glass 기판(0.13 0.16mm, 18mmxl8mm, Takahashi Giken, Glass Co.)이 표면은 초음파세척기 (W-222, Honda)를 이용하여 순수, 아세톤, 순수의 순서로 각각 30분간 세정하였다. 그리고, cover glass의 한쪽면은 스핀코팅기 (1H-D3, MIKASA)를 이용하여 500rpm에서 10초, 1,000 4, 0001에서 20초간으 로 회전하면서 (C4F9)3N 용제액으로 0.
- 그리고, 그 반대면에 텡스턴보트를 이용한 저항가열형의 소형진공중착장치 (SVC-700TURBO-TM, SANYUX 이용하여 크롬을 약 200 증착하고, 그 후 진공을 계속 유지하면서 금(X500L)을 약 2,000 중착하였다. 막두께는 수정진동자 (6MHz, PKG 10, LEYBOLD INFICON)를 이용한 막 두께 모니터(TM-200R, Maxtek)로 측정하고, 증착속도를 클롬의 경우는 0.5 1.0 /s으로, 금의 경우는 5.0 10.0 /s의 범위가 되도록 조절하였다. 진공도는 이온진공게이지 (ULVAC GI-TL3)로 측정하였고, lOeorr 이하를 유지하였다.
- 5mm/s의 속도로 순수를 뿌리면서 100 400ym의 크기로 잘라서 미소담체를 제작할 수 있었다. 그 후, 5분간 다이싱테이프에 UV조사하여 점착성을 UV조사전 19, 600mN/25mm (카탈로그값)에서 UV조사후 250mN/25mm로 약화시켜 담체가 점착성테이프에서 쉽게 떨어지도록 하였다. 이 공정에 의하여 1,000 8, 000개 정도의 미소담체를 제작할 수 있었다.
- 비오틴화 DNA의 고정량은 DNA 용액에 담구는 시간에 의하여 제어되었다. 이후, 3-4와 같은 방법으로 제작된 DNA칩 마이크로어레이에 완충액 중의 FITC 수식된 complementary DNA (cDNA)를 primary DNA와 30분간 반응시켜 결합(hybridization) 시키고, 형광현미경으로 반응을 확인하였다.
- 패턴칩의 제작에 대한 모식도를 그림 3에 나타내었다. 우선, 유리기판 (1.2 1.5mm, 76mmx26mm, S-1225, Matsunami Glass)을 다이아몬드커터로 3등분한 후, 표면은 초음파세정기를 이용하여 순수, 아세톤, 순수의 순서로 각각 30분간 세정하였다. 그리고, 유리기판이 형광을 가지고 있으므로, 크롬/금/크롬을 차례로 200 /2.
- 5mm, 76mmx26mm, S-1225, Matsunami Glass)을 다이아몬드커터로 3등분한 후, 표면은 초음파세정기를 이용하여 순수, 아세톤, 순수의 순서로 각각 30분간 세정하였다. 그리고, 유리기판이 형광을 가지고 있으므로, 크롬/금/크롬을 차례로 200 /2.000 /200의 두께로 증착하여 유리기판에 의한 형광의 영향을 방지하였다. 그리고, 유리기판의 한쪽면에 대하여 스핀코팅기를 이용하여 500rpm 에서 10초, 1,000 4, 000rpm에서 20초간, (C4F9)3N 용제액으로 9wt-%의 농도로 희석시킨 CPFP를 피펫으로 100UL 적하하여 0.
- 000 /200의 두께로 증착하여 유리기판에 의한 형광의 영향을 방지하였다. 그리고, 유리기판의 한쪽면에 대하여 스핀코팅기를 이용하여 500rpm 에서 10초, 1,000 4, 000rpm에서 20초간, (C4F9)3N 용제액으로 9wt-%의 농도로 희석시킨 CPFP를 피펫으로 100UL 적하하여 0.52.0um의 두께로 코팅함으로서 소수성으로 처리하였다. 다음에 115의 항온오븐중에 넣고 4시간 하드베이킹하였다.
- 다음에 115의 항온오븐중에 넣고 4시간 하드베이킹하였다. 이 위에 크롬과 금을 각각 약 200과 2,000으로 중착한 후, class 10의 클린룸에서 positive형의 포토레지 스트인 OFPR-800 을 7 8 방울 떨어뜨려 스핀코팅 (1H-DXⅡ, MIKASA) (lst:500rpm/10s, slope:10s, 2nd:4000rpm/20s, slope:5s) 하고, 오븐 (DK300, YAMATO SCIENFITIC) 중에서 pre-baking (80 , 30min) 하였다.
- 그리고, 마스크얼라이너 (MJB3 UV400, Karl Suss)를 이용하여 8초간 노광한 후, 현상액인 NMD-3에 30초간 담구어 현상하고, 초순수로 2번 세정하였다. 계속하여, 질소가스를 불어 건조시켰다.
- post-baking (80 , 30min) 한 후, 금에 칭액(요화칼륨 40g, 요소 10g, 물 400mD으로 금을 에칭하고, 현상액 세정과 동일한 과정으로 건조 시켰다. 다음으로, 아세톤 세정으로 포토레지스트를 제거 한 후, 현상액 세정과 동일한 과정으로 건조시켰다. 계속해서, 크롬에칭액(수산화나트륨 40g, 페린화칼륨 100g, 물 400mL)으로 크롬을 에칭하고, 현상액 세정과 동일한 과정으로 건조시켰다.
- 계속해서, 크롬에칭액(수산화나트륨 40g, 페린화칼륨 100g, 물 400mL)으로 크롬을 에칭하고, 현상액 세정과 동일한 과정으로 건조시켰다. 또한, 2시(/Torr 이하에서 산소플라즈마 (1SCCM, 500V, 이온류밀도 1.0mA/cm2 이하, RF power 100W) (EIS-200ER, ELIONIX)를 2분간 조사함으로서, CPFP를 에칭시켰다. 다시, 남아있는 크롬과 금을 모두 에칭시켰다.
- 생화학적으로 성질이 다른 생체재료를 고정화한 담체의 혼합물을 이용하여, 최종적으로 다종류의 생체 재료를 고밀도로 고정화한 DNA칩 마이크로어레 이를 얻을 수 있었다. 본 논문에서 제작한 DNA칩 마이크로어레이에 완충액 (pH7.9, 10mM Tris-IICl, 0.2M NaCl)중에서 그림 2의 마지막 부분과 같이 FITC수식한 cDNA를 적당한 농도로 60 , 64 및 78에서 30간 반 응시켜 이중나선을 결합시켰다. 이중나선 DNA가 결합되 었는가는 암실에서 FITC용 형광필터가 있는 형광현미경 (여기광 : 450 490nm, 흡수광 : 515 565nm, 분광 : 510nm) (LEICA MZ FLⅢ, Leica)으로 여기시키면 형광을 확인할 수 있으며, 형광의 밝기에 의하여 농도를 알 수 있다.
- 그림 4는 180배로 확대한 제작된 담체의 SEM (S-3500, HITACHI) 이미지로서, 다이싱머신으로 40011m의 크기로 잘라서 제작하였으며, 1, 300 4, 000개 정도를 제작할 수 있었다. 담체에 UV를 조사한 후, 그림 2와 같은 공정으로 티올 유도체 및 아비딘을 통하여 5'말단에 비오틴화 DNA를 수식하여 고정하였다.
- 무작위액중자기조직화법을 이용한 소수성상호작용에 의하여 패턴칩 (500 )상에 미소담체 (400 )를 고정하기 위하여, 샤레에 패턴칩을 고정하고 에탄올 90%, 순수 10%의 현탄액을 넣었다. 여기에 1,500 4, 000개 정도의 담체를 넣고 흔들면, 수면에 떠 있던 담체군이 중력 및 소수성상호작용에 의하여 그림 6과 같이 패턴칩의 소수성 부분에 고정된다.
- 본 논문에서는 후막용 CPFP를 이용하여 제작한 소수 성막을 갖는 패턴칩에, 다이싱에 의하여 얻은 미소담체 에 DNA를 고정화하고, 현탄액중에서 무작위액중자기조 직화법을 이용하여 소수성상호작용에 의하여 임의의 위 치에 배치할 수 있었다.
대상 데이터
- 의 것을 사용하였다. 3, 3' _dithiodipropionic acid는 PFALTZ&BAUER사의 것을 사용하였다. 기판 초음파세척용의 아세톤 (CH3CO CH3), NHS(Niydro xysuccinimide, C4H5 NO3), 아비딘 (Mw 67, 000, from white egg), Tris[2-Amino~2-hydroxy methylT, 3 - propanediol], HzNCXCHzOHk, 염화나트륨 (NaCl), 2아미 노에탄올 (H2NCH2CH2OH), 요화칼륨 (KI), 수산화나트륨 (NaOH), 페리시안화갈륨 (K3〔Fe (CN"])은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- 의 것을 사용하였다. EDC (1 - Ethyl -3-( 3 -dimethy laminopropy 1) carbodiimidehydrochloride, CsHhNeHCD 은 Tokyo &성 공업의 것을 사용하였다. 생체재료로서는 5'말단에 각각 비오틴 및 FITC (fluorescenceisothio cyanate)를 수식한 0.
- EDC (1 - Ethyl -3-( 3 -dimethy laminopropy 1) carbodiimidehydrochloride, CsHhNeHCD 은 Tokyo &성 공업의 것을 사용하였다. 생체재료로서는 5'말단에 각각 비오틴 및 FITC (fluorescenceisothio cyanate)를 수식한 0.2UM 스케일의 이중나선 DNA를 Nisshinb에 위탁합성 하여 사용하였다. 염기배열은 각각 5'-GAAAAAAAAT GACGTCATCCG-3, (A, Mw 6, 436.
- 후막용 positive 레지스트인 OFPR-800과 그 전용현상 액인 NMD-3238 (산업용)은 Tokyo Applied Chemistry 의 것을 사용하였다. 그리고, negative레지스트인 XP SU-8(50)와 전용현상액은 MicroChem Co.
- 의 것을 사용하였다. 요소(1)는 안전화학의 것을 사용하였다. 기판세 정용 용매로는 전자공업용 (Kanto Chemistry) 아세톤을, 기타 시약으로는 화학.
- 기판세 정용 용매로는 전자공업용 (Kanto Chemistry) 아세톤을, 기타 시약으로는 화학.생화학용특급 또는 그 상당품을 사용하였다. 물은 클린룸 프로세스에서는 초순수 (18.
- 계속해서, cover glass를 점착성의 다이싱테이프 (Adwill D-210, LINTEC) 에 붙인 후, 다이싱머신 (A-WD-10A, Tokyo Seimitsu)을 이용하여 다이아몬드 커터(52D-0.1T- 40H, Asahi Diamond)로 0.5mm/s의 속도로 순수를 뿌리면서 100 400ym의 크기로 잘라서 미소담체를 제작할 수 있었다. 그 후, 5분간 다이싱테이프에 UV조사하여 점착성을 UV조사전 19, 600mN/25mm (카탈로그값)에서 UV조사후 250mN/25mm로 약화시켜 담체가 점착성테이프에서 쉽게 떨어지도록 하였다.
- 그림 4는 180배로 확대한 제작된 담체의 SEM (S-3500, HITACHI) 이미지로서, 다이싱머신으로 40011m의 크기로 잘라서 제작하였으며, 1, 300 4, 000개 정도를 제작할 수 있었다. 담체에 UV를 조사한 후, 그림 2와 같은 공정으로 티올 유도체 및 아비딘을 통하여 5'말단에 비오틴화 DNA를 수식하여 고정하였다.
- 그림 4. 다이싱테이프에 붙이고 다이싱머신으로 40011 m의 크기로 자른 UV조사후의 담체.
이론/모형
- 즉, 생체재료를 칩상에 직접 고정화 하는 것이 아니고 미소담체(particles)에 고정화한 후, 담체를 칩상에 고정화하는 2단계 고정화이다. 제2단계고정 화법으로서는 번잡함을 경감하는 방법으로서 미소화된 담체군 (群)의 무작위액중자기조직화법 (random fluidic self-assembly method)에 의한 소수성상호작용 (hydro- phobic interaction)을 이용하였다. 이 방법에 의하면 고정화 재료 종류의 증가나 고정화 영역의 미소화에 대해서도 그 공정이 번잡하게 되지 않고, 생체재료에 변성이 발생하지 않고 고정화할 수 있을 것으로 기대된다.
성능/효과
- 현탁액에 화학.생화학적으로 성질이 다른 생체재료를 고정화한 담체의 혼합물을 이용하여, 최종적으로 다종류의 생체 재료를 고밀도로 고정화한 DNA칩 마이크로어레 이를 얻을 수 있었다. 본 논문에서 제작한 DNA칩 마이크로어레이에 완충액 (pH7.
- 생화학적으로 성질이 다른 생체재료를 고정화한 담체 혼합물을 이용하면, 최종적으로 그림 7 (a)와 같은 다종류의 생체재료를. 고밀도로 고정화 한 다항목측정 및 고집적마이크로어레이형 DNA침을 얻을 수 있었다
- 여기에 각종 FITC화 cDNA를 차례대로 결합시키고, 형광현미경으로 형광유무를 확인함으로서, 담체상의 DNA를 확인할 수 있다. 형광현미경으로 2분의 해상도로 본 담체의 형광결과를 그림 7 (b) (d)에 나타내었다.
- 그리고, 액체중에서 패턴칩과 담체와의 소수성상호작 용력은 기타 다른 작용력보다 우수하였으며, 다항목측정 용의 고집 적형 마이크로어 레이형 DNA침 으로서 응용 가능한 기술임을 알았다.
- 또한' 본 논문에서 나타낸 새로운 생체재료 고정화 방법은 배치 직후 어느 재료가 어디에 배치되어 있는가의 정보는 없으나, 생체재료 그 자체의 응답을 이용하여 캘리브레이션 등에 의하여 최종적인 위치를 확인하거나, 형광체의 종류, 담체의 크기 및 종류, 담체에 각인을 하는 등의 방법을 이용하면 해결할 수 있다. 한편, 보다 많은 담체를 배치, 고정화하기 위하여 안정한 패턴칩의 형상을 제작할 필요가 있음을 알았다.
후속연구
- 제2단계고정 화법으로서는 번잡함을 경감하는 방법으로서 미소화된 담체군 (群)의 무작위액중자기조직화법 (random fluidic self-assembly method)에 의한 소수성상호작용 (hydro- phobic interaction)을 이용하였다. 이 방법에 의하면 고정화 재료 종류의 증가나 고정화 영역의 미소화에 대해서도 그 공정이 번잡하게 되지 않고, 생체재료에 변성이 발생하지 않고 고정화할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 많은 분석을 동시에 할 수 있으며, 미소화에 의하여 시약이나 시료 소비량의 억제나 복합적 정보의 취득이 기대되고 있다.
- 또한, 투명하게 보이는 부분은 CPFP만의 부분으로서 소수성이며, 2, 600 67, 000 개 정도의 찬소수성 부분이 격자상 모양으로 되어 있다. 이 패턴칩은 담체군의 무작위 액중자기조직화법을 이용한 소수성상호작용의 응용이 가능할 것으로 생각된다.
- 마찬가지로, 그림 7 (c) 및 (d)에서 그림 7 (b) 이외의 담체에서도 원부분에서 형광을 볼 수 있었으며, 이곳에 B 및 A+B DNA가 고정되어 있음을 알 수 있다. 이 결과를 수만의 DNA종에 확대하면, 간단, 신속, 안정성 등이 뛰어난 다항목측정 및 고집적마 이크로어레이형 DNA침으로서 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 생체재료의 2단계고정화방법은 간단, 신속, 안정성 둥이 뛰어난 다항목측정 및 고집적마이크로어레이형 DNA 칩으로서 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 본 방법은 원리적으로 미소담체는 미세가공기술과의 정합성이 좋고, 보다 정밀한 가공을 하여 해결 가능한 문제일 것으로 생각된다.
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