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문제 정의
- 본 연구진은 딱총나무 줄기와 식물세포 덩어리인 캘러스를 가지고 항산화 효과를 측정하였으며, MTT assay를 통해 세포 독성 실험을 수행하고, PPARα 활성화 실험을 하였다. 또한 딱총나무 캘러스의 형태학적 변화를 관찰하여 탈분화된 세포들의 특성을 조사하고 연구하였다.
제안 방법
- 24시간 배양 후, DMEM(GIBCO,Cat#11995)로 세척하고, 딱총나무 캘러스와 마른 줄기 추출물 3mg/ml , Clofi brate(Cayman chemical, Cat#10005745) 200μM를 처리한다.
- DMEM배지로 세척, 1X로 준비된 Passive Lysis Buffer(promega, Part#E194A)100μl로 세포를 깬 후, 듀얼-루시퍼라아제 수용체 분석 시스템 킷(Dual-LuciferaseⓇReporter Assay System kit, Promega, USA)를 사용하여 사용자 지시서에 따라 샘플과 reference의 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)을 측정하였다.
- Human keratinocyte HaCaT cells을 24-well plate 에 37℃, 5% CO2에서 10% fetal bovine serum(GIB CO), 100IU/ml penicillin (GIBCO), 100μg streptom ycin를 포함하는 DMEM 배지(GIBCO,Cat; 11995)2.5×105cell/500μl로 24시간 배양한 다음, 세 종류의 재조합된 플라스미드 벡터들(PPRE-luc; 리간드 결합형의 PPAR α가 결합하여 활성화되는 PPRE (PPARs Response Element)를 프로모터로 가지고 뒤에 리포터로서 역할을 하는 반딧불이 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 지닌 것, PPAR-exp ;일반적인 배양 조건에서도 발현되는 universal promoter 뒤에 PPARα 유전자를 지닌 것, pRL-tk; reference로 사용될 universal promoter에 Renilla luciferase 유전자가 결합된 플라스미드)을 주입하여 형질전환(transfection)시켰다.
- 공기부양 생물반응기(air-lift bioreactor)로 Sambucus latipinna callus를 배양하였다. 여기서 사용한 액체 배지는 고체플레이트 배양과 마찬가지로, MS(Murashige and Skoog, 1962)배지에 3% sucrose, 0.
- 탈분화 캘러스는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양받은 넓은잎 딱총나무(Sambucus latipinna Nakai) 잎 유래 세포를 사용하였다. 그리고 넓은잎 딱총나무의 마른 줄기를 비교 실험군으로 하여 분석하였다.
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2.2 고체 배양
배양배지는 MS(Murashige and Skoog,1962)배지에 3% sucrose, 0.3% phytagel, 0.01% myoinositol(Duchfa, Prod.NO:10609.1000) 및 1-Naphtalene acetic acid(Duchefa, Prod.No:N0903.0025) 3mg/L를 첨가하고 pH를 5.8로 조절한 후, 121℃에서 15분간 고압으로 증기멸균한 뒤 직경 55mm 페트리디쉬에 분주하여 사용하였다. 캘러스는 3주 간격으로 계대 배양하여 유지시켰다.
- 본 연구에서는 조직배양을 통해 넓은잎 딱총나무의 분열하는 세포의 형태학적 특성을 관찰하였고, 항산화력 측정, 세포독성 검사, PPAR α 활성화 실험을 수행하여 생리활성을 검증하였다. 그 결과 넓은잎 딱총나무의 세포를 이용하여 물질생산을 한다면 화장품의 항노화 소재로써 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
- 본 연구진은 딱총나무 줄기와 식물세포 덩어리인 캘러스를 가지고 항산화 효과를 측정하였으며, MTT assay를 통해 세포 독성 실험을 수행하고, PPARα 활성화 실험을 하였다.
- 뿌리나 줄기 생장과 연관 있는 정단 분열조직(apical meristem)이나 형성층(cambium)같이 부피생장에 관여하는 측생분열조직(lateral meristem), 그리고 씨앗에 영양분을 공급하는 식물태좌(phytoplacenta) 등 다양한 식물 미분화세포인 캘러스(callus)를 유도할 수 있다[3]. 잘라낸 식물 절편체(explant)에 세포분열을 촉진시키는 영양소와 식물생장조절자를 처리하면 캘러스가 형성될 수 있으며, 본 연구에서는 넓은 잎 딱총나무 잎으로부터 유도된 캘러스를 이용하였다. 딱총나무 추출물을 가지고 항산화 효과를 검토한 연구가 있었으며[4], 딱총나무에서 분리된 phenol, lignan 화합물에 대하여 쥐의 조골세포에 대한 증식과 조골세포에 대한 alkaline phosphatase의 활성 실험이 보고되었다[5].
대상 데이터
- cell의 밀도로 배양한다. 배지는 10% fetal bovine serum(GIBCO), 100 IU/ml penicillin(GIBCO) and 100㎍ml, strepto mycin를 포함하는 DMEM medium(GIBCO, Cat#11995)를 사용한다. 1일간 5% CO2 습도, 37℃에서 배양한 뒤, 배지를 제거하고 sample 100μl과 DMEM me dium 900μl를 각 well에 넣어 1일간 배양한다.
- 공기부양 생물반응기(air-lift bioreactor)로 Sambucus latipinna callus를 배양하였다. 여기서 사용한 액체 배지는 고체플레이트 배양과 마찬가지로, MS(Murashige and Skoog, 1962)배지에 3% sucrose, 0.01% myoinositol(Duchefa, Prod.No: 10609.1000)및 1-Naphtalene acetic acid(Duchefa, Prod.No:N0903. 0025) 3mg/L를 첨가하고 pH를 5.8로 조절한 후,121℃에서 15분간 고압으로 증기 멸균하여 사용하였다.
- 탈분화 캘러스는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양받은 넓은잎 딱총나무(Sambucus latipinna Nakai) 잎 유래 세포를 사용하였다. 그리고 넓은잎 딱총나무의 마른 줄기를 비교 실험군으로 하여 분석하였다.
이론/모형
- 각 well의 DMEM배지를 제거하고 각 well에 DMSO(dimethylsulfoxide)를 100μl씩 추가하여 용해시킨다. Enzyme-Linked Immuno-sorbent Assay (ELISA) 방법으로 분광기(spectrophotometer)를 이용하여 570nm 파장에서 흡광도를 측정한다.
- 사용시약은 2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl(Sigma Chemicals Co.,St. Louis,Mo,USA)이며 준비된 농도별 추출물은 Brand-Williams의 DPPH method에 의하여 DPPH 자유 라디칼 소거활성을 측정한다. DPPH 자유 라디칼 소거활성은 다음과 같이 계산한다: DPPH 자유 라디칼 소거활성(%)=[(A0-A1)/A0] x 100, A0는 대조구의 흡광도이며, A1은 테스트한 실험구의 흡광도이다.
성능/효과
- DPPH assay에 의한 항산화능 측정결과, 딱총나무 캘러스 열수 추출물은 0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml 농도에서 3.0%, 10.7%, 32.3%이며, 딱총나무 캘러스 70% 에탄올 추출물의 경우는 0.03mg/ml, 0.3mg/ml농도에서 10.1%, 30.9%이다. 반면 식물체줄기 열수 추출물의 경우 0.
- Human keratinocyte HaCaT 세포주에 대해 넓은잎 딱총나무 캘러스와 줄기 추출물의 세포독성검사 결과를 나타내었다[그림4]. 캘러스 열수 추출물은 0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml의 시료 농도에서 120.7%, 114.8%, 109.5%의 세포 생존율을 보여주며, 식물체 줄기 열수 추출물보다 우수하다. 딱총나무 캘러스 70%에탄올 추출의 경우, 0.
후속연구
- 본 연구에서는 조직배양을 통해 넓은잎 딱총나무의 분열하는 세포의 형태학적 특성을 관찰하였고, 항산화력 측정, 세포독성 검사, PPAR α 활성화 실험을 수행하여 생리활성을 검증하였다. 그 결과 넓은잎 딱총나무의 세포를 이용하여 물질생산을 한다면 화장품의 항노화 소재로써 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
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