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문제 정의
- 기존의 상업화된 바이오에탄올 생산 공정은 곡물을 원료로 사용하므로 식량부족, 국제곡물가격 상승 등의 문제를 유발하고 있으므로 이런 문제를 해결하기 위한 대안으로 목질계 바이오매스를 원료로 에탄올을 생산하고자 한다. 그러나 목질에탄올 생산을 위해서는 셀룰로오스와 결합되어 있는 리그닌을 효율적으로 제거하는 것이 관건으로, 기존의 백색부후균으로부터 분리한 리그닌 분해효소 유전자를 활용하여 형질전환체를 만들고 이로부터 리그닌 분해효소를 생산하는데 본 연구의 목적이 있다.
- 기존의 상업화된 바이오에탄올 생산 공정은 곡물을 원료로 사용하므로 식량부족, 국제곡물가격 상승 등의 문제를 유발하고 있으므로 이런 문제를 해결하기 위한 대안으로 목질계 바이오매스를 원료로 에탄올을 생산하고자 한다. 그러나 목질에탄올 생산을 위해서는 셀룰로오스와 결합되어 있는 리그닌을 효율적으로 제거하는 것이 관건으로, 기존의 백색부후균으로부터 분리한 리그닌 분해효소 유전자를 활용하여 형질전환체를 만들고 이로부터 리그닌 분해효소를 생산하는데 본 연구의 목적이 있다.
제안 방법
- 1×107개의 원형질체 현탁액 100 μl를 벡터 5 μg과 제한효소(30 U)를 혼합하고 polyethyleneglycol 4000(40%) 500 ㎕를 혼합한 후 실온에서 20분간 반응시켰다.
- 1단계로 pBARGPE 기본벡터에 구름버섯의 MnP 유전자를 삽입하여 gpd 프로모터에 의해 MnP가 과발현하는 6.8 kb 크기의 형질전환벡터 pBARTVMNP2를 제작하였다. 그리고 2단계로 형질전환벡터 pBARTVMNP2에 다시 아교버섯의 laccase gDNA를 삽입하여 MnP 유전자 및 laccase 유전자가 동시에 발현하는 10 kb 크기의 pMnP-gLac 벡터 제작하였다<그림 1>.
- PDA배지에서 10일 동안 균사를 배양 후 bisphenol A(BPA) 100 ppm 또는 nonylphenol(NP) 20 ppm을 첨가하여 배양하였다. 상등액을 HPLC(Waters 1525 binary pump)로 환경호르몬 잔존량을 조사하였다.
- laccase와 MnP 유전자를 동시 발현시키는 발현벡터는 pBARGPE1(5.5 kb) 벡터를 기초로 사용하여 구축하였다. pBARGPE1이 가진 gpd promoter를 이용하고자 이 프로모터 다음에 있는 제한효소 BamHI으로 vector를 digestion한 후 구름버섯 MnP cDNA 유전자(약 1.
- 5 kb) 벡터를 기초로 사용하여 구축하였다. pBARGPE1이 가진 gpd promoter를 이용하고자 이 프로모터 다음에 있는 제한효소 BamHI으로 vector를 digestion한 후 구름버섯 MnP cDNA 유전자(약 1.2 kb)에 BamHI linker를 연결하여 증폭하고 이를 잘린 벡터와 ligation하여 pBARTVMNP2(6.8 kb)를 제작하였다. 제작된 벡터에 다시 아교버섯 promoter + laccase genomic DNA(약 3.
- 리그닌 분해효소 유전자로 겨울우산버섯의 laccase 유전자, 아교버섯의 laccase 유전자, 겨울우산 버섯의 MnP 유전자, 그리고 구름버섯의 MnP 유전자를 P . pastoris 형질전환용 벡터(pPICZα)에 각각 삽입하여 4종의 리그닌 분해효소 발현용 벡터를 제작하여 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻었다. 효소활성을 조사한 결과 형질전환체가 야생형균주 보다 활성이 높으나 과발현시키는 벡터를 이용한 형질전환체 만을 고려해보면 전체적인 효소활성은 매우 낮다.
- zeocin 항생제가 첨가된 YPDS 고체 배지에서 자라난 colony를 5'AOX (5’-GACTGGTTCCAA TTGACAAGC-3')와 3'AOX(5'-GCAAATGGCATTTGACATCC-3'의 두 primer를 가지고 PCR(1 step, 1 cycle; 94℃ 2 min, 2 step, 35 cycles; 94℃, 1 min, 60℃, 1 min, 72℃, 2 min, 3 step, 1cycle; 72℃ 7 min)을 통해 형질전환을 확인하였다.
- 겨울우산버섯의 균사를 배양하여 멸균증류수로 세척 후 회수된 균을 20 ㎖ 씩 300 flask의 100㎖ SSC 배지와 멸균증류수에 각각 접종했다. 가스 멸균한 리그닌잔사 1 g을 균을 접종한 SSC배지와 멸균증류수에 첨가하여 28일 동안 25℃에서 2500 rpm으로 진탕 배양하면서 5일마다 효소활성을 측정하고 최종 배양액을 회수하여 0.5M NaOH를 처리하여 리그닌만 회수하고 GPCmax(Viscotek, USA)로 분자량 분석하였다.
- 겨울우산버섯에 의한 목질칩 분해 메카니즘을 이용하고자 겨울우산버섯의 균사를 소나무 및 백합나무 목질 칩에 첨가하여 배양액의 laccase 활성을 조사하였다. 겨울우산 버섯의 균사를 배양한 결과 배양기간이 길어질수록 무처리군에서는 laccase 활성이 증가하다가 감소하지만 목질 칩을 처리한 실험구에서는 겨울우산버섯의 laccase 활성이 40일까지 계속하여 증가하였다.
- 겨울우산버섯의 균사를 배양하여 멸균증류수로 세척 후 회수된 균을 20 ㎖ 씩 300 flask의 100㎖ SSC 배지와 멸균증류수에 각각 접종했다. 가스 멸균한 리그닌잔사 1 g을 균을 접종한 SSC배지와 멸균증류수에 첨가하여 28일 동안 25℃에서 2500 rpm으로 진탕 배양하면서 5일마다 효소활성을 측정하고 최종 배양액을 회수하여 0.
- 8 kb 크기의 형질전환벡터 pBARTVMNP2를 제작하였다. 그리고 2단계로 형질전환벡터 pBARTVMNP2에 다시 아교버섯의 laccase gDNA를 삽입하여 MnP 유전자 및 laccase 유전자가 동시에 발현하는 10 kb 크기의 pMnP-gLac 벡터 제작하였다<;그림 1>.
- 효소활성을 조사한 결과 형질전환체가 야생형균주 보다 활성이 높으나 과발현시키는 벡터를 이용한 형질전환체 만을 고려해보면 전체적인 효소활성은 매우 낮다. 따라서 낮은 효소활성을 더 높이기 위해 형질전환체 중 활성이 높은 구름버섯 MnP 유전자가 삽입된 형질전환체를 선별하여 다시 같은 벡터를 추가적으로 형질전환을 실시하여 multi-copy의 형질전환체를 선별하였다. 그 결과 단일 형질전환체(control)은 야생형균주보다 약 3배 증가 하였지만 다수의 MnP 유전자를 삽입시킨 multi-copy 형질전환체 2번과 6번의 경우 5배로 증가폭이 커졌으며 전반적으로 야생형 균주와 단일 형질전환체보다 높은 효소활성을 나타내었다<그림 4>.
- 상등액을 HPLC(Waters 1525 binary pump)로 환경호르몬 잔존량을 조사하였다. 또한 환경호르몬 분해산물의 에스트로겐 활성은 에스트로겐성 관련 유전자 발현을 확인할 수 있는 재조합 효모를 이용하여 yeast two hybrid system으로 측정하였다.
- PDA 고체배지에서 7일간 배양한 겨울우산버섯의 균사를 8 ㎜ 직경의 plug을 제조한 후 5개씩 300㎖ flask의 SSC 배지 100 ㎖에 접종하여 10일 동안 25℃에서 2500 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 후 10일 까지 배양액의 laccase 활성을 측정한 다음 miracloth에 싸서 가스 멸균한 소나무와 백합나무의 칩 1 g을 첨가하여 계속 배양 하면서 배양액의 laccase 활성을 조사하였다.
- PDA배지에서 10일 동안 균사를 배양 후 bisphenol A(BPA) 100 ppm 또는 nonylphenol(NP) 20 ppm을 첨가하여 배양하였다. 상등액을 HPLC(Waters 1525 binary pump)로 환경호르몬 잔존량을 조사하였다. 또한 환경호르몬 분해산물의 에스트로겐 활성은 에스트로겐성 관련 유전자 발현을 확인할 수 있는 재조합 효모를 이용하여 yeast two hybrid system으로 측정하였다.
- 아교버섯 균사를 100 ml의 CKMM 배지에 접종하고 28℃에서 5일간 진탕배양한 후 한 번 더 계대하고 24시간 배양한 균체에 1% Novozyme 234를 혼합, 30℃에서 60분간 처리하여 원형질체를 생성하였다. 1×107개의 원형질체 현탁액 100 μl를 벡터 5 μg과 제한효소(30 U)를 혼합하고 polyethyleneglycol 4000(40%) 500 ㎕를 혼합한 후 실온에서 20분간 반응시켰다.
- 아교버섯 형질전환체에 의한 환경호르몬 분해력을 조사 하기 위해 배양액에 bisphenol A(BPA) 및 nonylphenol(NP)를 넣고 배양한 후 HPLC로 분해된 환경호르몬 잔존량을 조사하였다. 그 결과 3종의 형질전환체 모두 환경호르몬 잔존량이 감소하는 것으로 나타났으며, 특히 TF1의 경우 NP를 넣고 5일간 배양한 결과 잔존량이 10%로 감소하였다<그림 3위>.
- 얼음에 5분간 방치한 후 Gene Pulser (Bio-Rad,Gene Pulser Xcell system)를 1.5kV, 25μF, 200Ω로 전기충격을 실행했다.
- 염료(RBBR, Methyl green)가 첨가된 PDA 고체배지에서 야생형 균사체와 형질전환 균사체를 배양시켜 배지가 탈색되는 정도를 비교하였고 PDA에 배양된 각 균사를 0.5 ㎠ 지름의 disc로 잘라서 SSC(solution of shallow stationary culture) 액체배지 5 ㎖에 넣어 25℃에서 진탕배양하면서 상등액 75 ㎕를 취하여 o-tolidine 용액을 넣고 590 nm에서 흡광도를 측정 laccase 활성을 조사하였다. 또한, MnP 활성은 2,6-dimethyloxyphenol를 이용하여 470 nm에서 측정하였다.
- 8 kb)를 제작하였다. 제작된 벡터에 다시 아교버섯 promoter + laccase genomic DNA(약 3.2 kb)를 삽입하고자 각각 forward와 reverse primer를 XhoI linker로 연결한 laccase genomic DNA의 primer를 사용하여 전체 유전자를 증폭하고 XhoI으로 자른 후 동일 효소로 자른 pBARTVMNP2 벡터에 삽입하여 pMnP-gLac(10 kb) 발현벡터를 구축하였다.
- 제작한 벡터를 제한효소인 PmeⅠ로 자른 후 기존에 만들었던 pPICαMnp4 형질전환체와 pPICα Lac1 형질전환체에 전기충격으로 형질전환하였다(1.5 kV, 25 μF, 200 Ω).
- 항생제 배지에서 선발된 형질전환체 균사로부터 genomic DNA를 분리하여 벡터에 특이적인 forward primer(5'-GTCGACAGAAGATGATATTG-3')와 reverse primer(5'-AGTTAGACAAC CTGAAGTCT-3')를 이용, PCR(1 step, 1cycle; 96℃, 5 min, 2 step, 25 cycle; 95℃, 1 min; 59℃, 2 min;72℃, 2 min, 3 step, 1cycle; 72°C, 5 min)를 수행하여 전기영동한 후 PCR 산물의 크기를 확인하였다.
- 형질전환체들을 항생제인 zeocin이 1000 μg/㎖ 들어간 YPDS agar 배지에서 colony가 뜰 때까지 배양하였고 벡터 제작과 같이 5‘AOX와 3’AOX primer로 확인하였다.
대상 데이터
- Pichia pastoris를 공시 균주로 사용하였다. P. pastoris의 야생형인 X-33를 YPD 고체 배지에서 배양 한 후 균의 colony를 5 ㎖의 YPD 액체 배지가 담긴 50 ㎖ tube에 접종하여 30℃에서 24시간 배양하였다.
- Pichia pastoris를 공시 균주로 사용하였다. P.
성능/효과
- MnP 및 laccase 유전자가 동시에 발현하는 아교버섯 형질전환체의 laccase 활성을 조사하기 위해 기질로 o-tolidine(o-Tolidine3,3’-Dimethylbenzidin)을 이용하여 효소활성을 측정한 결과 형질전환체 TF1이 5일째 야생형균주보다 활성이 50% 증가되었다.
- 겨울우산버섯에 의한 목질칩 분해 메카니즘을 이용하고자 겨울우산버섯의 균사를 소나무 및 백합나무 목질 칩에 첨가하여 배양액의 laccase 활성을 조사하였다. 겨울우산 버섯의 균사를 배양한 결과 배양기간이 길어질수록 무처리군에서는 laccase 활성이 증가하다가 감소하지만 목질 칩을 처리한 실험구에서는 겨울우산버섯의 laccase 활성이 40일까지 계속하여 증가하였다. 특히 침엽수인 소나무보다 활엽수인 백합나무에서 효소활성이 전체적으로 더 높게 나타났다<그림 5>.
- 겨울우산버섯의 균사를 초임계에 의한 목질의 당화에서 부산물로 생성된 리그닌 잔사를 증류수(DW)와 배지에 각각 첨가하여 배양 한 후 겨울우산버섯의 laccase 활성변화를 조사한 결과 증류수에서 배양 4일 후 잔사를 처리하지 않은 대조구(DW + 균)에 비해 6배 이상 laccase 활성이 증가되었고 배지에서는 리그닌 잔사 처리에 의해 7배 이상 증가하였다<;그림 6>. 그러나 배양 30일 후 분해산물의 분자량에는 큰 변화가 없었다.
- 아교버섯 형질전환체에 의한 환경호르몬 분해력을 조사 하기 위해 배양액에 bisphenol A(BPA) 및 nonylphenol(NP)를 넣고 배양한 후 HPLC로 분해된 환경호르몬 잔존량을 조사하였다. 그 결과 3종의 형질전환체 모두 환경호르몬 잔존량이 감소하는 것으로 나타났으며, 특히 TF1의 경우 NP를 넣고 5일간 배양한 결과 잔존량이 10%로 감소하였다<;그림 3위>. 또한 아교버섯 형질전환체를 BPA과 배양한 후 분해산물의 에스트로겐성을 측정한 결과 배양 5일째 에스트로겐성 활성이 40%로 감소하는 것으로 나타났다<그림 3, 아래>.
- 따라서 낮은 효소활성을 더 높이기 위해 형질전환체 중 활성이 높은 구름버섯 MnP 유전자가 삽입된 형질전환체를 선별하여 다시 같은 벡터를 추가적으로 형질전환을 실시하여 multi-copy의 형질전환체를 선별하였다. 그 결과 단일 형질전환체(control)은 야생형균주보다 약 3배 증가 하였지만 다수의 MnP 유전자를 삽입시킨 multi-copy 형질전환체 2번과 6번의 경우 5배로 증가폭이 커졌으며 전반적으로 야생형 균주와 단일 형질전환체보다 높은 효소활성을 나타내었다<;그림 4>.
- zeocin 항생제가 첨가된 YPDS 고체 배지에서 자라난 colony를 5'AOX (5’-GACTGGTTCCAA TTGACAAGC-3')와 3'AOX(5'-GCAAATGGCATTTGACATCC-3'의 두 primer를 가지고 PCR(1 step, 1 cycle; 94℃ 2 min, 2 step, 35 cycles; 94℃, 1 min, 60℃, 1 min, 72℃, 2 min, 3 step, 1cycle; 72℃ 7 min)을 통해 형질전환을 확인하였다. 그리고 확인되면 3 ㎖의 MM배지에 접종하여 30℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 24시간에서 48시간 배양하여 colony가 녹색으로 변하게 되는 것을 최종적으로 선별하였다.
- 그러나 음성 대조구로 사용된 아교버섯의 야생형 균주에서는 같은 위치에 PCR 산물이 나타나지 않았다. 따라서 형질전환체에 pMnP-gLac 벡터의 플라스미드가 균사체의 게놈 유전자 내로 성공적으로 삽입되었음을 알 수 있었다.
- 특히 침엽수인 소나무보다 활엽수인 백합나무에서 효소활성이 전체적으로 더 높게 나타났다<그림 5>. 또한 겨울우산버섯의 laccase 유전자(pblac1)의 발현을 증가시킨 겨울우산버섯 형질전환 체의 효소활성은 백합나무 칩 처리에 의한 활성이 야생형 균주보다 훨씬 증가되었다.
- 그 결과 3종의 형질전환체 모두 환경호르몬 잔존량이 감소하는 것으로 나타났으며, 특히 TF1의 경우 NP를 넣고 5일간 배양한 결과 잔존량이 10%로 감소하였다<그림 3위>. 또한 아교버섯 형질전환체를 BPA과 배양한 후 분해산물의 에스트로겐성을 측정한 결과 배양 5일째 에스트로겐성 활성이 40%로 감소하는 것으로 나타났다<;그림 3, 아래>. 이상의 결과 아교버섯 형질전환체가 야생형균주에 비해 환경호르몬을 잘 분해하는 것으로 사료되었다.
- MnP 및 laccase 유전자가 동시에 발현하는 아교버섯 형질전환체의 laccase 활성을 조사하기 위해 기질로 o-tolidine(o-Tolidine3,3’-Dimethylbenzidin)을 이용하여 효소활성을 측정한 결과 형질전환체 TF1이 5일째 야생형균주보다 활성이 50% 증가되었다<그림 2, 위>. 또한, MnP 활성을 조사하기 위해 기질로 DMP(2,6- Dimethyloxyphenol)를 이용하여 효소활성을 측정한 결과에서도 TF1이 5일째 야생형균주보다 활성이 100% 증가 되었다<;그림 2, 아래>. 이상의 결과 laccase 및 MnP 유전자가 동시에 발현하여 형질전환체의 리그닌 분해효소 활성이 증가된 것으로 판단되었다.
- 아교버섯을 형질전환용 벡터인 pMnP-gLac로 형질전환하여 PCR 했을 때 약 1.5 kb 크기의 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 그러나 음성 대조구로 사용된 아교버섯의 야생형 균주에서는 같은 위치에 PCR 산물이 나타나지 않았다.
- 또한, MnP 활성을 조사하기 위해 기질로 DMP(2,6- Dimethyloxyphenol)를 이용하여 효소활성을 측정한 결과에서도 TF1이 5일째 야생형균주보다 활성이 100% 증가 되었다<그림 2, 아래>. 이상의 결과 laccase 및 MnP 유전자가 동시에 발현하여 형질전환체의 리그닌 분해효소 활성이 증가된 것으로 판단되었다.
- 또한 아교버섯 형질전환체를 BPA과 배양한 후 분해산물의 에스트로겐성을 측정한 결과 배양 5일째 에스트로겐성 활성이 40%로 감소하는 것으로 나타났다<그림 3, 아래>. 이상의 결과 아교버섯 형질전환체가 야생형균주에 비해 환경호르몬을 잘 분해하는 것으로 사료되었다.
- 겨울우산 버섯의 균사를 배양한 결과 배양기간이 길어질수록 무처리군에서는 laccase 활성이 증가하다가 감소하지만 목질 칩을 처리한 실험구에서는 겨울우산버섯의 laccase 활성이 40일까지 계속하여 증가하였다. 특히 침엽수인 소나무보다 활엽수인 백합나무에서 효소활성이 전체적으로 더 높게 나타났다<;그림 5>. 또한 겨울우산버섯의 laccase 유전자(pblac1)의 발현을 증가시킨 겨울우산버섯 형질전환 체의 효소활성은 백합나무 칩 처리에 의한 활성이 야생형 균주보다 훨씬 증가되었다.
- pastoris 형질전환용 벡터(pPICZα)에 각각 삽입하여 4종의 리그닌 분해효소 발현용 벡터를 제작하여 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻었다. 효소활성을 조사한 결과 형질전환체가 야생형균주 보다 활성이 높으나 과발현시키는 벡터를 이용한 형질전환체 만을 고려해보면 전체적인 효소활성은 매우 낮다. 따라서 낮은 효소활성을 더 높이기 위해 형질전환체 중 활성이 높은 구름버섯 MnP 유전자가 삽입된 형질전환체를 선별하여 다시 같은 벡터를 추가적으로 형질전환을 실시하여 multi-copy의 형질전환체를 선별하였다.
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